Teses - Ciências Farmacêuticas - FCFAR

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Estudo in vitro do potencial da piperina encapsulada em metal-organic frameworks e com modificação de superfície para o tratamento do câncer de mama
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-07-11) Quijia Quezada, Christian Rafael; Chorilli, Marlus; Frem, Regina Celia Galvão; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O câncer de mama é uma das principais causas de morte entre mulheres com câncer em todo o mundo, levando à busca por tratamentos quimioterápicos mais eficazes. Entre os compostos com potencial quimioterapêutico, destaca-se a piperina (PIP), que demonstrou atividade antitumoral em linhagens de câncer de mama. No entanto, a utilização desse composto em estudos pré-clínicos tem sido limitada devido à sua toxicidade. Uma abordagem promissora para melhorar as propriedades biofarmacêuticas da piperina é o uso de redes metalo-orgânicas (MOFs), como o MIL-100 (Fe), como sistemas de liberação de fármacos. Além disso, a modificação de nanoestruturas com materiais naturais, como as membranas de macrófagos (MM) ou quitosana (QUI), pode proporcionar uma camuflagem contra o sistema imunitário, resistência à degradação e liberação controlada. Inspirado por esses avanços científicos e tecnológicos, este trabalho tem como objetivo avaliar o potencial da piperina encapsulada em MOFs revestidos com MM ou QUI para o tratamento do câncer de mama. Neste estudo, foram sintetizados com sucesso os nanosistemas baseados no MIL-100(Fe) contendo piperina revestida com MM (MM@PIP@MIL-100(Fe)) ou com QUI (QUI@PIP@MIL-100(Fe)) por meio de síntese hidrotermal assistida por micro-ondas e método de impregnação. As análises por difração de raios-X de MIL-100(Fe) e PIP@MIL-100(Fe) revelaram a cristalinidade dos materiais e tamanhos de partícula de 18,32 nm e 76,18 nm, respectivamente. A presença de proteínas na superfície das vesículas de MM@PIP@MIL-100(Fe) foi confirmada por eletroforese (SDS-PAGE), enquanto o revestimento de quitosana (QUI) no MOF foi sugerido por espectroscopia de infravermelho. A quantificação da piperina nos MOFs foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), mostrando uma eficiência de encapsulamento de 95 ± 3%. Os ensaios de citotoxicidade em células de câncer de mama, como MCF-7, SKBR3, MDA-MB-231 e BT549, utilizando os materiais PIP@MIL-100(Fe), MM@PIP@MIL-100(Fe) e QUI@PIP@MIL-100(Fe), revelaram um índice de citotoxicidade maior em comparação com a piperina livre, com uma concentração inibitória média (IC50) entre duas e dezessete vezes maior. Em conclusão, este trabalho sugere potencial aplicação da piperina nessas nanoestruturas no tratamento do câncer de mama.
Otimização dos parâmetros de produção para atividade e expressão heteróloga de enzimas celulolíticas pelo fungo de ambiente marinho Trichoderma lixii-5A7
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-12-16) Eguiluz, Alexandra Daniela Barrios; Pietro, Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues; Moreira, Tatiana Maria de Souza; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Na área industrial existem diversos mecanismos (físicos, químicos, enzimáticos, fermentativos) para degradar biomassa e, assim, obter uma ampla variedade de bioprodutos como biocombustíveis, biopigmentos, carotenoides, etc. Entre os componentes dos resíduos naturais de biomassa, a celulose é o mais abundante podendo degradar os resíduos até glicose e gerar produtos de interesse. Desta forma, as celulases têm uma ampla utilização na indústria de alimentos, detergentes, têxteis, biocombustíveis, assim como na área farmacêutica. Na atualidade, são utilizadas cepas de alguns fungos para produzir as enzimas celulases em escala industrial, como exemplo de Aspergillus niger e Trichoderma reesei. Estas enzimas, mesmo tendo um substrato em comum, podem variar sua atividade dependendo da temperatura, pH, especificidade e concentração. Portanto, identificar novos microrganismos com elevado potencial para a obtenção de celulases é de grande importância na estratégia de melhorar a economia do processo e a especificidade para a obtenção do bioproduto. Levando em consideração a diversidade de microrganismos e a possibilidade de obter uma nova fonte para produção da enzima, o presente trabalho objetivou avaliar a atividade de enzimas celulolíticas do fungo de ambiente marinho Trichoderma lixii -5A7, caracterizá-las quanto à produção e identificação da sequência codificadora. Para tanto, foi selecionado o meio D que apresentou uma maior produção enzimática na temperatura de 20°C, contendo em sua composição carboximetilcelulose (CMC;20 g/L) como indutor. Na cinética de produção, na temperatura selecionada, obteve-se no 15º dia de produção o maior pico de atividade enzimática específica para β-glicosidase, endoglucanase, FPAse e exoglucanase (respetivamente 71,84; 65,87; 49,12 e 68,23 UI/mg). Posteriormente, para otimizar a produção das enzimas celulolíticas do fungo Trichoderma lixii – 5A7 foi realizado o planejamento experimental fatorial para o melhor meio de cultura utilizando o delineamento do composto central rotacional (DCCR) e coletando amostras nos dias 13; 14; 15 e 16. A maior produção da enzima β-glicosidase foi no ensaio 23 com 85,91 UI/mg de atividade específica e no ensaio 9 obteve-se uma atividade específica de 125,99; 60,94; 83,60 UI/mg para as enzimas endoglucanase, FPAse e exoglucanase respectivamente, sendo os resultados de ambos experimentos com a maior produção no dia 15, os ensaios mencionados foram obtidos da matriz proposta pelo software utilizado para o DCCR. A fermentação em escala de biorreator (3 L) realizada posteriormente demonstrou um pequeno aumento da atividade enzimática apenas para a β-glicosidase no ensaio 23 e no ensaio 9 para a FPAse, enquanto as demais enzimas mostraram uma atividade similar à obtida na escala de bancada, mas, no entanto, o pico de maior produção foi obtido no quarto e quinto dia respectivamente. Para clonagem da sequência codificadora, foi extraído o RNA total do fungo para cada ensaio (9 e 23), o qual foi utilizado para a síntese do cDNA com a finalidade de amplificar fragmentos das enzimas celulolíticas, utilizando a técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Em seguida, foi realizado sequenciamento do produto gerado, clonagem e expressão em Escherichia coli para então avaliar a produção e atividade celulolítica. Desta forma, no presente trabalho, determinou-se que a produção das enzimas celulolíticas em T.lixii -5A7 pode ser otimizada reduzindo a temperatura e variando as concentrações dos componentes do meio selecionado representando uma melhora na atividade enzimática especifica entre 80 a 126 UI/mg, tornando esse fungo viável para a produção dessas enzimas. Além disso, foi possível determinar pela primeira vez a sequência codificadora da β-glicosidase desse fungo e caracterizá-la funcionalmente em bactéria.
Estudo fitoquímico, variação climática e potencial biológico dos cladódios de variedades comerciais de pitaya
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-01-13) Kamikawachi, Renan Canute; Vilegas, Wagner; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A busca por novas fontes de fármacos é incessável. A vasta biodiversidade brasileira a torna um objeto de estudos extremamente importante. Nesse contexto, dentre os cactos, o gênero Selenicereus (A.Berger) Britton & Rose, que produz espécies popularmente conhecidas como pitaya, chama atenção pelo alto valor de seu fruto. Grande parte dos estudos acerca do gênero Selenicereus está restrita aos frutos. A utilização dos frutos para a produção de fármacos apresenta dois problemas: 1) depende da época da frutificação e 2 ) a produção de fármacos compete com o mercado alimentício. Por outro lado, os cladódios (ramos) são presentes independentemente da sazonalidade, não apresentam alto valor de mercado, são produtos resultantes da poda e apresentam atividade antioxidante equiparável ao fruto. Para explorar essa lacuna de informação, investigamos a composição química sazonal (12 meses), a atividade antioxidante e atividade antiproliferativa dos cladódios de 17 variedades comerciais de Selenicereus. Foram preparados extratos metanólicos de cada uma das variedades coletadas, que foram analisadas por HPLC-ESI-IT-MSn para obtenção de dados estruturais e metabólicos. O metaboloma revelou a presença de flavonoides derivados do Kaempferol, Isorhamnetina e Quercetina com até seis unidades glicosídicas. A análise através de plataforma GNPS evidenciou que esses flavonoides têm distribuição quali e quantitativamente diferentes em cada variedade, e que ocorrem flutuações na concentração dos flavonoides no decorrer do ano. A atividade antioxidante de cada uma das variedades refletiu a flutuação da variação quali e quantitativa dos flavonoides ao longo do ano. Entretanto, pelo menos cinco amostras promoveram a inibição de DPPH acima de 70%. Dentre as cinco amostras selecionadas, apenas Zamorano 06 promoveu atividade antiproliferativa e apresentou EC50 de 278 μg/mL. As amostras selecionadas não apresentaram genotoxicidade nem toxicidade aguda em Danio rerio. Através da desreplicação, sugerimos que a atividade apresentada por Zamorano 06 está relacionada às substâncias dihidroquercetina, isorhamnetina3-O-glicosideo, quercetina-3-O-glicosideo e isorhamnetina 3-(4Rhagalactosilrobinobiosideo) e também sugerimos que outras nove amostras possam apresentar atividade antiproliferativa, pois estão no mesmo cluster que Zamorano 06.
