Teses - Biociências - IBILCE

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Influência da obesidade materna e do consumo de dieta hiperlipidica sobre a próstata de ratos senis
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-08-15) Scarpelli, Tatiane Pereira; Góes, Rejane Maira [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A dieta materna rica em lipídios (HFD) compromete a próstata da prole adulta, causando diversas alterações patológicas, mas não se tem conhecimento dos efeitos sobre a histofisiologia principalmente somado à dieta hiperlipídicas (HFD) até o envelhecimento. É necessário compreender se os efeitos já reconhecidos da exposição aos lipídios nas diferentes fases ontogenéticas permanecem, e se eles se agravam quando analisados na velhice da prole. Assim, o presente estudo investigou os efeitos prolongados e tardios do ambiente nutricional rico em lipídios (ANRL) nos diferentes períodos do desenvolvimento da próstata ventral e dorsolateral. Para isso, foram utilizados seis grupos de ratos Wistar (56 sem de idade; n=12 por grupo): alimentados com dieta balanceada (controle – C2, 3% de lipídeos) ou que foram expostos ao ANRL por meio de dieta hiperlipídica (20% de lipídeos) durante a gestação (G e G2), gestação e lactação (G e GL2), a partir do desmame (W e D), a partir da lactação (L e L2) e gestação por toda a vida (AL e GT). O ANRL na gestação e lactação foi garantido por meio da indução da obesidade materna através da alimentação HFD por 15 semanas. O ANRL aumentou o colesterol total e os níveis de triglicerídeos em todos os grupos e levou à resistência à insulina em GL/GL2, AL/GT e obesidade em L/L2. Os níveis séricos de testosterona diminuíram ~67% em GL/Gl2, ~146% em L/L2 e W/D e ~233% em AL/GT. A análise histológica e estereológica revelou um incremento do compartimento estromal e das fibras colágenas nas próstatas ventrais (PV) de todos os grupos ANRL, bem como as lesões degenerativas - vacuolização celular e concreções prostáticas. Na PV, o ANRL agravou a atrofia acinar em G, GL e L e em AL atingiu mais de 50% da área da próstata para a maioria dos animais. Os focos de neoplasia intraepitelial prostática (PIN) aumentaram na AL. Ainda na PV, a expressão tecidual do AR teve maior expressão no estroma para G e GL, mas não mudou no epitélio. Já a próstata dorsolateral, apresentou aumento do peso somente em GT, além de um aumento na densidade de células proliferativas. A histopatologia indicou aumento de NIPs e focos de infiltrados inflamatórios. Também houve aumento de células em descolamento em GT e a partir da lactação. A contagem de mastócitos mostrou aumento na próstata dorsolateral do grupo GT. A frequência de AR não se alterou no epitélio de nenhum grupo, contudo aumentou no compartimento estromal a partir do desmame. Nossos dados mostram que a exposição prolongada dos lipídios desde a gestação e por toda a vida pós-natal até a velhice, leva a modificações no metabolismo lipídico e de glicose, e potencializa as alterações comuns da idade na próstata diferentemente entre os lobos ventral e dorsolateral. De modo geral, a ANRL agrava as lesões degenerativas da idade, e aumenta os focos de NIPs, além do aumento da expressão de AR no estroma prostático. A presença de focos inflamatórios também ocorre mais acentuadamente na dorsolateral. Por fim, concluímos que, quando analisada mais tardiamente, a exposição prolongada ao ANRL promove um estado permanente de alterações metabólicas, hormonais e morfológicas, além do acúmulo de lesões histopatológicas que são associadas ao potencial desenvolvimento de câncer de próstata.
O papel da helicase mitocondrial Twinkle em tecidos muscular e nervoso de Drosophila melanogaster
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-11-10) Rodrigues, Ana Paula Campos; Oliveira, Marcos Túlio de [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Mutações no gene humano TWNK, responsável por codificar a helicase mitocondrial Twinkle, frequentemente causam doenças mitocondriais que afetam o sistema neurolocomotor de pacientes. No caso da Oftalmoplegia Progressiva Externa (PEO), a principal característica é o acúmulo de múltiplas deleções no DNA mitocondrial (DNAmt). Em tecidos altamente energéticos, tais como o nervoso e o muscular, deleções e/ou depleção no DNAmt podem afetar a função mitocondrial, uma vez que esse genoma codifica subunidades proteicas primordiais para a produção de ATP via fosforilação oxidativa. Neste trabalho, utilizamos Drosophila melanogaster como modelo para compreender o papel tecido-específico da Twinkle em neurônios e na musculatura de moscas adultas. Diferentemente da letalidade larval observada com a superexpressão ubíqua de Twinkle K388A, uma variante disfuncional incapaz de hidrolisar ATP, a superexpressão músculo-específica não alterou nenhum parâmetro de viabilidade dos adultos avaliados. A superexpressão neurônio-específica também não afetou o desenvolvimento de Drosophila, mas causou redução drástica na atividade locomotora e na longevidade de indivíduos adultos, bem como depleção severa no DNAmt. A superexpressão de Twinkle tipo selvagem (WT) nesses tecidos não alterou nenhum fenótipo analisado, mas foi capaz de aumentar o número de cópias do DNAmt cerca de 30%. Análises preliminares dos intermediários da replicação do DNAmt em células musculares e neuronais de D. melanogaster, sob superexpressão de Twinkle WT ou K388A, evidenciaram aumento de uma das pausas replicativas que ocorrem naturalmente no genoma mitocondrial associadas ao fator de terminação transcricional (DmTTF). Além disso, possíveis deleções relacionadas à superexpressão de Twinkle K388A e WT foram encontradas em miócitos, apesar de não haver efeitos negativos ao fenótipo ou ao número de cópias de DNAmt nessas moscas. Determinar os mecanismos de manutenção do DNAmt envolvendo Twinkle pode fornecer ideias sobre como regular suas funções para melhorar as condições de disfunção mitocondrial que acometem tecidos nervoso e muscular durante o envelhecimento e o desenvolvimento de doenças mitocondriais.
