Androgênese em Astyanax altiparanae: ferramenta de reconstituição em peixes
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Data
2017-04-25
Autores
Santos, Matheus Pereira dos [UNESP]
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Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Resumo
A androgênese é um mecanismo de reprodução uniparental no qual a progênie possui material genético exclusivamente paterno. Essa forma de manipulação cromossômica pode ser utilizada como estratégia de reconstituição de espécies ameaçadas. O presente trabalho foi desenvolvido com o objetivo de estabelecer protocolos de indução à androgênese dispérmica na espécie Astyanax altiparanae, padronizando um pacote tecnológico de manipulação da espécie. Inicialmente, foi investigado se o tempo de estocagem dos oócitos (tempo 0 - controle, com 60 minutos pós extrusão (mpe), 120 mpe, 180 mpe e 240 mpe) afetava sua viabilidade em ser fertilizado e a sua ploidia. Os resultados apontam que uma estocagem superior a 60 minutos pós extrusão pode afetar a ploidia e causar reflexos sobre a viabilidade e sobrevivência, com 4,44% das amostras analisadas sendo triploides. Considerando essas informações, foi posteriormente estabelecido um meio de cultura para os oócitos após a extrusão (Ringer, Hanks e dPBS) e a faixa ideal de irradiação UV para inativar o material genético materno (30’, 60’, 90’ e 120’ segundos). A solução ideal para estocagem dos oócitos pós extrusão foi a de dPBS, por até 120 minutos, permitindo um largo intervalo para manipulação. Nesse tratamento, a taxa de eclosão foi de 92,08 ± 1,75%. A faixa de irradiação mais eficaz em inativar o material genético materno foi a de 90 mW/cm2, com 100% das amostras analisadas haploides. Com o estabelecimento deste protocolo, tornou-se possível os primeiros ensaios para indução à androgênese dispérmica. Foi estabelecido um protocolo de irradiação dos oócitos e fertilização com sêmen de Astyanax altiparanae, Astyanax fasciatus e Hyphessobrycon anisitsi albino, com remoção do córion dos oócitos com enzima pronase, para facilitar a fertilização por mais de um espermatozoide. 100% dos tratamentos que receberam radiação UV e não tiveram o córion removido com pronase foram haploides, apresentando anormalidades e malformações características da “Síndrome Haploide”. Os oócitos fertilizados com sêmen de Hyphessobrycon anisitsi albino que foram previamente irradiados e tiveram o córion removido com pronase apresentaram um percentual de eclosão de larvas normais de 7,90 ± 4,30%, diferindo significativamente do controle de oócitos frescos fertilizados com sêmen da espécie, que foi de 87,36 ± 12,26% (P = 0,08). Os tratamentos com irradiação, remoção do córion e fertilização com sêmen de Astyanax altiparanae e de Hyphessobrycon anisitsi albino apresentaram, respectivamente, 6,75% e 18,12% de embriões diploides, sinalizando uma alternativa para a produção de androgenéticos diploides em espécies neotropicais. Outra estratégia de indução à androgênese dispérmica foi a fertilização dos oócitos irradiados com sêmen fundido. Foi avaliada a viabilidade após fusão e a morfologia dos gametas por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). Após a análise, foram realizados cinco tratamentos baseados na dose inseminante para a espécie, para fertilização com sêmen fundido. O protocolo utilizado para fusão dispérmica apresentou 95,5% de viabilidade (células vivas). A microscopia eletrônica apontou a ocorrência de agregados de espermatozoides e fusão com células sem flagelo. O tratamento com sêmen fundido em menor concentração de dose inseminante apresentou percentual de fertilização de 39,08%, com eclosão de 40,06%. Destacou-se um percentual de eclosão de larvas normais de 34,13% nesse tratamento. Além disso, o tratamento também apresentou o maior índice de indivíduos diploides, com 33,33%. Os resultados apontam para um protocolo de indução à androgênese dispérmica na espécie, sugerindo que apesar da fertilização ser menor em tratamentos com dose inseminante reduzida, o percentual de indivíduos diploides é maior, devido à possibilidade de fertilização com mais espermatozoides fundidos. A reunião desses resultados representa um pacote inédito de manipulação cromossômica e reprodução uniparental em espécies nativas.