Desenvolvimento de equivalentes de pele 3D para aplicação em ensaios de terapia fotodinamica de bioestimulação usando nanocápsulas de curcumina
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-02-02) Amantino, Camila Fernanda; Primo, Fernando Lucas; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A preocupação ética e cientifica sobre ensaios utilizando animais, os quais apresentam apenas 20% do potencial terapêutico reproduzidos em ensaios clínicos, faz com que a busca por alternativas seja cada vez maior. Desta forma, a Engenharia de Tecidos se apresenta como alternativa promissora para tratamento de diversas doenças, por meio do desenvolvimento de modelos tridimensionais para utilização em teste in vitro substituindo modelos animais in vivo e na elaboração de reparos ou substituições de tecidos específicos. Neste estudo foram produzidos equivalentes de pele 3D (EPT) para utilização como modelo em ensaios in vitro de fotobioestimulação utilizando nanocápsulas com curcumina. A terapia fotodinâmica de bioestimulação utiliza dos processos fotodinâmicos para gerar pequenas quantidade de espécies reativas de oxigênio (ERO), que podem resultar na diferenciação celular, modulação de processos inflamatórios e contribuição na regeneração e proliferação celular. As nanocápsulas (NC) apresentaram tamanho de partícula < 200nm, potencial Zeta >|30|, e índice de polidispersividade entre 0,5 e 0,3. A microscopia de força atômica também apresentou tamanho de partícula < 200 nm, morfologia esférica e superfície uniforme predominantemente lisa. O ensaio de biocompatibilidade das NC mostrou ausência citotoxicidade para as concentrações testadas (2,5 - 25 μg.mL-1). O ensaio de liberação in vitro mostrou uma liberação lenta e sustentada o que é característico das NC, os ensaios de captação celular mostraram um aumento significativo da internalização celular da curcumina quando em nanoestrutura. Estudos de fotobioestimulação em monocamada, mostraram um aumento da viabilidade celular da linhagem fibroblastos dérmicos neonatal de humanos (HDFn) (viabilidade > 134%) para todas as fluências de LED empregadas a  = 450 nm (150, 300 e 450 mJ.cm-2). O ensaio de monitoramento da lesão cicatricial in vitro apresentou efeitos mais efetivos de proliferação celular com a fluência de 300 mJ.cm-2. A marcação do EPT com e hematoxilina e eosina, mostrou a presença de células com morfologias distintas, o que comprova a presença dos fibroblastos e queratinócitos nos EPT. A imuno-histoquímica utilizando KI-67 mostrou a presença de células em proliferação nos EPT após a irradiação com LED  = 450 nm (150, 300 e 450 mJ.cm-2).
Sistemas poliméricos multifuncionais baseados em micropartículas contendo nanocarreadores para liberação colônica da camptotecina
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-02-18) Boni, Fernanda Isadora; Gremião, Maria Palmira Daflon; Cury, Beatriz Stringhetti Ferreira; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A superexpressão de receptores na superfície das células tumorais representa um potencial alvo para a vetorização de fármacos no tratamento do câncer. O desenvolvimento de nanopartículas com superfície modificada é uma importante estratégia tecnológica para promover a interação específica com as células tumorais, objetivando um tratamento mais seletivo. Nesse trabalho, sistemas para a via oral, baseados em nanocápsulas (NCs) microencapsuladas em matrizes de goma gelana (GG) e pectina (P) ou amido resistente (AR) foram desenvolvidos como plataforma para a vetorização cólon-específica da camptotecina (CPT), como potencial estratégia para o tratamento local do câncer colônico. Primeiramente, micropartículas vazias (MPs) de GG:P ou GG:AR foram obtidas pelo método de geleificação ionotrópica utilizando os Ca2+ e/ou Al3+ . As MPs apresentaram diâmetro na faixa de 889 a 1793 µm e elevada circularidade. As MPs obtidas a partir de GG:P reticuladas com Al3+ apresentaram o menor diâmetro médio (889 µm). Entre as compostas por GG:AR, a reticulação com Ca2+ (GACa) resultou na formação de partículas menores (~ 1607 µm). A capacidade de absorção de líquido das MPs foi elevada em pH 1,2 e 6,8, no entanto, as taxas de absorção do meio ácido foram menores, principalmente para a GACa. A porcentagem de erosão das MPs foi maior em pH 1,2 (20 a 26 %) e aparentemente ocorreu a nível superficial. Em pH 6,8, a porcentagem de erosão foi de2,5 a 22,6 %, ocorrendo de forma homogênea ao longo da matriz. A reticulação com Ca2+ da GG:AR promoveu uma redução expressiva da degradação enzimática (pH 1,2 e 6,8), atributo promissor para a proteção do fármaco contra a degradação gástrica. A capacidade mucoadesiva das MPs foi evidenciada em ensaio ex vivo com mucosa intestinal suína. Com base nas propriedades consideradas promissoras, as partículas GACa e GPCa forma selecionadas para a incorporação das NCs. Na segunda etapa do trabalho, NCs foram obtidas pelo método de emulsificação/evaporação do solvente, e revestidas com quitosana (QS), ftalato de hidroxipropilmetilcelulose (HP) e/ou ácido hialurônico (AH), a fim de modular as propriedades de superfície. Para tal, nanoemulsões aniônicas foram obtidas variando-se a concentração de polissorbato 80 e revestidas com QS, promovendo a inversão do potencial zeta das partículas formadas. As NCs com a proporção de 1,8 e 3,6:1 de lecitina:QS, foram posteriormente revestidas com AH e HP. As NCs com múltiplas camadas de revestimento com diâmetro < 250 nm, PDI de ~0,25 e potencial zeta de -15 a -31 mV, foram selecionadas para a incorporação da CPT. A eficiência de incorporação da CPT foi >94% e a adição do fármaco resultou na redução do diâmetro das partículas. O ensaio de permeação ex vivo demonstrou que a nanoencapsulação reduziu a taxa de permeação da CPT através da mucosa intestinal em até 3,5×, e o revestimento com AH e HP reduziu o percentual de permeação em 2× comparado às NCs revestidas apenas com QS. A capacidade mucoadesiva das NCs foi demonstrada em testes com mucina, simulando o pH gástrico e entérico. A nanoencapsulação não reduziu a atividade antiangiogênica da CPT, em ensaio com a CAM. Para as NCs contendo CPT, observou-se a ação antiangiogênica localizada, provavelmente devido à capacidade muco/biodesiva, sendo um efeito vantajoso para ação local e redução de efeitos adversos sistêmicos. Na terceira etapa do trabalho, as NCs foram microencapsuladas nas MPs obtidas previamente obtidas, apresentando rendimento entre 80 e 89%, e partículas com diâmetro entre 756 e 921 µm. A eficiência de incorporação das NCs variou de 16 a 56 %, sendo a composição do revestimento das NCs e da matriz das MPs fatores que influenciaram significativamente esse parâmetro. Estudos de mucoadesão in vitro e ex vivo evidenciaram a elevada capacidade mucoadesiva dos sistemas em segmentos do intestino delgado, cólon suíno e discos de mucina, comportamento que pode favorecer a imobilização do sistema no órgão alvo. O ensaio de digestão in vitro indicou a susceptibilidade da matriz à ação enzimática em ambiente gástrico, favorecendo a liberação da CPT nesse meio. As NCs apresentaram um conjunto de atributos favoráveis, demonstrando ser uma plataforma promissora para o tratamento local do câncer colônico, explorando uma via indireta de inibição da progressão tumoral.