Análises de diversidade e estrutura genética para a conservação de tamanduás-bandeiras (Myrmecophaga tridactyla) no estado de São Paulo, Brasil
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-09-05) Sartori, Ricardo Quiterio; Castiglioni, Lilian [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O tamanduá-bandeira (Myrmecophaga tridactyla) tem ampla distribuição na região Neotropical e é encontrado em todos os biomas brasileiros, no entanto, é classificado como vulnerável pela IUCN em nível global, nacional e estadual. As ameaças à espécie são relacionadas à forte pressão antrópica e os efeitos da fragmentação ou perda de habitat podem ser avaliados a partir da diversidade genética e características da paisagem. O objetivo do trabalho foi avaliar a diversidade genética e a estrutura populacional da espécie no estado de São Paulo, utilizando os marcadores moleculares SRY, 16S, RAG2 e DRB, em conjunto com microssatélites (SSR). As amostras foram obtidas a partir de resgate e atendimentos em Hospital Veterinário, além de amostras cedidas de campanhas de capturas em Estação Ecológica, totalizando 41 indivíduos amostrados, por meio do Esquema de Amostragem Individual (ISS). Após a amplificação, genotipagem e sequenciamento de DNA, diferentes análises estatísticas foram realizadas em programas específicos. A análise do gene SRY permitiu a identificação precisa do sexo dos indivíduos, o 16S não apresentou polimorfismos, sendo altamente conservado na espécie. O RAG2 foi utilizado para inferir eventos históricos, apresentou quatro haplótipos e revelou baixa diversidade genética (diversidade nucleotídica=0,0039 e diversidade haplotípica=0,273). Por outro lado, o gene DRB foi utilizado para inferir eventos recentes devido à alta taxa de mutação, assim como os SSR. Os resultados do gene DRB indicaram alta diversidade genética, mesmo para um gene adaptativo, revelando a presença de 21 alelos SSCP distintos em 41 amostras. Os índices de diferenciação genética indicaram de baixa a moderada diferenciação genética entre todos os indivíduos do estado de São Paulo (Fst=0,0322) e alta diferenciação ao comparar apenas as duas populações geográficas em Estações Ecológicas (áreas protegidas), além de correlação entre a as distâncias genéticas e geográficas. Não há evidências de Isolamento por Distância e existem evidências de Isolamento por Barreira, tanto em relação ao Índice de Agregação Alélica (Rjave = 0,467216994; p= 0,026000000), e aos métodos de detecção de barreiras, que identificaram duas barreiras ao fluxo gênico na paisagem. Outros resultados de análise Bayesiana indicaram isolamento populacional e a presença de dois agrupamentos (clusters), corroborando os resultados dos SSR. Portanto, a abordagem genética combinada, utilizando marcadores de genes com diferentes taxas de mutação permitiu inferir a diversidade, dinâmica e as características históricas e recentes da população. A análise integrada permitiu inferir que as barreiras detectadas são recentes, causadas provavelmente pelas ações antrópicas. As populações são prioritárias para a conservação e as áreas protegidas servem de reduto para a espécie, mesmo em ambientes altamente antropizados. A proteção dessas populações pode ajudar na conservação de outras espécies e de seu habitat. Além disso, o modelo de estudo apresentado pode servir para ecologistas e conservacionistas como uma abordagem genética viável para auxiliar na conservação e pode ser aplicada a outras espécies e populações, especialmente em áreas fragmentadas. Estratégias de conservação para o tamanduá-bandeira que beneficiem outras espécies devem ser adotadas e os dados científicos, incluindo as informações genéticas, devem ser implementados em políticas públicas, em planos de manejo e para ações de conservação.
Infecção do endossimbionte Wolbachia em populações de Drosophila sturtevanti (Drosophilidae, grupo saltans, subgrupo sturtevanti): prevalência, efeito no valor adaptativo e aquisição da cepa
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-09-09) Roman, Bruna Emilia; Ravazzi, Lilian Madi [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Wolbachia é um gênero endossimbiótico de Alfaproteobactérias pertencentes à ordem Rickettsiales, que infecta cerca de 50% dos artrópodes e inúmeros nematoides. Muitas cepas causam manipulações reprodutivas em seus hospedeiros que favorecem a disseminação da infecção, como a incompatibilidade citoplasmática, morte dos machos, feminização e indução de paternogênese. A Wolbachia é transmitida principalmente verticalmente, da mãe para a prole, entretanto casos de transmissão horizontal, entre espécies, já foram relatados. Os hospedeiros, portanto, podem adquirir a Wolbachia por transmissão cladogênica, introgressiva ou ainda por transferência horizontal. O efeito da infecção e o modo de aquisição desse endossimbionte não foram muito bem estudados em muitos hospedeiros naturais. Dentre esses hospedeiros pouco estudados, se encontra a Drosophila sturtevanti, uma espécie neotropical, amplamente distribuída em domínios da Mata Atlântica e outros biomas. O presente trabalho buscou identificar a cepa de Wolbachia infectante de 14 populações de D. sturtevanti, avaliar a prevalência dessa infecção, analisar o efeito no valor adaptativo do hospedeiro e a indução de manipulação reprodutiva em cinco populações. Ainda, avaliar a forma de aquisição da wStv, por D. sturtevanti, e de outras cepas pertencentes ao supergrupo A, que infectam espécies do gênero Drosophila. A cepa wStv foi identificada como a única infectante nas populações de D. sturtevanti. A infecção apresentou taxas variáveis (0-70%) e prevalência média de 41%, significando que essa cepa não foi fixada nessas populações ainda. Foi observada uma ampla variação no efeito da Wolbachia no valor adaptativo das cinco populações de D. sturtevanti e também incompatibilidade citoplasmática parcial em duas populações. A variação da infecção observada, possivelmente corresponde ao background genético de cada população hospedeira. Foi observada também uma associação entre prevalência e efeito no valor adaptativo, as populações com maior prevalência apresentam mais efeitos benéficos e as com menor prevalência apresentam mais efeitos negativos. Esses resultados sugerem que a wStv esteja sendo mantida nas populações de D. sturtevanti devido aos efeitos benéficos e/ou neutros. Os nossos resultados ainda indicam que as aquisições de wStv, por D. sturtevanti, assim como as demais cepas pelas espécies do gênero Drosophila ocorreram por transmissão horizontal.
A influência do consumo de óleo de coco na próstata de Gerbilos de Mongólia durante o envelhecimento e seu impacto na hiperplasia prostática benigna
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-03-10) Guerra, Luiz Henrique Alves [UNESP]; Vilamaior, Patrícia Simone Leite [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A próstata é uma glândula altamente responsiva a alterações hormonais e consequentemente ao envelhecimento, uma vez que indivíduos idosos apresentam níveis diminuídos de andrógenos. Uma das respostas da próstata frente ao processo de envelhecimento é o desenvolvimento de hiperplasia prostática benigna (HPB). Essa patologia é altamente relacionada com aumento de inflamação e de estresse oxidativo e esses, por sua vez, aumentam durante o envelhecimento. O uso de terapias alternativas como tratamento para a HPB vem crescendo e tem demonstrado efeitos benéficos à próstata, sem os danosos efeitos colaterais das drogas sintéticas comumente utilizadas. Algumas propriedades do óleo de coco, como antioxidante e anti-inflamatória fazem dele um candidato para o tratamento alternativo de doenças prostáticas, e ainda esse óleo se mostrou capaz de interferir na HPB induzida por testosterona. Entretanto, até o momento, não havia nenhum estudo detalhado sobre o efeito do consumo do óleo de coco durante o envelhecimento e das respostas morfofisiológicas na próstata. Sendo assim, o presente trabalho avaliou os efeitos do consumo de óleo de coco durante o envelhecimento na morfologia prostática, bem como seus efeitos na HPB espontânea e sua relação com fatores intimamente associados a essa doença como o processo inflamatório e o estresse oxidativo. Para tal foram utilizados gerbilos machos adultos submetidos a três diferentes condições experimentais: animais que não receberam nenhum tratamento durante um ano (grupo IC), animais que receberam água (0,1ml), em dias alternados, durante um ano (grupo GC) e animais que receberam óleo de coco 0,1ml), em dias alternados, durante um ano (grupo CO) e as administrações foram via gavagem. Foram realizadas análises morfológicas, morfométricas, estereológicas, imuno-histoquímicas, sorológicas, da expressão de proteínas, citocinas e avaliação do estresse oxidativo na próstata ventral. Os resultados mostraram que a manipulação dos animais no procedimento de gavagem durante o envelhecimento agravaram as lesões prostáticas, aumentaram a expressão de receptores hormonais e aumentam a espessura e a proliferação de células do estroma muscular. Esse procedimento também interferiu na população de macrófagos e na expressão de citocinas pró-inflamatórias, metaloproteinases, além de aumentar o estresse oxidativo. Já o consumo de óleo de coco atenuou ou inibiu essas alterações relacionadas ao envelhecimento e intensificadas pelo procedimento de gavagem. Assim, o consumo de óleo de coco durante o envelhecimento resultou em efeitos favoráveis ao uso desse óleo como agente fitoterápico no tratamento de HPB.