In this treatment, the hatching rate was 92.08 ± 1.75%. The most effective irradiation range to inactivate maternal genome was 90 mW / cm2, with 100% of analyzed samples as haploid. With the establishment of this protocol, the first trials for induction of dispermic androgenesis became feasible. A protocol of oocyte irradiation and fertilization with semen of Astyanax altiparanae, Astyanax fasciatus and albino Hyphessobrycon anisitsi, with removal of the chorion from oocytes with pronase, was established to facilitate fertilization by more than one spermatozoa. 100% of the UV treated oocytes and intact chorion were haploids, presenting abnormalities and malformations characteristic of the "Haploid Syndrome". Oocytes fertilized with albino Hyphessobrycon anisitsi semen that were previously irradiated and had the chorion removed with pronase had a normal hatch percentage of 7.90 ± 4.30%, differing significantly from the control of fresh oocytes fertilized with semen , which was 87.36 ± 12.26% (P = 0.08). The treatments with irradiation, removal of the chorion and fertilization with semen of Astyanax altiparanae and albino Hyphessobrycon anisitsi presented, respectively, 6.75% and 18.12% of diploid embryos, signaling an alternative for the production of androgenetic diploids in neotropical species. Another strategy of induction to the dispermic androgenesis was the fertilization of irradiated oocytes with fused sperm. The viability after fusion and the morphology of the gametes by Scanning Electron Microscopy (SEM) were evaluated. After the analysis, five treatments were performed based on the inseminating dose for the species, for fertilization with fused sperm. The protocol used for dispermic fusion had 95.5% viability (live cells). Electron microscopy pointed to the occurrence of sperm aggregates and fusion with cells without flagella. The treatment with fused soerm in lower concentration of inseminating dose showed a percentage of fertilization of 39.08%, with hatching of 40.06%. A percentage of normal larvae hatching of 34.13% in this treatment was obtained. In addition, the treatment also had the highest percentages of diploid individuals (33.33%). The results point to a protocol for the induction of dispermic androgenesis in the species, suggesting that although fertilization is lower in treatments with reduced insemination dose, the percentage of diploid individuals increased, due to the possibility of fertilization with more fused spermatozoa. The gathering of these results represents an innovative set of chromosome manipulation and uniparental reproduction in native species.
In this treatment, the hatching rate was 92.08 ± 1.75%. The most effective irradiation range to inactivate maternal genome was 90 mW / cm2, with 100% of analyzed samples as haploid. With the establishment of this protocol, the first trials for induction of dispermic androgenesis became feasible. A protocol of oocyte irradiation and fertilization with semen of Astyanax altiparanae, Astyanax fasciatus and albino Hyphessobrycon anisitsi, with removal of the chorion from oocytes with pronase, was established to facilitate fertilization by more than one spermatozoa. 100% of the UV treated oocytes and intact chorion were haploids, presenting abnormalities and malformations characteristic of the "Haploid Syndrome". Oocytes fertilized with albino Hyphessobrycon anisitsi semen that were previously irradiated and had the chorion removed with pronase had a normal hatch percentage of 7.90 ± 4.30%, differing significantly from the control of fresh oocytes fertilized with semen , which was 87.36 ± 12.26% (P = 0.08). The treatments with irradiation, removal of the chorion and fertilization with semen of Astyanax altiparanae and albino Hyphessobrycon anisitsi presented, respectively, 6.75% and 18.12% of diploid embryos, signaling an alternative for the production of androgenetic diploids in neotropical species. Another strategy of induction to the dispermic androgenesis was the fertilization of irradiated oocytes with fused sperm. The viability after fusion and the morphology of the gametes by Scanning Electron Microscopy (SEM) were evaluated. After the analysis, five treatments were performed based on the inseminating dose for the species, for fertilization with fused sperm. The protocol used for dispermic fusion had 95.5% viability (live cells). Electron microscopy pointed to the occurrence of sperm aggregates and fusion with cells without flagella. The treatment with fused soerm in lower concentration of inseminating dose showed a percentage of fertilization of 39.08%, with hatching of 40.06%. A percentage of normal larvae hatching of 34.13% in this treatment was obtained. In addition, the treatment also had the highest percentages of diploid individuals (33.33%). The results point to a protocol for the induction of dispermic androgenesis in the species, suggesting that although fertilization is lower in treatments with reduced insemination dose, the percentage of diploid individuals increased, due to the possibility of fertilization with more fused spermatozoa. The gathering of these results represents an innovative set of chromosome manipulation and uniparental reproduction in native species.
Descrição
Palavras-chave
Biotecnologia, Reprodução uniparental, Manipulação cromossômica, Morfologia