Avaliação biológica de extratos obtidos das partes aéreas e plântulas de Physalis angulata L. (solanaceae)
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-02-24) Donadon, Maria Leonor Beneli [UNESP]; Pietro, Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
RESUMO As plantas tornaram-se material constante em pesquisas que possam encontrar novas moléculas com atividade antimicrobiana, a fim de possibilitar inovações e trazer benefícios à população. Além do potencial natural das plantas, algumas técnicas têm sido aplicadas para aumentos de substâncias de interesse, como a elicitação de metabólitos através de aplicação de luzes em fotoperíodo controlado. O gênero Physalis tem um histórico conhecido sobre suas atividades biológicas atribuídas às fisalinas, porém ainda pouco explorado frente a fitopatógenos bem como em relação à elicitação de por luzes. O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade antibacteriana e antifúngica dos extratos de plântulas cultivadas in vitro, elicitadas por várias luzes, e partes aéreas de Physalis angulata L. frente a microrganismos humanos e fitopatógenos.(...). Os extratos foram investigados quanto à composição fitoquímica; teor de flavonoides e fenólicos totais; atividade antioxidante; determinação da concentração inibitória mínima (CIM) para controle de fungos, bactérias, fitopatógenos e humanos; avaliação do mecanismo de ação dos extratos e toxicidade em modelo alternativo de Galleria mellonella.(...) O estudo desenvolvido demonstrou que os extratos de P. angulata tem potencial de aplicação em vários setores podendo contribuir para a geração de produtos que podem reduzir a carga de toxicidade daqueles usados atualmente.
Cordia verbenacea DC.: estudo químico biológico relacionado ao seu uso tradicional
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-03-29) Moro, Isabela Jacob [UNESP]; Santos, Andre Gonzaga dos; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Cordia verbenacea DC. é uma espécie nativa do Brasil, popularmente utilizada na forma de "garrafadas" para o tratamento contra infecções, úlceras, dores e reumatismos. A erva baleeira consta no Formulário de Fitoterápicos da Farmacopeia Brasileira e integra a Relação de Plantas Medicinais de Interesse do SUS. Estudos preliminares de nosso grupo de pesquisa levaram ao isolamento e identificação de substâncias da espécie e a verificação da atividade antioxidante de extratos. Desta forma, o presente trabalho teve por objetivo averiguar a atividade antioxidante dos metabólitos secundários, e, também, a atividade anti-inflamatória de extratos. Além disso, buscou o desenvolvimento de métodos analíticos que atendessem aos Princípios da Química verde. Apesar do disseminado uso da planta, há pouca informação a respeito de sua toxicidade. Sendo assim, o trabalho também buscou avaliar a embriotoxicidade através do estudo com modelo animal alternativo (zebrafish), abarcando, mais uma vez, os princípios da Química Verde. Do ponto de vista do potencial antioxidante, é sabido que o processo de produção de radicais livres é fisiológico tendo importantes funções metabólicas. No entanto, o estresse oxidativo ocasionado quando a produção das espécies reativas de oxigênio exacerba a capacidade antioxidante do organismo, pode comprometer as biomoléculas e influenciar negativamente a homeostase dos sistemas. Por sua vez, a inflamação é uma resposta fisiológica normal do organismo frente a infecções ou lesões teciduais. Porém, o processo inflamatório pode se relacionar com o estresse oxidativo quando da ativação intensa de células do sistema imune, tal como os neutrófilos. Neste estudo, o extrato etanólico ofereceu uma resposta menos antioxidante na grande maioria dos ensaios realizados, tendo superado a atividade do extrato hidroetanólico apenas no ensaio com ácido hipocloroso. Com relação às flavonas, apenas a substância 1 atingiu valores de CE50 nos ensaios antioxidantes, porém, a mistura das substâncias 1 e 2 (PPt) obteve atividade superior nas avaliações antioxidantes. Os triterpenos não apresentaram atividade antioxidante nas concentrações avaliadas. Na avaliação anti-inflamatória, a cordialina A ofereceu melhor resposta que a flavona (substância 2), principalmente em COX1, e não atingiu os valores de CI50 em sPLA2. Contudo, os valores de inibição da atividade. Do ponto de vista da Química Verde, foi desenvolvido um método por UPLC-UV e um método OLE (online extraction)-UPLC-UV, para análise direta da droga vegetal. Esses métodos desenvolvidos por UPLC-UV e OLE-UPLC-UV foram avaliados através da métrica Agree como mais verdes do que o método HPLC-UV para análise do extrato hidroetanólico, O método UPLC-UV foi validado e foi determinado o teor de ácido rosmarínico no extrato hidroetanólico, sendo equivalente a 6,1% (m/m). O métodos desenvolvidos tinham como destaque o uso de etanol, a redução do tempo de análise e a ausência de preparo de amostra com o uso do OLE. A escassez de dados sobre a toxicidade estimulou a pesquisa por parte deste trabalho e foi observado que ambos extratos levaram a morte e malformações de embriões, sugerindo um cuidado no manejo de estantes e crianças, apesar do ensaio não descarta a necessidade de avaliação de outras concentrações e em outros modelos de estudo.
Avaliação in vitro do potencial antifúngico dos extratos de Achyrocline satureioides (Lam.) D.C. (Asteraceae) e dos metabolitos secundários encapsulados em sistemas de liberação para tratamento de dermatofitose
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-03-31) Córdoba, Maria Angélica Mera; Pietro, Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A planta Achyrocline satureioides (Lam) D.C (Compositae), vem sendo estudada por vários países, devido às evidências sobre suas diferentes propriedades biológicas. No presente estudo foi avaliado o potencial antifúngico dos extratos etanólicos de folhas e flores frente a diferentes cepas dermatofíticas. Ambos os extratos foram capazes de atuar como agentes fungicidas e fungistáticos. O estudo do mecanismo de ação dos extratos, demonstrou que a atividade do extrato de flores provavelmente esteja associada à membrana celular, devido a sua capacidade de inibir e complexar-se a ergosterol. Estes resultados foram concordantes com as imagens obtidas por microscopia confocal, onde foi observada a diminuição de lipídeos neutros nas culturas tratadas com Vermelho do Nilo. A ação do extrato de folhas possivelmente está relacionada frente à parede celular devido ao aumento dos valores das Concentrações Inibitórias Mínimas em presença do estabilizante sorbitol. Através dos ensaios de inibição do radical DPPH• e o cátion radical ABTS+•, foi demonstrado que o extrato de flores possui melhor potencial antioxidante que o extrato de folhas, devido a diferença encontrada nos valores de concentração efetiva. Os ensaios de citotoxicidade in vitro, mostraram que ambos os extratos diminuíram a viabilidade das células HaCat. Adicionalmente, foi demonstrado que o extrato de folhas apresentou citotoxicidade frente às células HepG2 enquanto frente às células A549 não foram evidenciadas alterações na porcentagem da viabilidade celular. Foram analisados também os perfis químicos dos extratos por UPLC-QTOF-MS/MS. Os cromatogramas e espectros revelaram a presença de flavonoides e derivados de fenilpropanoides e ácido quínico. Os compostos maioritários encontrados foram 3-O-metil-quercetina e a quercetina no extrato de flores e o ácido 5-O- cafeoilquínico no extrato de folhas. Foram incorporados quercetina e o ácido 5-O- cafeoilquínico em micropartículas de quitosana e Tween® 80 e em micelas poliméricas sendo comparado o potencial antimicrobiano destas formulações com a atividade antimicrobiana determinada nos extratos brutos. Os resultados mostraram que todos os sistemas apresentaram melhor potencial antifúngico que os extratos, principalmente aqueles onde foi incorporado a quercetina. Através dos ensaios de tape stripping foi demonstrado que as formulações com a quercetina encapsulada, apresentaram melhor capacidade de penetração no estrato córneo que as formulações com ácido 5-O- cafeoilquínico após 2 e 6 horas de tratamento. Extratos de folhas e flores da A. satureioides são agentes fungicidas e fungistáticos frente a diferentes cepas de dermatófitos e a incorporação em micropartículas poliméricas melhorou a atividade antifúngica.