Exaptação de elementos de transposição (TEs) em Drosophila mojavensis e viés de expressão de genes e TEs em gônadas de D. mojavensis e D. arizonae e seus híbridos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-12-17) Simão, Maryanna Cristiano [UNESP]; Carareto, Claudia Marcia Aparecida [UNESP]; Vieira, Cristina; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Elementos de transposição (TEs) são sequências repetitivas de DNA capazes de se mobilizar dentro e entre genomas que devido a essa habilidade, além de efeitos deletérios, podem trazer vantagens ao genoma hospedeiro, tais como o aumento do repertório proteico, ou influenciarem a regulação gênica. O material de estudo desta tese foi o genoma de Drosophila mojavensis, uma espécie cactofílica, nativa de regiões áridas e semiáridas, que utiliza como sítio de alimentação e reprodução um recurso menos rico que os utilizados pela maioria das espécies de Drosophila e, consequentemente, tal hábito deve estar relacionado a adaptações específicas. Como os TEs são fontes importantes de variação genética, particularmente em resposta ao estresse ambiental, como também podem fornecer matéria-prima para o surgimento de genes codificadores de proteínas (PCG) e de RNAs não codificantes (ncRNA), os quais podem assumir funções celulares importantes, um dos objetivos desta tese foi investigar a associação entre TEs e esses genes em espécies cactofílicas, como estratégia para ampliar nossa compreensão sobre a contribuição dos TEs para a evolução adaptativa. Além disso, mesmo sendo a maioria dos genes comuns aos genomas de machos e fêmeas, genes e TEs podem ser expressos diferencialmente entre testículos e ovários. A análise dos transcriptomas das gônadas torna possível investigar como ou se o viés de expressão de genes e de TEs afeta a reprodução de híbridos interespecíficos. A fim de entender melhor essas questões, foi estudado nesta tese o viés de expressão das gônadas de D. mojavensis e D. arizonae e de seus híbridos recíprocos. Neste estudo mostramos que o conteúdo de TEs representa 13,27% do genoma de D. mojavensis e que a proporção de genes que abrigam sequências de TEs dentro dos éxons é de 5,9%, e que a proporção de ordens de TEs dentro destes éxons difere daquela do genoma geral (LINEs: 78,8% > LTR: 18,5% > TIRs: 2,4% > Helitrons: 0,3%). Entre todas as inserções de TEs encontrados nos genes PCG e lncRNA, apenas 19 sequências apresentaram domínios proteicos preservados. Foram identificados vários genes candidatos à exaptação de TEs no genoma D. mojavensis e a maioria deles abrigam sítios de ligação ao DNA, particularmente domínios zinc-finger, destacando o papel dos TEs como fonte de novidades funcionais aos genomas, evidenciando que esta associação entre sítios específicos de ligação de DNA e TEs é recorrente e talvez uma das fontes principais de novidades genômicas. A maioria dos genes e TEs com viés de expressão estão presentes em ambas as espécies parentais, sendo que em testículos a expressão de genes e TEs é cerca de três vezes maior do que em ovários, destacando que a expressão entre as gônadas em Drosophila é conservada e característica do grupo. Contudo, existem diferenças específicas de genes com viés de expressão entre as espécies parentais e entre os híbridos, que podem ter um papel importante na reprodução. Além disso, as famílias de TEs superexpressas em testículos são mais diversas que os genes superexpressos, esse fato pode estar diretamente relacionado com a influência dos piRNAs na regulação, principalmente devido ao fato dos piRNAs presente nos híbridos ter um padrão diferente dos encontrados nas espécies parentais
Filogeografia comparada de Nasutitermes corniger, N. ephratae (Isoptera: Termitidae: Nasutitermitinae), Silvestritermes euamignathus e S. heyeri (Isoptera: Termitidae: Syntermitinae): efeitos da biogeografia neotropical nos padrões populacionais
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-02-24) Santos, Amanda de Faria [UNESP]; Morales, Adriana Coletto [UNESP]; Cancello, Eliana Marques; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A região Neotropical abriga uma das faunas de cupins mais ricas do mundo, onde estão descritas 615 espécies viventes, divididas em cinco famílias. Termitidae, a mais diversa, abrange 437 espécies neotropicais, incluindo os gêneros Nasutitermes e Silvestritermes. Nasutitermes corniger e N. ephratae (Termitidae: Nasutitermitinae), assim como os outros representantes da subfamília, são caracterizadas pela presença de um tubo frontal cônico, chamado de nasus, localizado na região anterior da cabeça dos soldados. Ambas são espécies neotropicais e de grande amplitude geográfica, com distribuições muito semelhantes. Silvestritermes euamignathus e S. heyeri, assim como os outros Syntermitinae, são caracterizadas pela presença de um grande poro no ápice do tubo frontal, localizado na região dorsal da cabeça de seus soldados, além de um par de mandíbulas fortes e funcionais. Essas espécies também apresentam ampla distribuição neotropical, habitando predominantemente áreas de vegetação aberta e florestas tropicais. Considerando as características de N. corniger, N. ephratae, S. euamignathus e S. heyeri, este trabalho teve como objetivo principal avaliar se essas espécies foram, ao longo do tempo, afetadas de forma semelhante pelos eventos históricos e biogeográficos que ocorreram na região Neotropical, resultando em padrões filogeográficos similares entre si. Para isso, foram utilizados os marcadores mitocondriais 16S rRNA e COII para a realização de análises genéticas, demográficas, filogenéticas e filogeográficas. Silvestritermes euamignathus e S. heyeri foram analisadas aqui como uma única unidade evolutiva, visto que os dados genéticos obtidos para essas espécies sustentam a hipótese de sinonímia entra elas. Os resultados também mostraram que N. corniger e N. ephratae apresentam grandes semelhanças em relação às suas histórias demográficas e rotas de dispersão. Os resultados gerados para Silvestritermes também evidenciaram semelhanças em relação aos padrões demográficos e filogeográficos observados para as espécies de Nasutitermes. Considerando as comparações feitas, foi possível inferir que os fatores históricos da biogeografia da região Neotropical levaram a padrões convergentes em Nasutitermes e Silvestritermes, mesmo diante de diferenças consistentes em relação aos seus aspectos biológicos.
Proteína anti-inflamatória Anexina A1 como alternativa terapêutica na uveíte autoimune experimental
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-03-03) Costa, Sara de Souza; Girol, Ana Paula; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A uveíte autoimune é uma importante inflamação ocular relacionada à perda visual. A proteína Anexina A1 (AnxA1) e seu peptídeo mimético, Ac2-26, foram pesquisados em diferentes condições oculares com perspectivas clínicas. Assim, investigamos, in vivo, os efeitos do Ac2-26 para prevenção e protocolos terapêuticos na uveíte autoimune experimental (EAU). Para induzir EAU, a proteína de ligação a retinoides interfotorreceptores bovina (IRBP) em adjuvante completo de Freund foi inoculada na pata direita de ratos Lewis. Adicionalmente, a toxina de Bordetella pertussis foi injetada intraperitonealmente (i.p.). Ac2-26 foi administrado diariamente (i.p.) seguindo os protocolos preventivos (a partir do dia 1) ou terapêuticos (a partir do dia 8). Ambos os tratamentos foram realizados até o dia 13 após a indução da EAU e a gravidade da EAU foi avaliada diariamente. A quantificação de leucócitos foi realizada em humor aquoso (AqH). As expressões de AnxA1, receptor de formil-peptídeo-2 (fpr2), ciclooxigenase-2 (COX-2) e quantificação de macrófagos (ED1) foram avaliados por imuno-histoquímica. Linfócitos CD4 e CD8, AnxA1 e fpr2 foram estudados por Western blotting. Interferon (IFN)-γ, fator de necrose tumoral (TNF)-α, interleucinas (IL-2, IL-4, IL-10, IL-17) e proteína quimioatraente de monócitos (MCP)-1 foram medidos em sobrenadante de macerado ocular. Clinicamente, os olhos dos ratos induzidos por EAU apresentaram características macroscópicas alteradas e, nos grupos tratados, os parâmetros normais foram restabelecidos. Leucócitos, predominantemente linfócitos, foram encontrados no grupo EAU não tratado, enquanto a redução de CD4, CD8 e ED1 ocorreu nos animais tratados. Além disso, Ac2-26 diminuiu a imunorreatividade de AnxA1, fpr2 e COX-2 em segmentos oculares e sobrenadantes. Além disso, níveis reduzidos de IL-2, IFN-γ e IL-10 foram detectados em grupos tratados com Ac2-26. Entre os tratamentos, a administração terapêutica foi mais eficaz. Os dados mostram os efeitos benéficos do Ac2-26 em EAU com potencial para aplicação terapêutica.
Avaliação das propriedades cicatrizantes do extrato de Garcinia brasiliensis e modulação da proteína Anexina A1 em modelo de lesão cutânea
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-03-04) Souza, Helena Ribeiro; Girol, Ana Paula [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O uso de plantas medicinais remonta à antiguidade. Com o advento da ciência moderna, vários compostos químicos dessas plantas foram identificados e suas aplicações e eficácias comprovadas. No entanto, existem muitas plantas medicinais usadas por populares em diversas partes do mundo ainda pouco investigadas. Dentre essas espécies, encontra-se a Garcinia brasiliensis, planta de porte arbóreo nativa da América do Sul, conhecida por suas propriedades anti-inflamatórias e antitumorais e estudada em algumas condições clínicas. Nesse trabalho, o objetivo foi identificar alguns compostos do metabolismo secundário da G. brasiliensis, testar a atividade antioxidante e citotoxicidade de soluções extrativas da planta, bem como, avaliar essas soluções em lesão cutânea ainda pouco explorada, em modelos in vivo e in vitro. Para isso, folhas de espécime da G. brasiliensis foram coletadas, secadas e trituradas para serem infundidas em etanol 70%. Após retirada do etanol dessa solução extrativa foi obtido o Extrato Puro (EP), do qual, por meio de fracionamento líquido-líquido, foram produzidas as Frações Acetato de Etila (FAE) e Hexânica (FH). EP, FAE e FH foram pesquisados para verificação da presença de terpenos, compostos fenólicos e alcaloides por meio de testes colorimétricos e cromatográficos (HPTLC), enquanto, a atividade antioxidante foi avaliada por meio da descoloração do radical livre DPPH. A citotoxicidade das amostras em diferentes concentrações foi analisada em teste de hemólise em solução glicosilada (5%) de sangue humano (4%) e em teste in vivo/in ovo da membrana corioalantoide de ovos de Gallus gallus fertilizados. Os resultados dessas análises indicaram a presença de compostos de interesse farmacológico no EP e FAE e baixa citotoxidade nessas amostras, que foram submetidas a teste de suas propriedades microbicidas contra Staphylococcus aureus. Embora somente EP tenha apresentado atividade microbicida em concentração maior que 50%, a presença de compostos metabolicamente ativos, alta capacidade antioxidante e baixa citotoxicidade da FAE foram importantes para seleção dessas duas soluções extrativas para o modelo de lesão cutânea. Desse modo, EP e FAE foram incorporadas em formulações, que após testes de estabilidade, foram testadas em feridas de 5 mm no dorso de ratos Wistar, infectadas ou não com S. aureus (25 µL 105). Após o tratamento tópico de 6 dias, EP e FAE demonstraram controlar o processo de formação de prurido, modularam a expressão da proteína Anexina A1, relacionada ao processo inflamatório, e reduziram a quantidade de células imunomarcadas para Gasdermina-D, relacionada ao processo de morte celular piroptótica, e aumentaram a expressão de MCP-1. Em conjunto, os dados mostram importante perfil anti-inflamatório bem como potencial terapêutico do EP e da FAE no processo de regeneração cutânea, inclusive em lesões infectadas.
Avaliação da ação de nanoemulsões vinculadas à terapia fotodinâmica em modelo de câncer de mama metastático murino 4T1
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-01-20) Cabral, Ágata Silva; Calmon, Marilia de Freitas; Taboga, Sebastião Roberto [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O câncer de mama constitui um grave problema de saúde pública, não só pela elevada incidência e mortalidade, como pelo tratamento muitas vezes ineficaz. Diferentes sistemas nanoestruturados vêm sendo implementados a fim de resolver limitações das estratégias terapêuticas convencionais e demonstram vantagens sobre outros sistemas de veiculação devido à sua estrutura em escala nanométrica com propriedades singulares, e suas aplicações podem se estender desde a entrega de fármacos até procedimentos clínicos envolvendo fotoprocessos, tais como a terapia fotodinâmica (TFD). As nanopartículas (entre elas as nanoemulsões) apresentam a capacidade de superar a maioria das limitações dos fotossensibilizadores clássicos, como melhoria da solubilidade, biodistribuição, farmacocinética, absorção e habilidade de direcionamento nas células-alvo, além da alta razão superfífice/volume possibilitando alta carga de drogas nestes sistemas. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi investigar a ação de nanoemulsões como sistemas de veiculação de um agente fotossensível (ftalocianina de cloro-alumínio – ClAlPc) e quimioterápico (doxorrubicina – DOX) em camundongos BALB/c (fêmeas de 6 a 8 semanas) inoculados com linhagem 4T1 (câncer de mama metastático) e tratados em associação à terapia fotodinâmica. Nossos resultados mostraram que o tratamento sinérgico na presença de irradiação a laser (NE-PcDoxo + TFD) ocasionou uma redução do câncer de mama induzido, diminuição da expressão de VEGF, aumento na expressão de Caspase-3, necrose tecidual e diminuição maciça de células proliferativas, conforme demonstrado pela imunocoloração de Ki67. Além disso, este tratamento associado induziu a superexpressão dos genes apoptóticos ABL1, CD70, CRADD, FASL e NME5 e redução na expressão dos genes alvo de drogas anticâncer CDK2, ERBB2, FIGF, IGF2, PARP4 e PGR. Tais resultados validam este tratamento como uma alternativa promissora para aprimorar as estratégias anticâncer aplicadas atualmente.