Desenvolvimento de pontos quânticos de Gd3+/ZnO conjugados a pontos quânticos de GCIS/ZnS para imagens multimodais associados à nanocápsulas lipídicas
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-02-09) Silva, Bruna Lallo da; Chiavacci, Leila Aparecida; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Nos últimos anos, o uso de pontos quânticos (PQs) para obter imagens biológicas tem atraído atenção por suas propriedades luminescentes e a possibilidade de incorporar agentes de contraste para serem utilizados em imagens de ressonância magnética. Nessa tese, foram utilizadas diferentes estratégias para o desenvolvimento de PQs objetivando a aplicação no diagnóstico por meio de imagens óticas e de ressonância magnética. Dessa forma, PQs de ZnO e PQs de ZnOGd foram sintetizados pela rota sol-gel. PQs contendo gadolínio-cobre-índio-enxofre e ZnS (GCIS/ZnS) foram sintetizados através de duas rotas de síntese (rota 1 e rota 2). Os PQs de ZnO e ZnOGd foram conjugados com PQs de GCIS/ZnS por meio de um tratamento térmico, resultando em um novo ponto quântico não previamente descrito na literatura. Os PQs foram caracterizados através das técnicas de Microscopia eletrônica de transmissão (MET), espectroscopia na região do infravermelho (FTIR), difração de raios X (DRX), análise termogravimétrica, espectroscopia de absorção na região do ultravioleta-visível (UV-Vis). A avaliação das propriedades fotoluminescentes foi realizada por meio da coleta dos espectros de excitação (PLE) e emissão (PL). Os PQs de ZnOGd-GCIS/ZnS foram associados às automontagens de arginina (Arg) e ferrocifeno (p-54) e às nanocápsulas lipídicas (NCL). Para a associação com as NCL, os PQs foram modificados por Hexadeciltrimetoxisilano (HTMS) para permitir sua dispersão em Labrafac® (triglicerídeos de ácido cáprico-caprílico), constituinte da fase oleosa das NCL, que foram preparadas através do método de inversão de fases. Ainda, uma modificação hidrofílica nos PQs foi realizada usando o 3-glicidiloxipropiltrimetoxisilano (GPTMS) para a dispersão dos PQs em água. As propriedades de imagens tanto dos PQs associados às NCL quanto dos PQs dispersos em água foram avaliadas através de imagens de ressonância magnética e coleta dos espectros de PLE e PL. As propriedades citotóxicas e de captação celular foram determinadas frente às células de fibroblasto embrionário de camundongo (NIH/3T3-ATCC® CRL-1658 ™). Os resultados mostraram que os pós de ZnOGd-GCIS/ZnS tratados termicamente podem ser excitados em diferentes regiões. Dessa forma, os PQs interagem entre si de forma a mudar as propriedades luminescentes tanto do ZnOGd quanto do GCIS/ZnS (rota 1), sendo que o máximo de emissão ficou entre a emissão dos dois PQs separadamente. A associação dos PQs de ZnOGd-GCIS/ZnS com Arg-p54 resultou na perda da luminescência. Diferentes proporções entre ZnOGd e GCIS/ZnS (rota 1) foram incorporadas nas NCL e apresentaram bom contraste nas imagens de ressonância magnética. Os novos PQs desenvolvidos (ZnOGd-GCIS/ZnS), dispersos em água, maioritariamente constituído por ZnOGd (75%), apresentaram menor citotoxicidade quando comparado ao ZnOGd, além de maior captação celular. Ainda, as NCL associadas aos PQs apresentaram maior citotoxicidade e menor captação celular que comparados com os PQs sozinhos. A síntese do GCIS/ZnS foi otimizada (rota 2), resultando em PQs com maior grau de pureza. Após a associação do GCIS/ZnS (rota 2) com os PQs de ZnOGd por meio do tratamento térmico, foram encontradas emissões na primeira janela do infravermelho próximo, chegando até 820 nm, conforme aumentou a proporção de GCIS/ZnS em relação ao ZnO Gd. Essa emissão no infravermelho próximo é mais favorável para imagens biológicas pois tem maior penetração nos tecidos além de ser uma região de emissão que se diferencia da autofluorescência das células. Frente aos resultados apresentados, podemos concluir que os PQs desenvolvidos contendo uma associação entre ZnOGd e GCIS/ZnS por meio do tratamento térmico, tanto dispersos em água quanto associados às NCL, apresentam grande potencial para o diagnóstico simultâneo por imagens de ressonância magnética e imagens de luminescência.
Micropartículas gastrorretentivas de curcumina constituídas por hidroxipropilmetilcelulose e quitosana aplicadas ao tratamento de úlceras gástricas
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-12-17) Souza, Maurício Palmeira Chaves de; Chorilli, Marlus; Bauab, Taís Maria; Meneguin, Andréia Bagliotti; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
As úlceras gástricas são patologias causadas por bactérias ou uso de medicamentos especialmente os antiinflamatórios não esteroidais (AINES), sendo que a falta de tratamento dessa condição pode levar ao agravamento da lesão e até mesmo ao câncer gástrico. A curcumina é um composto natural obtido a partir dos rizomas da planta Curcuma longa e é utilizada na medicina tradicional indiana há muitos séculos. Entretanto, por apresentar baixa solubilidade em meios aquosos, seu uso é limitado. Atrelado a isso, o tratamento de doenças gástricas demanda que o fármaco permaneça em contato com a área, porém o tempo de permanência de formas farmacêuticas convencionais neste órgão é limitado pelo tempo de esvaziamento gástrico, que é de cerca de 2h. Uma estratégia que pode ser utilizada para contornar essas limitações é o uso de um sistema de entrega gastrorretentivo, mucoadesivo e de liberação controlada para o estômago. Nesse sentido, o desenvolvimento de micropartículas poliméricas utilizando polímeros mucoadesivos, capazes de controlar a liberação de fármacos e permitir que essa liberação somente aconteça em meios ácidos, como a hidroxipropilmetilcelulose (HPMC) e a quitosana, pode ser extremamente vantajosa. Assim, o objetivo desse estudo foi desenvolver e caracterizar micropartículas poliméricas constituídas de quitosana e HPMC para veiculação de curcumina e avaliar in vivo o seu potencial antiúlcera. As micropartículas puderam ser selecionadas usando uma metodologia de ‘quality by design”, as quais foram obtidas por meio de geleificação ionotrópica e processo de liofilização. As micropartículas apresentaram forma esférica e exibiam diâmetros entre 620 e 820 µm. A microscopia eletrônica de varredura mostrou que as partículas contendo curcumina possuem grandes poros em seu interior, enquanto aquelas sem curcumina apresentam uniformidade em todo o seu interior. Espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) indicada como as principais regiões de interação polimérica; A difração de raios-X (DRx) foi capaz de mostrar que o processo de microencapsulação levou à amorfização da curcumina. A eficiência de encapsulação foi superior a 50% e as micropartículas liberaram completamente a curcumina após 24h, enquanto as liofilizadas apresentaram maiores taxas de liberação do que as não liofilizadas, o que evidenciou o impacto do processo de secagem. O mesmo comportamento foi observado nos testes de absorção de líquidos. As análises térmicas e gravimétricas mostaram que mudanças na estrutura dos polímeros e do curcumina e confirmaram uma interação polimérica, por meio majoritariamente de ligações de hidrogênio e forças de van der Waals. A análise de mucoadesão mostraram que todas as micropartículas obtidas apresentaram adesão no disco de mucina. E os resultados do estudo in vivo apontam na direção de que esses sistemas são ferramentas promissoras na prevenção de lesões gástricas associadas ao uso de AINES, apresentando índice de gastroproteção semelhante à conferida pelo ao omeprazol. A partir desses resultados, os MPs desenvolvidos podem ser explorados como um sistema de liberação controlada de fármacos com mecanismo duplo, um desencadeado pela presença de ácidos, destinados à liberação gastroespecífica e outro mucoadesivo, com potencial para aplicação em gastroproteção, principalmente em pacientes que fazem uso crônico de AINES.