Análise de transcriptomas e metabolomas de Drosophila melanogaster expressando a oxidase alternativa mitocondrial
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-11-04) Camargo, André Ferreira de; Oliveira, Marcos Túlio de; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Apesar dos efeitos benéficos mostrados quando a oxidase alternativa mitocondrial (AOX) de Ciona intestinalis (Tunicata: Ascidiacea) é expressa xenotopicamente em modelos de mamíferos e de insetos, resultados prejudiciais importantes também foram relatados, levantando preocupações quanto à sua implantação como uma futura enzima terapêutica voltada a doenças mitocondriais humanas. Por causa de sua atividade de oxidase terminal não-bombeadora de prótons, AOX pode contornar o segmento do citocromo c da cadeia respiratória e aliviar a possível sobrecarga de elétrons que ocorre após disfunção da fosforilação oxidativa (OXPHOS), não contribuindo, porém, para a força próton-motriz necessária à síntese de ATP mitocondrial. Nosso laboratório mostrou anteriormente que moscas que expressam AOX apresentam uma queda dramática na viabilidade pupal quando cultivadas em uma dieta pobre em nutrientes (LN), indicando que AOX interfere no metabolismo normal do desenvolvimento. Aqui, aplicamos análises de transcriptômica e metabolômica para mostrar que a interação entre LN e a expressão ubíqua de AOX em altos níveis causa uma mudança funcional do sistema digestivo e uma alteração geral do metabolismo de aminoácidos em larvas. Estas também armazenam menos nutrientes, o que causa letalidade no final do estágio de pupa, com uma regulação negativa geral do metabolismo mitocondrial e uma clara assinatura que os indivíduos estão passando por inanição (starvation). Curiosamente, lactato desidrogenase, lactato e 2-hidroxiglutarato estão elevados em moscas AOX independentemente da dieta, apontando para um importante papel tanto desta enzima chave do metabolismo, quanto desses metabólitos, na regulação das mudanças fisiológicas induzidas pela função de AOX em larvas. Discutimos nossos resultados com base na disponibilidade de aminoácidos essenciais na LN e seus papéis no metabolismo do desenvolvimento de drosófila. Compreender como a AOX pode alterar as condições metabólicas normais em animais complexos e como contorná-las será de importância crucial aos possíveis tratamentos futuros de doenças humanas.
Efeitos da exposição ao β-Cariofileno na próstata ventral de gerbilos adultos após a suplementação pela Testosterona
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-08-30) Castro, Nayara Fernanda da Costa; Vilamaior, Patrícia Simone Leite [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A glândula prostática é muito suscetível às alterações nos níveis dos andrógenos, que podem desempenhar um importante papel no desenvolvimento da hiperplasia prostática benigna (HPB). O uso de compostos naturais no tratamento da HPB vem crescendo e tem demonstrado efeitos benéficos à próstata. O β-Cariofileno (BCP) é um composto fitocanabinoide que está presente em diferentes espécies de plantas e possui efeitos anti-inflamatório, apoptótico, antiangiogênico e pode estar relacionado com a inibição da proliferação de uma variedade de células tumorais, inclusive da próstata. Porém, esses estudos, até o momento, se restringiam aos efeitos do BCP em células em cultura, sendo necessário o conhecimento desses efeitos em modelos animais. Dessa forma, o presente trabalho avaliou as alterações provocadas pela testosterona na próstata ventral e analisou os efeitos do BCP na HPB induzida pela testosterona na próstata ventral de gerbilos adultos. Para tal foram utilizados gerbilos machos adultos submetidos a diferentes condições experimentais: injeções subcutâneas de testosterona (3 mg/kg), em dias alternados, durante 4 semanas e eutanasiados, imediatamente (grupo 1) e 30 dias (grupo 2) após o término do experimento; administração diária de BCP (50 mg/kg/dia), via gavagem, por 4 semanas, em gerbilos intactos (grupo 3) e que receberam a suplementação pela testosterona por 30 dias (grupo 4), além dos animais pertencentes ao grupo controle (grupo 5), que não receberam nenhum tratamento ou suplementação. Foram realizadas análises morfológicas, morfométricas, estereológicas, imunohistoquímicas, sorológicas e da expressão de proteínas na próstata ventral. Os resultados obtidos demonstraram que a suplementação pela testosterona promoveu o estabelecimento de lesões, de proliferação, aumento da quantidade de células inflamatórias e alterou a proporção entre os compartimentos teciduais prostáticos nos grupos 1 e 2, que receberam somente a testosterona. A administração de BCP em gerbilos com HPB reduziu a frequência de células proliferativas e inflamatórias nos compartimentos epitelial e estromal e de macrófagos no estroma. As análises dos receptores hormonais mostraram o aumento da frequência da 5 α-redutase 2 na próstata de todos os grupos experimentais comparado ao controle, do receptor de andrógeno (AR) nos grupos 1 e 2 e a redução desse receptor nos grupos 3 e 4. Além disso, foi observado o aumento da expressão do receptor de estrógeno do tipo β (ERβ) no grupo 4 comparado ao grupo 2 indicando um possível efeito anti-proliferativo do BCP na hiperplasia prostática. Também foi verificado o aumento das células em apoptose após o tratamento com o fitocanabinoide em ambos os grupos 3 e 4. Assim, conclui-se que a suplementação pela testosterona foi suficiente para induzir a HPB e essa condição hiperplásica se manteve mesmo após 4 semanas do fim do experimento e, pela primeira vez demonstrado em modelo animal, que o BCP apresentou efeitos positivos para a próstata hiperplásica, como a redução da proliferação e inflamação, indicando resultados promissores no tratamento da HPB.
Papel das Galectinas-1, -3 e -9 em doenças inflamatórias crônicas da pele.
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-09-01) Corrêa, Mab Pereira; Gil, Cristiane Damas; Oliani, Sonia Maria [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
As respostas imunes que envolvem as inflamações crônicas da pele, tais como psoríase e dermatite, são complexas e evidenciam o desafio no diagnóstico clínico, sendo fundamental o estudo de biomarcadores para melhor definição dessas doenças o que contribuirá para uma terapia personalizada. Nesse contexto, destacamos as galectinas (Gal), proteínas caracterizadas por uma sequência conservada de 135 aminoácidos no domínio reconhecedor de carboidrato (CRD) responsável pela afinidade à ligação com açúcares β-galactosídeos. Nas inflamações da pele, o papel das galectinas-1, -3 e -9 tem sido mostrado nas dermatites e psoríase, podendo atuar com papel pró ou anti-inflamatório e, com isso, avaliamos o padrão de expressão das Gal-1, -3 e -9 e sua relação com as células inflamatórias na psoríase (Ps) e dermatite atópica (DA). Também, avaliamos in vitro o efeito da administração das galectinas recombinantes na produção de citocinas pelos queratinócitos, linhagem HaCaT, estimulados por TNF-α/IFN- ou IL-17 ou IL-4. Nos estudos, foram utilizadas biópsias de pele humana diagnosticadas para Ps ou DA (n = 10/9, respectivamente) e de camundongos Balb/c em modelo de DA induzida pela ovalbumina de galinha. Para o grupo controle, foram utilizadas biópsias de margens de pele clinicamente normais removidas junto com tumores de pele (n=10). A DA foi caracterizada por níveis aumentados de Gal-9 na pele de camundongo e humana, especialmente na epiderme, com influxo acentuado de eosinófilos e mastócitos positivos para Gal-9 em comparação com o grupo de controle. In vitro, a Gal-9 mostrou efeito imunomodulador nos queratinócitos, diminuindo a liberação de IL-6 em queratinócitos estimulados por IL-4 ou aumentando os níveis de IL-6 e RANTES quando estimuladas por IL-17 ou TNF-α/IFN-, respectivamente. Sob o estímulo com IL-17, o tratamento com Gal-9 também alterou a taxa de proliferação das células. Em relação às Gal-1 e Gal-3, diferentes padrões de expressão das proteínas e RNAm foram mostrados na epiderme de pacientes com DA e Ps. A Gal-3 apresentou intensa imunorreatividade na epiderme de pacientes com DA, e redução na intensidade em amostras de Ps, enquanto o padrão oposto foi detectado para Gal-1 (mais fortemente expresso na Ps). As peles com DA e Ps mostraram células inflamatórias imunopositivas para Gal-1 e Gal-3. In vitro, a adição de Gal-3 anulou a liberação de IL-6 e RANTES em queratinócitos estimulados por IL-4 e IL-17A, enquanto a Gal-1 reduziu a liberação de IL-6, IL-8 e RANTES em células estimuladas por IL-17A. Sob condições de estimulação por IL-4, a Gal-1 reduziu as taxas de migração dos queratinócitos, e sob estimulação com IL-17A ambas as galectinas aumentaram a migração celular em comparação com células não tratadas. No geral, níveis aumentados de Gal-9 na pele com DA contribuem para o controle da resposta inflamatória e do processo proliferativo dos queratinócitos, sugerindo esta lectina como um alvo terapêutico relevante para a DA e sendo um biomarcador para sua severidade. Além disso, as Gal-1 e Gal-3 representam biomarcadores potenciais para diferenciar as biópsias de pele com Ps e DA e, seus efeitos imunorreguladores e de migração nos queratinócitos, as tornam ferramentas terapêuticas interessantes.
Microevolução de Triatoma sordida (Stål, 1859) (Hemiptera, Triatominae)
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-08-27) Madeira, Fernanda Fernandez; Oliveira, Maria Tercília Vilela de Azeredo [UNESP]; Guerra, Ana Letícia; Alevi, Kaio Cesar Chaboli [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Triatoma sordida (Stål, 1859) é considerado, atualmente, o vetor da doença de Chagas mais frequentemente capturado no ambiente peridomiciliar no Brasil. Além da sua ampla distribuição geográfica nacional, incluindo 14 estados brasileiros, esta espécie também foi relatada em outros países da América do Sul, como Argentina, Bolívia, Paraguai e Uruguai. Diversos estudos sinalizam polimorfismos em T. sordida, o que levou a sugestão do fenômeno de especiação críptica nessa espécie e, principalmente, a recente caracterização de três possíveis táxons diferentes, a saber, T. sordida sensu stricto, T. sordida Argentina e T. sordida La Paz. Dessa forma, diante da necessidade de se expandir o conhecimento acerca da questão taxonômica de T. sordida, o presente estudo teve como objetivo realizar uma análise integrada de aspectos evolutivos dessa espécie, com ênfase no fenômeno de especiação críptica, por meio da caracterização das populações brasileiras por parâmetros moleculares e citogenéticos, além de análises envolvendo sistemática filogenética, taxonomia integrativa e a realização de cruzamentos experimentais intraespecíficos entre exemplares de T. sordida do Brasil, Argentina e Bolívia. Por meio das análises envolvendo marcadores citogenéticos e moleculares, foi verificada a baixa diversidade genética das populações brasileiras de T. sordida, evidenciada pelos seguintes fatores: mesmo padrão de bandamento C e CMA3/DAPI, baixa diversidade nucleotídica, alta diversidade haplotípica, baixa distância genética entre todas as localidades analisadas, alto valor do índice Fst, e a formação de um clado monofilético das populações brasileiras amostradas e separado de espécimes da Argentina, suportando que todos os espécimes brasileiros podem ser agrupados como T. sordida sensu stricto. Com base nas análises de taxonomia integrativa (análises morfológicas, morfométricas, moleculares e cruzamentos experimentais), também demonstramos que o citótipo T. sordida da Argentina é uma nova espécie, confirmando o status específico de T. rosai sp. nov. Além disso, baseando-se na baixa distância genética entre T. sordida sensu stricto e T. sordida La Paz, associada à ausência de barreiras reprodutivas pré-zigóticas e pószigóticas, ausência de disgenesia gonadal e de erros de pareamentos cromossômicos dos híbridos F1 e F2 resultantes, sugerimos que o citótipo T. sordida La Paz representa apenas um polimorfismo cromossômico de T. sordida sensu stricto.
Efeitos da administração da proteína anexina a1 e do extrato da garcinia brasiliensis em modelo de doença pulmonar obstrutiva crônica induzida por exposição à fumaça de cigarro
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-03-05) Possebon, Lucas; Girol, Ana Paula; Oliani, Sonia Maria [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A proteína anti-inflamatória Anexina A1 (AnxA1) e o extrato da Garcinia brasiliensis têm mostrado resultados positivos em diferentes contextos de inflamações. Diante disso e da grande incidência da doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), o objetivo desta investigação foi avaliar os efeitos da administração do peptídeo mimético da AnxA1, Ac2-26, e do extrato alcoólico da G. brasiliensis em modelo de DPOC. O extrato de G. brasiliensis foi submetido a análises fitoquímicas, microbiológicas e de citotoxicidade para escolha da concentração de uso adequada. As análises de padronização do extrato indicaram presença de tanino, glicosídeos flavanoídios e alcaloides e ausência de glicosídeos saponínicos. O extrato mostrou baixa toxicidade nas concentrações de 4%, 6% e 8% em testes de hemólise e in ovo. Ainda, indicou inibição de E. coli, Klebsiella, Proteus, Salmonella e Shigella. Para o desenvolvimento da DPOC, ratos (machos e fêmeas, Wistar) foram expostos à fumaça da queima de 10 cigarros comerciais, 2x/dia, por 8 semanas, em aparelho próprio para exposição ao fumo. Animais dos grupos tratados foram administrados via intraperitoneal com o Ac2-26 (1mg/Kg) e outros com solução de extrato da G. brasiliensis (4%), por gavagem, 3x/semana. Os grupos controles foram mantidos no mesmo regime, mas na ausência da fumaça do cigarro. Peso e pressão sanguínea arterial foram avaliados no início e no término do protocolo de exposição. Ao final do experimento, foram realizadas análises das imagens de raios X e estudos da ventilação pulmonar (pletismografia). Após eutanásia por dose excessiva de anestésico, sangue, lavado broncoalveolar (LBA), pulmões e traqueia foram coletados. As células inflamatórias do LBA foram quantificadas em câmara de Neubauer. As expressões das proteínas AnxA1, e ciclo-oxigenase-2 (COX-2), receptores de peptídeos formilados (FPR1 e FPR2) e metaloproteinases de matriz (MMP2 e MMP9) foram estudadas por imuno-histoquímica nos tecidos, enquanto os macrófagos foram quantificados por imunofluorescência. As expressões de AnxA1, também foram analisadas no sobrenadante do macerado pulmonar por Western blotting. A hemoglobina foi avaliada no sangue total e as citocinas interleucina (IL)-1β, IL-6, fator de necrose tumoral (TNF)-α e proteína quimioatractante para monócitos (MCP)-1 foram quantificadas no plasma sanguíneo e no sobrenadante pulmonar, pelo LUMINEX xMAP MAGPIX. Os ratos machos e fêmeas expostos ao fumo sem tratamento apresentaram reduções macroscópicas das dimensões pulmonares por imagens de raio-X, aumento de frequência, volume e ventilação pulmonares, bem como da concentração de hemoglobina comparados aos ratos tratados e controles. Nas análises do LBA, foi observada maior quantidade de linfócitos e macrófagos no grupo exposto à fumaça sem tratamento, comparado à redução significante dessas células nos grupos tratados. Nas avaliações morfológicas, maiores espaços intra-alveolares ocorreram no pulmão dos ratos expostos à fumaça do cigarro comparados aos grupos controle e tratados. Nos pulmões também foi observado aumento de macrófagos nos animais não tratados, comparados aos demais. Os estudos imuno-histoquímicos revelaram aumento significante da expressão das proteínas analisadas nos animais expostos sem tratamento, com redução de AnxA1 e MMP-2 após os tratamentos. Entretanto, nos grupos tratados com o peptídeo Ac2-26 ocorreu aumento de FPR1 e FPR2 comparados ao não tratados. Nas dosagens das citocinas, foram observados aumentos significantes de IL-1β, TNF-α e MCP-1 nos animais expostos à fumaça do cigarro, com redução após os tratamentos, bem como aumento de IL-10 nos animais que receberam tratamento com o peptídeo e extrato vegetal comparado aos animais não tratados. Nas fêmeas, de modo geral, o processo inflamatório foi mais exacerbado e a reversão dos danos menos pronunciada após os tratamentos. Associados, nossos dados mostram que a administração do peptídeo mimético Ac2- 26 da AnxA1 e do extrato vegetal da G. brasilisensis promoveu efeitos anti-inflamatórios protetores contra o desenvolvimento da DPOC no modelo proposto.