Avaliação do potencial de carreadores lipídicos nanoestruturados funcionalizados com ácido fólico para incorporação de rapamicina no tratamento do câncer de mama
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-12-10) Rodero, Camila Fernanda; Chorilli, Marlus; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O câncer de mama é o segundo tipo de câncer mais comum no mundo. Dentre os fármacos candidatos à utilização no tratamento deste tipo de câncer tem-se a rapamicina que é capaz de inibir a proteína mTOR, controlando seu crescimento e progressão no ciclo celular. No entanto, é um fármaco lipofílico, sofre sequestro por eritrócitos e dispõe de instabilidade química, fatores que comprometem sua biodisponibilidade. Desta maneira, sua incorporação em carreadores lipídicos nanoestruturados funcionalizados com ácido fólico pode ser uma estratégia interessante, pois este sistema pode proteger o fármaco de possíveis degradações, além de proporcionar ação mais lenta e sustentada. A funcionalização dos carreadores com ácido fólico possibilita a liberação do fármaco no local-alvo mediante ligação com receptores de folato que são expressos em grande quantidade por uma variedade de células tumorais, dentre elas as de mama. Frente ao exposto, o objetivo foi desenvolver e caracterizar carreadores funcionalizados com ácido fólico para incorporação de rapamicina e avaliar o seu potencial no tratamento do câncer de mama. Foram desenvolvidos seis diferentes carreadores, que apresentaram valores de diâmetro hidrodinâmico médio de 97,29±0,79 a 119,05±0,23 nm respectivamente, e valores de potencial zeta de -12,45±0,48 a -28,75±0,16 mV, respectivamente. Todas as formulações apresentaram morfologia esférica e em nanoescala, segundo análises de microscopia eletrônica de transmissão. As analises térmicas apresentam um evento de fusão em 50 ºC, o qual é endotérmico, mostrando um novo composto. A funcionalização do lipídio com ácido fólico foi confirmada por análises de espectrofotometria no ultravioleta visível, por ressonância magnética nuclear e espectroscopia vibracional na região do infravermelho. A quantificação da rapamicina foi realizada por cromatografia liquida de alta eficiência, mostrando estar dentro dos parâmetros requeridos e preconizados pela ANVISA e ICH, apresentando linearidade de R2=0,99, precisão e robustez. Os ensaios de eficiência de encapsulação evidenciaram que o carreador consegue encapsular cerca de 95% do fármaco. O ensaio de liberação evidenciou para os carreadores funcionalizados a liberação de 82% de rapamicina após 16 horas, já o carreador não funcionalizado liberou cerca de 45% do fármaco no mesmo período. Os ensaios in vitro de citotoxicidade evidenciaram que carreadores não apresentaram toxicidade frente às linhagens celulares LEWIS, MCF-7 e MCF10-A. Para o sistema, observou-se IC50 de 84, 176 e 110nM, respectivamente e para a rapamicina livre o IC50 frente às mesmas linhagens celulares foram 81,8, 141 e 95nM, respectivamente. A microscopia confocal evidenciou a internalização celular do sistema incorporada com DiO em linhagens MCF-7 e LEWIS. Os dados de citometria de fluxo corroboram os de microscopia confocal, sugerindo que a internalização da formulação. O modelo alternativo de Caenorhabditis elegans, demonstrou que a formulação não apresenta toxicidade. O modelo xenográfico in vivo de câncer de mama evidenciou que sistema, tanto administrado pela via intravenosa quanto intraperitoneal, no período de 18 dias de tratamento, levou a regressão do tumor, apresentando diferença estatística em relação aos controles. Os resultados sugerem que o carreador contendo rapamicina e funcionalizado com ácido fólico apresenta potencial promissor para o tratamento de câncer de mama.
Avaliação do potencial do ácido gálico encapsulado em Metal-Organic Frameworks funcionalizados com cetuximabe no tratamento do câncer de próstata
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-12-08) Hanck-Silva, Gilmar; Chorilli, Marlus; Frem, Regina Célia Galvão; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O câncer de próstata é uma das mais comuns neoplasias e uma das principais causas de morte relacionadas ao câncer em homens no Brasil e no mundo, constituindo um sério problema de saúde pública, sendo que a agressividade desta neoplasia está relacionada principalmente com a superexpressão do receptor EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor). O ácido gálico (GA), um ácido fenólico natural, tem apresentado vários efeitos biológicos, incluindo atividade anticancerígena, mas seu uso tem algumas limitações principalmente pela alta instabilidade química, levando a uma redução de sua concentração plasmática máxima. Para superar muitos dos problemas de biodisponibilidade, têm-se tornado comum o uso de sistemas de liberação de fármacos (SLF), como as MOFs (Metal-Organic Frameworks), que são polímeros de coordenação inorgânicos porosos sintetizados a partir de íons metálicos e ligantes orgânicos. Neste contexto, vale mencionar as MOFs amorfas (Amorphous Metal-Organic Frameworks), uma subclasse relativamente recente de MOFs construída de maneira bastante semelhante às MOFs convencionais, mas que passam por processos de amorfização físicos ou químicos durante ou após a síntese. Sendo assim, desenvolveu-se uma MOF sintetizada a partir de íons zinco (Zn), um relevante metal e um componente deficiente na próstata acometida pelo câncer, que em seguida foi funcionalizada com cetuximabe (CTX), um anticorpo monoclonal que se liga ao receptor de EGFR, podendo proporcionar a entrega direcionada do GA. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o potencial do GA incorporado em MOFs amorfas funcionalizadas com CTX no tratamento do câncer de próstata. Para tanto, sintetizou-se uma MOF híbrida amorfa na presença do GA (aZIF-GA). Após esta etapa, o material foi funcionalizado com CTX (aZIF-GA/CTX) pelo método de conjugação química com os reagentes EDC-NHS. Os materiais obtidos foram devidamente caracterizados, calculada a quantidade de GA incorporado e liberado nos sistemas desenvolvidos (aZIF-GA e aZIF-GA/CTX), onde verificou-se uma eficiência de carga de 81,2% e uma capacidade de carga de 25,6% para o sistema aZIF-GA e de 75,1% e 23,8% para o sistema aZIF-GA/CTX. Os ensaios de liberação foram realizados no meio PBS, com valores de pH 5.0 e 7.4, apresentando maiores taxas de liberação em pH ácido, 88,16% para o sistema não funcionalizado (aZIF-GA) e 81,60% para o sistema funcionalizado (aZIF-GA/CTX). Os estudos de estabilidade demonstraram que os sistemas aZIF-GA e aZIF-GA/CTX possuem excelente estabilidade em meio aquoso. Os ensaios de viabilidade celular 2D, tanto dos precursores quanto dos sistemas (aZIF-GA e aZIF-GA/CTX), foram avaliados em três linhagens celulares de próstata, uma não tumoral (PNT-2) e duas tumorais (PC-3 e DU-145), mostrando maior seletividade para linhagem PC-3. Os ensaios de viabilidade celular 3D foram realizados na linhagem DU-145 e os esferoides apresentaram uma redução da viabilidade de 2,61× para o sistema aZIF-GA e 8,58× para o sistema aZIF-GA/CTX, quando comparados ao GA livre. Os ensaios de internalização celular demonstraram que a morte celular está diretamente relacionada com as alterações celulares oriundas da presença dos compostos testados e o tempo de exposição. Os resultados sugerem o potencial do sistema desenvolvido para o tratamento do câncer de próstata.
Avaliação da farmacocinética do levofloxacino em equinos e do perfil antibacteriano para construção do regime posológico
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-10-27) Martins Teodoro, Evelin dos Santos [UNESP]; Peccinini, Rosangela Gonçalves [UNESP]; Hussni, Carlos Alberto [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O levofloxacino (LEV) é um antimicrobiano da classe fluoroquinolona, que pode ser eficaz em diversos tratamentos de infecções em equinos envolvendo bactérias Gram-negativas e algumas Gram-positivas. Entretanto, é comum na medicina veterinária, extrapolação empírica dos regimes posológicos humanos, o que pode levar ao uso inadequado do medicamento e contribuir para o desenvolvimento de resistência bacteriana. Com o objetivo de projetar um regime posológico racional, o LEV foi estudado em cavalos (n=6) após administração intravenosa e oral de uma dose única de 4 mg/kg. As concentrações do fármaco no plasma foram determinadas por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) acoplado a um detector de espectrometria de massa. Através de análise compartimental, foram determinados os parâmetros farmacocinéticos. A concentração necessária para inibir 90% dos isolados bacterianos (CIM90) foi avaliada para cepas padrão de bactérias comuns em infecções equinas. Os valores dos índices de eficácia antimicrobiana (ASC/CIM, CMÁX/CIM, T>CIM) foram calculados e usados para determinar regimes de posológicos racionais para bactérias alvo. O clearance do LEV foi 6,86 ± 2,09 mL/min/kg e a meia-vida terminal de 3,84 ± 0,52 horas. A biodisponibilidade absoluta do LEV após administração oral foi de 73 ± 19%. A CIM90 foi de 0,016 μg/mL para E. coli, 0,25 μg/mL para S. aureus e Salmonella spp. e 0,625 μg/mL para P. aeruginosa. Considerando os valores dos pontos de corte dos índices de eficácia, um regime de dosagem de LEV de 4 mg/kg/dia é apropriado para tratar infecções por microrganismos Gram-negativos com CIM90 ≤0,08 μg/mL pela via oral e com CIM90 ≤0,11 μg/mL pela via intravenosa, assim como, tratar infecções por microrganismos Gram-positivos com CIM90 ≤0,21 μg/mL e 0,29 μg/mL pela via oral e intravenosa, respectivamente. Porém, é necessário um regime posológico com doses de 8,95 mg/kg/dia (via oral) e 12,26 mg/kg/dia (via intravenosa) para S. aureus e de 22,38 mg/kg/dia (via oral) e 30,66 mg/kg/dia (via intravenosa) para P. aeruginosa. Concluímos que, devido ao seu amplo espectro de atividade e comportamento farmacocinético favorável, o LEV tem potencial para tratar uma ampla variedade de infecções bacterianas em equinos.