Citotaxonomia de Trypanosoma cruzi (Chagas, 1909) e influência desse agente etiológico nas células de Triatoma infestans (Klug, 1834)
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-02-28) Oliveira, Ana Beatriz Bortolozo de; Oliveira, Maria Tercília Vilela de Azeredo [UNESP]; Alevi, Kaio Cesar Chaboli [UNESP]; Ribeiro, Aline Rimoldi; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O protozoário Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas, uma doença parasitária negligenciada e potencialmente fatal que apresenta grande importância para a saúde pública de diversos países. Atualmente, existem sete unidades discretas de tipagem (DTUs) de T. cruzi classificadas com base em diferentes marcadores moleculares, sendo TcI e TcII os mais importantes do ponto de vista epidemiológico. A transmissão desse protozoário ocorre principalmente por meio dos triatomíneos, no entanto, a relação entre o parasito e o vetor ainda é pouco explorada e alguns estudos relatam efeitos negativos causados pela infecção, o que ressalta a importância de aprofundar a compreensão dessa interação. Assim, objetivou-se: i) caracterizar citogeneticamente duas importantes cepas de T. cruzi, a saber, Bolívia e Y (representantes de TcI e TcII, respectivamente), a fim de estabelecer métodos mais acessíveis e efetivos para a identificação das DTUs e ii) aprofundar a compreensão sobre a interação parasito-vetor, por meio de análises citogenéticas e/ou estruturais de células de testículo (espermatogênese) e túbulos de Malpighi de Triatoma infestans infectado com a cepa Bolívia de T. cruzi. A análise citogenética das cepas de T. cruzi possibilitou diferenciar os grupos TcI e TcII, com base no grau de heteropicnose do núcleo. O estudo citogenético e estrutural dos insetos infectados permitiu observar que a espermatogênese de T. infestans ocorreu normalmente, sugerindo que as alterações inicialmente relatadas para os aspectos reprodutivos resultam da influência do protozoário sobre a gametogênese das fêmeas. Além disso, a caracterização citogenética das células dos túbulos de Malpighi de T. infestans demonstrou que a infecção também não altera a morfologia nuclear e o metabolismo celular, demonstrando que a presença do T. cruzi não acarreta em prejuízo para o órgão excretor. A diferenciação de TcI e TcII e o conhecimento da relação parasito-vetor mostraram-se importantes do ponto de vista entoepidemiológico. Ainda, a correta identificação das cepas, por meio da citogenética clássica, também pode auxiliar no diagnóstico clínico da doença de Chagas.
Desregulação de genes e elementos de transposição e incompatibilidade híbrida entre subespécies de Drosophila mojavensis e D. arizonae
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-05-13) Banho, Cecilia Artico; Carareto, Claudia Marcia Aparecida [UNESP]; Vieira, Cristina; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Hibridização interespecifica é uma condição de estresse que pode levar à esterilidade ou à inviabilidade devido à desregulação de genes e elementos de transposição (TEs), particularmente em espécies do gênero Drosophila com grande tempo de divergência. Contudo, a extensão dessas anormalidades em híbridos de espécies com tempo de divergência recente ainda não é bem compreendida. Drosophila mojavensis e D. arizonae são um bom sistema biológico para investigar essa questão uma vez que a divergência entre elas foi relativamente recente (~1,5 milhões de anos atrás), apresentam diferentes graus de isolamento reprodutivo, e são capazes de produzir híbridos em laboratório. A fim de verificar a ocorrência e o grau da incompatibilidade híbrida, neste estudo, foram realizadas análises fenotípicas para estimar parâmetros da história de vida de descendentes de cruzamentos intra e interespecíficos, bem como análises de expressão diferencial de genes e TEs que possam estar envolvidos no isolamento reprodutivo, por meio de análises de RNA-Seq, de parentais e híbridos. Todos os híbridos apresentaram menor viabilidade em comparação aos descendentes de cruzamentos intraespecíficos, como também todos os híbridos machos dos cruzamentos entre fêmeas D. mojavensis vs machos D. arizonae apresentaram espermatozoides móveis, enquanto que nos cruzamentos recíprocos, 75% dos híbridos apresentaram espermatozoides imóveis. As análises fenotípicas mostraram ausência de disgenesia gonadal em machos e fêmeas, bem como fertilidade em 100% das fêmeas híbridas. Contudo, apenas 50% dos híbridos com motilidade espermática foram férteis. As análises do transcriptoma evidenciaram expressão conservativa para a maioria dos genes e famílias de TEs em ovários de híbridos em relação às espécies parentais. Em testículos, por outro lado, menor número de genes e TEs tiveram expressão conservada, sendo observada uma tendência à superexpressão de TEs e subexpressão de genes. Além disso, foi verificado que híbridos sem motilidade espermática, provenientes de cruzamentos entre fêmeas D. arizonae vs machos D. mojavensis apresentaram maior número de genes desregulados que aqueles com espermatozóides móveis, e que a maioria desses genes estavam subexpressos e apresentaram funções relacionadas à espermatogênese, de acordo com análises de ontologia. O sistema de regulação pós-transcricional parece falhar no controle da expressão de TEs superexpressos em ovários e testículos, mesmo quando piRNAs estão presentes na linhagem materna. Isso evidencia que outros mecanismos podem estar relacionados à desregulação dos TEs nos tecidos reprodutivos de híbridos entre D. arizonae e D. mojavensis. Dentre esses mecanismos pode-se sugerir a desregulação de alguns genes envolvidos na via de piRNAs, e de modifição de cromatina, como observado em testículos. Contudo, o mesmo não pode ser sugerido para ovários, uma vez que nessa gônada a expressão desses genes não estava desregulada. Em síntese, este estudo mostra que testículos de híbridos entre D. arizonae e D. mojavensis apresentam maior expressão diferencial de genes e de TEs em relação aos parentais do que em ovários e que, embora piRNAs estejam presentes para muitos dos TEs desregulados, eles não são capazes de controlar sua expressão, o que pode estar ligado ao fenótipo de esterilidade demostrado pelos parâmetros de história de vida analisados nestes híbridos.
Aspectos estruturais e ultraestruturais das espermátides de percevejos fitófagos (Heteroptera: Pentatomidae)
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-02-27) Silva Junior, Fernando Cesar; Itoyama, Mary Massumi [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Dentro da subordem Heteroptera algumas espécies pertencentes a família Pentatomidae apresentam espermátides polimórficas em seus lobos testiculares que são oriundas de dois fenômenos: a polimegalia e o lobo harlequin. Para a investigação dessas espermátides polimórficas e de seu desenvolvimento comparadas às espermátides não polimórficas, foram coletadas em São José do Rio Preto as espécies Antiteuchus tripterus, Edessa meditabunda, Loxa deducta e Proxys albopunctulatus (Pentatomidae, Heteroptera). Os machos tiveram seus testículos extraídos, fixados e incluídos em parafina ou resina. O material incluído em parafina foi cortado e corado com hematoxilina/eosina (HE) e analisados em microscopia de luz, outros testículos, destas quatro espécies, foram incluídos em resina e analisados em microscópio eletrônico de transmissão (MET). Os testículos A. tripterus são alongados e divididos em 6 lobos, sendo 1 a 3 sem alterações, 4 e 6 com polimegalia e o 5 o lobo harlequin. Foi possível observar, também, que os lobos 4 e 6 possuem espermátides grandes enquanto o 5 apresenta espermátides pequenas. Em MET foi possível observar em todos os lobos a formação da cauda da espermátide onde ocorre a formação dos derivados mitocondriais e a posterior formação do axonema entre os derivados. Além disso, foi detectada a presença de três tipos de espermatozoides no ducto eferente, sendo estes oriundos dos diferentes lobos. Há o espermatozoide maior com morfologia alongada com pequenas protuberâncias em suas extremidades; o intermediário com morfologia reniforme com a extremidade apical maior que a extremidade basal e o menor e o mais arredondado quando comparado aos demais. Já nas espécies E. meditabunda, L. deducta e P. albopunctulatus foi possível se observar a morfologia do testículo e formação da cauda dos espermatozoides onde em E. meditabunda o testículo apresentou quatro lobos todos sem alterações, também se observou só um tipo de espermátide com forma arredondada que dá origem a um tipo de espermatozoide, já L. deducta apresentou sete lobos testiculares sendo o 5 o harlequin e os demais sem alterações. Foi possível observar a presença de um tipo maior e arredondado de espermátide oriunda dos lobos sem alterações e um tipo menor e de morfologia irregular originado do lobo harlequin, sendo possível observar dois tipos de espermatozoides no ducto eferente onde o primeiro tipo é menor e mais arredondado, com pequenas estruturas paracristalinas em seu interior e o segundo tipo é maior e mais retangular e com grandes estruturas paracristalinas. Em P. albopunctulatus se observou seis lobos testiculares, sendo o 4 e 6 com polimegalia e os demais sem alterações, também foi possível visualizar espermátides normais e arredondadas presentes nos lobos sem alterações, enquanto nos lobos com polimegalia estavam presentes espermátides gigantes com muitas mitocôndrias e vesículas em seu citoplasma Já a compactação da cromatina ocorreu de maneira semelhante nas espécies estudadas, ela se torna finamente granulada e começa a se aglomerar onde dá origem a cromatina filamentar que se aglomera para preencher o núcleo se tornando completamente compactada. Esse processo ocorre de maneira muito semelhante nas espermátides oriundas de lobos sem alterações, com polimegalia e do harlequin, além de que nas espermátides do lobo harlequin foram encontradas todas as estruturas que compõem a cabeça dos espermatozoides.. Portanto com este estudo podemos concluir que na espécie A. tripterus e L. deducta, os seus diferentes lobos testiculares produzem diferentes tipos de espermatozoides, sendo que estes apresentam todas as estruturas necessárias para serem funcionais e que estes diferem morfologicamente entre si, a formação dos componentes da cabeça e da cauda dos espermatozoides se da de maneira semelhante nas quatro espécies e em outros insetos estudados, a condensação da cromatina se deu de maneira semelhante em A. tripterus e L. deducta seguindo um padrão anteriormente descrito. Existem diferenças morfológicas entre os derivados mitocondriais das espécies estudadas e até mesmo na mesma espécie em espermatozoides oriundos de diferentes lobos testiculares o que pode fazer que através de novos estudos esses caracteres morfológicos sejam usados como ferramentas de identificação de novas espécies.
Investigação comparativa de espermátides de quatro infraordens de Heteroptera, com ênfase nos aspectos ultraestruturais
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-02-28) Souza, Emi Rosane Silistino de; Oliveira, Maria Tercília Vilela de Azeredo [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A subordem Heteroptera possui uma enorme diversidade de insetos distribuída em sete infraordens, dentre as quais utilizamos Gerromorpha, Nepomorpha, Cimicomorpha e Pentatomomorpha. As espécies que foram estudadas da primeira infraordem, representando os insetos semi-aquáticos, são Limnogonus aduncus e Mesovelia mulsanti, da segunda infraordem, representando os aquáticos, são Belostoma anurum, Martarega sp. e Buenoa unguis, da terceira infraordem Zelus sp. e Teleonemia sp. e da última infraordem, representando juntas os terrestres, são Largus sp., Stenocoris sp., Zicca pulchra e Dysdercus sp. para descrever as ultraestruturas de suas espermátides e posterior comparação. Durante o processo de espermiogênese em geral, ocorre uma série de modificações nas espermátides antes dessas serem transformadas em espermatozoide, inclusive nos insetos. Neste trabalho verificamos por meio da Microscopia Eletrônica de Transmissão, as modificações ocorridas nas espermátides das infraordens anteriormente mencionadas. Na maioria dos insetos com hábitat aquático foi identificada uma maior variação morfológica com relação aos derivados mitocondriais, apresentando-se tanto com simetria reniforme, com simetria e padrão diferente, quanto com assimetria. Com relação aos terrestres, foi identificado predominantemente um padrão morfológico reniforme com uma área de cada derivado mitocondrial menor que a do axonema. Somente a espécie B. unguis, de hábitat aquático, evidenciou um padrão atípico, assimétrico, de derivados mitocondriais, com relação ao comumente observado na subordem Heteroptera. Ao longo da espermiogênese foi verificada a presença de manchete ao redor do núcleo e do acrossomo nas espécies M. mulsanti, L. aduncus, Teleonemia sp. e Z. pulchra, com padrão de distribuição dos microtúbulos diferente entre os insetos de hábitat aquático e terrestre. Outra característica observada foi a presença de um forame no interior do acrossomo de M. mulsanti, L. aduncus. As variações para as características analisadas no presente trabalho podem ser utilizadas como ferramentas importantes para auxiliar em análises sistemáticas.
Filogeografia de Drosophila sturtevanti (Diptera: Drosophilidae) em biomas neotropicais
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2019-07-05) Zorzato, Samara Videira; Madi-Ravazzi, Lilian [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
As mudanças climáticas ocorridas no Pleistoceno afetaram a distribuição e os padrões de diversificação populacionais e são conhecidas como um dos potenciais impulsionadores da alta diversidade encontrada na região Neotropical. Drosophila sturtevanti pertence ao subgrupo sturtevanti do grupo saltans de Drosophila e é uma das espécies com distribuição geográfica mais ampla dentro do grupo, ocorrendo em áreas florestais de diferentes biomas. Além disso, essa espécie apresenta altos níveis de variabilidade genética para diversos marcadores, constituindo um excelente modelo para estudos de estrutura populacional, diversificação e adaptação em diferentes cenários. O objetivo desse estudo foi analisar a diferenciação genética, usando os genes Citocromo Oxidase subunidades I e II em 163 indivíduos provenientes de 21 populações de D. sturtevanti coletados em fragmentos florestais da América Central ao sul do Brasil, com ênfase na Mata Atlântica. Nossos resultados moleculares mostram que as populações de D. sturtevanti estão estruturadas na América do Sul e sua distribuição mostra uma correlação significativa com variáveis geográficas e climáticas, principalmente temperatura e umidade. Além disso, os eventos de divergência entre os grupos geográficos sugerem associação significante com as oscilações paleoclimáticas ocorridas desde o Pleistoceno tardio e, esses eventos, provavelmente moldaram a distribuição geográfica dos haplogrupos de acordo com variáveis ambientais, principalmente temperatura e umidade.

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