Intervenção farmacêutica em pacientes portadores de HIV com falha na terapia antirretroviral
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2014-11-26) Ortega, Luis do Nascimento; Mastroianni, Patrícia de Carvalho; Planeta, Cleópatra da Silva; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O crescente número de pacientes portadores de HIV com falha na terapia antirretroviral (TARV) é preocupante do ponto de vista da saúde pública, necessitando da equipe multiprofissional cuidados específicos. Com o objetivo de avaliar o impacto de intervenções farmacêuticas (IF) em pacientes portadores de HIV com falha na TARV em um Serviço de Atendimento Especializado foi realizado um estudo com amostra de conveniência, longitudinal não controlado e intervencional, onde foi realizada uma IF educativa e de gestão da terapia medicamentosa individualizada, por período aproximado de um ano. Em 31 pacientes foram realizadas 253 intervenções, destas 161 foram educativas, 65 de gestão da terapia e cinco encaminhamentos para outros profissionais de saúde. Outras 11 intervenções com os médicos, sobre os potenciais riscos de interações medicamentosas e de prováveis eventos adversos. Após a intervenção, seis pacientes começaram a retirar regularmente os medicamentos na farmácia (p=0,0313), 12 melhoraram a adesão (p=0,0020), em 18 a TARV tornou-se efetiva (p=0,0020) e 15 melhoraram o seu estado imunológico (p=0,002). O aumento do conhecimento sobre a doença e a farmacoterapia (p=0,0133) melhorou a adesão, reduziu a carga viral e aumentou a contagem de CD4+. Houve diferença na qualidade de vida geral (SF36): capacidade funcional (p=0,0017), aspectos físicos (p=0,0247), dor (p=0,0271), vitalidade (p=0,0308), aspecto social (p=0,0185) e emocional (p=0,0300) e na qualidade de vida específica (HAT-QoL): preocupação financeira (p=0,0118), com a medicação (p=0,0298) e muito próximo da significância estatística, satisfação com a vida (p=0,0538) e o sigilo (0,0534). O estudo mostrou-se custo-efetivo para redução de internações hospitalares, com uma economia de R$ 19,43 por paciente por ano. O profissional de saúde deve se encarregar da gestão da farmacoterapia e a responsabilidade com o cuidado do paciente deve ser constante. A IF com pacientes portadores de HIV com falha na TARV, por período de um ano, infectados há mais de 10 anos e em TARV até quatro anos, proporcionou um maior conhecimento sobre a doença e o tratamento, melhorou a adesão, reduziu os problemas relacionados aos medicamentos e os resultados negativos da medicação, promoveu uma maior efetividade terapêutica, melhorou a qualidade de vida e reduziu as internações hospitalares
Abordagem integrada de metodologias in vitro e in silico para avaliação da segurança de conservantes antimicrobianos utilizados em cosméticos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-08-17) Corrêa, Gabriela de Oliveira Prado; Isaac, Vera Lucia Borges; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Os cosméticos, assim como outros produtos que contêm água e compostos orgânicos/inorgânicos, exigem proteção contra a contaminação microbiológica, sendo de grande importância o uso de conservantes antimicrobianos, para prolongar a vida útil dos produtos e garantir a segurança do consumidor. A avaliação de segurança dos cosméticos é, geralmente, determinada a partir do conhecimento da toxicidade dos ingredientes e da compatibilidade dos produtos com a pele. A combinação de métodos in vitro e in silico, além de aplicável à área cosmética, vem ganhando maior espaço na avaliação de parâmetros toxicológicos. Deste modo, o objetivo desse trabalho foi avaliar a segurança dos conservantes propilparabeno (PP), metilparabeno (MP), fenoxietanol (FE), mistura de metilcloroisotiazolinona e metilisotiazolinona (CMI/MI), DMDM hidantoína (DMDMH), imidazolidinil ureia (IMU), dehidroacetato de sódio (SD), álcool benzílico (BA), cloreto de benzalcônio (BAC), caprilil glicol (CG), benzoato de sódio (SB) e etilhexilglicerina (EEG) por meio de uma abordagem integrada de métodos in vitro e in silico. Foram realizados testes in vitro de citotoxidade e avaliação do potencial de irritação ocular, análise in silico dos desfechos de sensibilização da pele, fototoxicidade, toxicidade oral aguda, carcinogenicidade, mutagenicidade, genotoxicidade e atividade endócrina. Os resultados obtidos foram plotados em uma matriz toxicológica para a avaliação do perigo, na qual os conservantes foram classificados em níveis de toxicidade definidos como baixo (B) e alto (A). Na avaliação da exposição, foi estabelecida a concentração máxima segura e a caracterização do risco, que permitiram a integração dos dados e uma conclusão de segurança. Considerando a abordagem de avaliação do perigo, os desfechos mais preocupantes, nos quais grande parte dos conservantes receberam classificação de nível alto de toxicidade, foram a irritação da pele (PP, MP, FE, CMI, MI, DMDMH, IMU, BAC, CG e EEG), sensibilização da pele (MP, FE, CMI, MI, DMDMH, IMU, SD e BA) e toxicidade oral aguda (FE, CMI, MI, DMDMH, SD, BA e BAC). Na avaliação da exposição, apenas dois conservantes (SB e EEG) ficaram com a margem de segurança (MoS) abaixo de 100; contudo, reduzindo a concentração utilizada foi possível chegar em uma concentração segura. Considerando os ensaios realizados, é necessária uma abordagem holística que englobe os resultados obtidos in vitro e in silico, pois dados isolados não configuram uma avaliação de segurança. Apesar dos desafios na utilização de métodos in silico, a abordagem integrada de testes proposta permitiu a robustez na avaliação da segurança. Os conservantes antimicrobianos estão presentes em praticamente todos os produtos; portanto, as substâncias que tenham potencial para causar qualquer efeito adverso, devem ser incorporadas, nos cosméticos, em condições consideradas seguras, para garantir a integridade da saúde humana.
Estudo do potencial antioxidante e antiglicação de Siolmatra brasiliensis (cogn.) Baill. em sistema-modelo de estresse glico-oxidativo in vitro em soro sanguíneo
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-02-26) Kaga, Anderson Kiyoshi; Baviera, Amanda Martins; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O diabetes mellitus é uma síndrome metabólica caracterizada por deficiência na produção e/ou ações da insulina, culminando em hiperglicemia crônica, a qual encontra-se associada ao desenvolvimento das complicações diabéticas. A hiperglicemia contribui para os processos de glicação proteica e de formação dos produtos finais de glicação avançada (AGEs). Dentre as substâncias que contribuem para a formação dos AGEs, destacam-se os compostos dicarbonílicos, incluindo o metilglioxal. O metilglioxal (MGO) é capaz de reagir com resíduos de aminoácidos em proteínas presentes em domínios funcionais, culminando em perda de função. Sistemas-modelo de modificações glico-oxidativas in vitro mimetizam os impactos negativos da hiperglicemia sobre biomoléculas. A maioria dos estudos que empregam sistemas-modelo de glicação in vitro utilizam proteínas isoladas, poucos são os estudos com matrizes complexas, incluindo o soro sanguíneo humano. Estudos são necessários para padronização de sistemas-modelo de modificações glico-oxidativas in vitro com soro sanguíneo humano, com vistas em sua utilização para o screening de compostos bioativos ou preparações com potencial antiglicação e/ou anti-AGE. Estudos têm demonstrado a atividade antidiabética de preparações do caule de Siolmatra brasiliensis (Cogn.) Bail, uma espécie nativa do Cerrado e Pantanal brasileiros. Recentemente, demonstrou-se que preparações dessa planta também possuem atividade antiglicação, pois foi capaz de diminuir marcadores do estresse glico-oxidativo em sistema-modelo de glicação proteica in vitro (albumina sérica bovina incubada com glicose). O objetivo deste estudo foi avaliar as alterações em biomarcadores do estresse glico-oxidativo em sistema-modelo de modificações glico-oxidativas in vitro em soro sanguíneo humano, incubado na presença de metilglioxal, e na ausência ou presença de extrato hidroetanólico ou fração clorofórmica ou fração acetato de etila do caule de Siolmatra brasiliensis, ou de substância isolada, a naringenina. Foram realizados quatro experimentos utilizando amostras de soro controle de origem humana: (I) sistema-modelo de glicação in vitro na presença de glicose, no qual o soro sanguíneo humano foi incubado a 37ºC por 40 dias, e avaliadas as atividades de enzimas antioxidantes (catalase e paraoxonase), níveis de biomarcadores de peroxidação lipídica (substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico), níveis dos grupos carbonilas em proteínas, estimativa de AGEs fluorescentes e estudo de modificações estruturais em proteínas; (II) sistema-modelo de modificações glico-oxidativas in vitro na presença de MGO, para padronização da melhor concentração de MGO a ser utilizada, no qual soro sanguíneo humano foi incubado a 37ºC por 48 horas na presença de MGO nas concentrações de 5, 10 e 20 mM, e em diferentes tempos monitorou-se os AGEs fluorescentes e a presença de modificações estruturais em proteínas; (III) sistema-modelo de modificações glico-oxidativas in vitro na presença de MGO e avaliação dos efeitos do extrato, fração e substância isolada de caule de Siolmatra brasiliensis, no qual soro sanguíneo humano foi incubado a 37ºC por 48 horas na presença de 10 mM de MGO, e na ausência ou presença de distintas concentrações de extrato hidroetanólico (SbExt) ou fração clorofórmica (SbCHCl3) do caule de Siolmatra brasiliensis, ou de substância isolada, a naringenina (NAR); em diferentes tempos foram monitorados os níveis de diversos marcadores bioquímicos, formação de AGEs fluorescentes, formação de produtos de oxidação dos resíduos de triptofano e tirosina, níveis de grupos carbonil em proteínas (PCO), análise de modificações estruturais em proteínas e as atividades arilesterase e lactonase da paraoxonase 1. (IV) sistema-modelo de modificações glico-oxidativas in vitro na presença de MGO e avaliação dos efeitos da fração acetato de etila do caule de Siolmatra brasiliensis, no qual soro sanguíneo humano foi incubado a 37ºC por 48 horas na presença de 10 mM de MGO, e na ausência ou presença de distintas concentrações da fração acetato de etila (SbAcE) do caule de Siolmatra brasiliensis; em diferentes tempos foram monitorados os níveis de diversos marcadores bioquímicos, formação de AGEs fluorescentes, formação de produtos de oxidação dos resíduos de triptofano e tirosina, níveis de grupos carbonil em proteínas (PCO), análise de modificações estruturais em proteínas e atividades arilesterase e lactonase de paraoxonase 1. Em (I) foi possível observar aumento gradual na intensidade de fluorescência dos AGEs, modificações na estrutura de proteínas, aumento progressivo nos níveis de PCO no decorrer do tempo de incubação de soro na presença de glicose, as quais foram atenuadas na presença de aminoguanidina (agente protótipo anti-AGE). Em (II) o sistema-modelo de modificações glico-oxidativas in vitro contendo soro + MGO apresentou perfil de resposta de concentração dependente na geração de AGEs fluorescentes e modificações na estrutura de proteínas. Em (III e IV) SbExt, NAR e SbAcE foram capazes de diminuir a formação de AGEs nas incubações contendo soro + MGO, bem como também diminuíram a formação dos produtos de oxidação dos resíduos de triptofano e tirosina, enquanto SbCHCl3 não foi eficiente. Na análise de modificações do padrão de separação eletroforetica de proteínas em soro + MGO, SbExt, SbCHCl3, NAR e SbAcE não se mostraram eficazes, bem como nas atividades arilesterase e lactonase de PON 1. Neste estudo foi possível observar que, o sistema-modelo de glicação in vitro de soro sanguíneo na presença de metilglioxal é mais severo em comparação ao sistema-modelo na presença de glicose. O extrato hidroetanólico de caule de Siolmatra brasiliensis e narigenina, uma das substâncias isoladas a partir dessa espécie, bem como o a fração acetato de etila, parecem atenuar eventos glico-oxidativos que ocorrem em fases mais avançadas.
Avaliação acaricida de derivados naturais de Achyrocline satureioides e de Schinus lentiscifolius em associação com produtos biotecnológicos obtidos de fungos entomopatogênicos sobre o carrapato do boi Rhipicephalus (Boophilus) microplus
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-03-29) Fantatto, Rafaela Regina; Pietro, Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues; Chagas, Ana Carolina de Souza; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Apesar da importância social e comercial da bovinocultura, infestações por ectoparasitas, como o carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus, apresentam-se como um grande empecilho econômico. O controle atualmente é realizado por meio de carrapaticidas sintéticos e o seu uso indiscriminado tem contribuído para o surgimento da resistência dos parasitas à maioria das moléculas disponíveis. Assim, alternativas efetivas, economicamente viáveis e potencialmente seguras devem ser investigadas, como o uso de derivados naturais associados a fungos entomopatogênicos. Esse estudo avaliou extrativos vegetais de Achyrocline satureioides (Lam) D.C. e Schinus lentiscifolius (March.) D. C., associados e não associados ao fungo entomopatogênico Beauveria bassiana, bem como à enzima quitinase por ele produzida, sobre diferentes estágios do ciclo de vida do carrapato do boi R.(B.) microplus. A atividade carrapaticida dos extratos vegetais, do fungo, das associações dos mesmos e quitinase, foi analisada por testes in vitro tais como o teste de imersão de fêmeas ingurgitadas, teste de contato em papel impregnado e teste de imersão de larvas. Os resultados obtidos demonstraram que os extrativos, quando associados ao fungo tem sua ação potencializada chegando a atingir 100% de mortalidade sobre larvas. Outro fator relevante é que o teste de imersão de larvas permite uma melhor avaliação dos produtos analisados, devido ao tempo que fica em contato com as larvas. Frente às fêmeas ingurgitadas os resultados não foram significativos devido ao tempo que o fungo necessita para agir e com isso não foi possível interromper o ciclo. A utilização de quitinase sobre larvas não apresentou mortalidade superior à utilização de extratos sendo apenas efetiva quando o tratamento consistiu de associação de partição hexânica de A. satureioides e enzima. Os resultados obtidos com as espécies vegetais associados ao fungo são considerados promissores e abrem novas perspectivas de estudos.
Disposição cinética e atividade anti-inflamatória in vitro de diterpenos clerodânicos de Casearia sylvestris Swartz e de seus produtos de degradação
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-06-28) Oda, Fernando Bombarda; Santos, Andre Gonzaga; Moraes, Natália Valadares; Peccinini, Rosângela Gonçalves; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Os diterpenos clerodânicos do tipo das casearinas são marcadores ativos (ações anti-inflamatória e antiulcerogênica) das folhas da planta medicinal Casearia sylvestris Sw. (guaçatonga). Entretanto, os dados farmacocinéticos para avanço nas pesquisas envolvendo essas substâncias são escassos. Assim, foram realizados ensaios in vitro para compreender a absorção oral e biotransformação desses diterpenos. Os diterpenos caseargrewiina F (casg F) e casearina B (cas B) foram submetidos à degradação gástrica simulada (FGS) e ao metabolismo por microssomas hepáticos de humanos. Os produtos foram identificados por LC-DAD/UV, LC-MS, UPLC-QTOF-MS/MS e RMN. Foram determinadas propriedades físico-químicas e biológicas dos dois diterpenos: log P (LC-UV), estabilidade química, estabilidade em plasma, ligação a proteínas plasmáticas e microssomais e cinética enzimática usando microssomas. Esses dados foram utilizados nos modelos farmacocinéticos baseados na fisiologia (PBPK) para simulação do perfil farmacocinético. Os parâmetros da cinética enzimática velocidade máxima (Vmax), KM (constante de Michaelis-Menten), e clearance intrínseco in vivo (Cl’int) da casg F e cas B foram usados para estimar o clearance hepático (ClH). Para isso, métodos analíticos e bioanalíticos de quantificação (LC-MS) foram desenvolvidos e validados de acordo com as normas da Agência Nacional de Vigilância Sanitária e Agência Europeia de Medicamentos. Os dois diterpenos apresentaram maior instabilidade (p < 0,05) em fluído gástrico simulado (pH 1,2), seguido do tampão TRIS (pH 8,8) e Hank’s (pH 7,4). A casg F e a cas B foram estáveis em plasma (p < 0,05) até 60 e 270 min de incubação, respectivamente. Nos ensaios de metabolismo in vitro o decaimento de ambos diterpenos não foi influenciado pela ausência do sistema regenerador de NADPH. O decaimento foi inibido (p < 0,05) na presença de NaF (200 mM), inibidor de esterases, sugerindo que o metabolismo hepático e das enzimas plasmáticas da casg F e cas B é dependente de esterases. A ligação da casg F a proteínas plasmáticas e microssomais foi de 74,0 e 77,2%, respectivamente, e da cas B foi de 86,7 e 87,4%, respectivamente. Os produtos de degradação ácida majoritários da casg F e cas B foram os seus respectivos dialdeídos, que constituíram mais de 50% dos produtos (normalização das áreas dos picos; LC-DAD/UV). Ambos diterpenos e seus dialdeídos apresentaram log P de 3,6 a 4,0, o que sugere boa permeabilidade celular. Os diterpenos apresentaram perfil cinético de Michaelis-Menten, sendo que a Vmax da casg F foi 2 vezes maior do que a da cas B. O KM da casg F (66,4 ± 6,5 μM) foi próximo ao da cas B (61,4 ± 5,1 μM), indicando que a afinidade aparente das enzimas microssomais humanas por ambos diterpenos é semelhante. A extrapolação in vitro-in vivo resultou em ClH da casg F e cas B (19,6 e 19,2 mL/min/kg, respectivamente), portanto ambos foram considerados compostos de alta razão de extração hepática (98,0 e 96,0 %, respectivamente). Os resultados demonstraram que a casg F é mais suscetível à degradação química do que a cas B, mas ambas possuem similar susceptibilidade à metabolização por microssomas hepáticos de humanos. Assim, pode-se inferir que a biodisponibilidade oral dos dois diterpenos é reduzida em razão da extensa degradação gástrica e da elevada fração metabolizada na passagem pelo fígado. Os modelos de PBPK indicam que os diterpenos apresentam diferente disposição cinética em humanos. Os diterpenos e seus produtos de degradação exerceram baixa inibição (< 50%) da COX-1, COX-2 e sPLA2. A via de ação anti-inflamatória dos diterpenos provavelmente não está envolvida com essas enzimas.
Variantes genéticas e fatores associados ao risco de hemorragia digestiva alta: um estudo de caso-controle
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-05-07) Forgerini, Marcela [UNESP]; Mastroianni, Patricia de Carvalho [UNESP]; Herdeiro, Maria Teresa; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
INTRODUÇÃO: A hemorragia digestiva alta secundária à doença péptica complicada (HDA) é uma emergência digestiva associada à alta morbimortalidade e é considerada uma reação adversa a medicamento grave. A presença de variantes genéticas tem sido sugerida como um importante fator de risco para HDA, principalmente em genes envolvidos no metabolismo de medicamentos e em mecanismos fisiológicos de agregação plaquetária e proteção gástrica. OBJETIVO: Investigar a associação de variantes genéticas nos genes PTGS1, NOS3, CYP2C9, VKORC1 e ABCB1 e o risco de HDA. METODOLOGIA: Foi conduzido um estudo caso-controle pareado por gênero e idade (±5 anos) no complexo hospitalar do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Caso: pacientes com diagnóstico de HDA confirmado mediante endoscopia digestiva alta (EDA) ou intervenção cirúrgica. Controle: pacientes submetidos à cirurgia leve não relacionadas à problemas gastrointestinais. Os dados foram coletados por meio de entrevistas e coleta de sangue (5 mL). Variável dependente: HDA. Variável independente: variante genética. Variáveis de confusão: etnia, escolaridade, índice de massa corpórea, histórico familiar de úlcera, histórico pessoal de doenças gastrointestinais (úlcera, hemorragia, dispepsia), sorologia para Helicobacter pylori, comorbidades, farmacoterapia em uso, hábitos de vida (tabaco, álcool e café) e consistência da entrevista. Foi proposta a análise dos seguintes genes e variantes: PTGS1 (rs1330344, rs3842787, rs10306114, rs5788), NOS3 (rs2070744, rs1799983 e repetição em série de número variável (VNTR) no íntron 4 da eNOS), CYP2C9 (rs1057910 e rs1799853), VKORC1 (rs9923231) e ABCB1 (rs1045642). A genotipagem foi conduzida por meio da reação em cadeia da polimerase em tempo real com o ensaio TaqPath ProAmp (AppliedBiosystems, Foster City, USA) e a determinação da VNTR no íntron 4 da eNOS por meio da reação em cadeia da polimerase e análise de fragmentos (ABI3130, AppliedBiosystems, Foster City, USA). A sorologia por Helicobacter pylori foi determinada por concentração de IgG no plasma dos participantes, por meio da técnica de quimiluminescência. Os dados da entrevista, análise genética e laboratorial foram digitados na plataforma Research Electronic Data Capture. Como controle de qualidade, a frequência genotípica das variantes genéticas foi avaliada por meio do Equilíbrio de Hardy-Weinberg. Análise estatística: modelos de regressão logística não condicional (programa SPSS). RESULTADOS: Foram elegíveis 200 casos e 706 controles, sendo a maioria do gênero masculino [grupo caso: 145 (72,5%) e grupo controle: 512 (72,5%)], autodeclarados brancos [grupo caso: 134 (67,3%) e grupo controle: 516 (73,5%)] e com média de idade de 60,2 (±16,3) e 59,8 (±15,8) anos, respectivamente. A frequência de admissões hospitalares por HDA foi de 7,1% e estima-se que sete a cada cem pacientes submetidos à EDA foram diagnosticados com HDA. Todas as variantes atenderam ao Equilíbrio de Hardy-Weinberg. Foram identificados seis polimorfismos de nucleotídeo único (rs1330344, rs10306114, rs2070744, rs1799983, rs1045642 e rs9923231) e VNTR no íntron 4 da eNOS que podem modificar a magnitude de risco de HDA em usuários de ácido acetilsalicílico. Quando foram considerados os usuários de antiinflamatório não esteroidal, as onze variantes genéticas avaliadas neste estudo foram associadas ao risco de HDA. Como fatores de risco independentes para HDA foram identificadas as variáveis: histórico pessoal prévio de úlcera (p-valor: < 0,001); sorologia reagente para Helicobacter pylori (p-valor: 0,029); uso de anticoagulantes (p-valor: < 0,001), ácido acetilsalicílico (p-valor: < 0,001) e antiinflamatórios não esteroidais (p-valor: < 0,001); consumo > 15 cigarros/dia (p-valor: < 0,001) e consumo de > 30 gramas de álcool/dia (p-valor: < 0,001). CONCLUSÃO: Trata-se de um estudo inédito na população brasileira e que contribui com a análise de três variantes inéditas no escopo da HDA: rs1330344 (PTGS1), rs2070744 (NOS3) e rs1045642 (ABCB1). Os nossos achados evidenciam que a presença das variantes genéticas avaliadas pode modificar a magnitude do risco de HDA em usuários de ácido acetilsalicílico e/ou de anti-inflamatórios não esteroidais, além de outras variáveis de risco independente para HDA. Por fim, os nossos achados sugerem a necessidade de uma terapia individualizada, considerando o monitoramento do uso de medicamentos e identificação de fatores prévios de risco para HDA a fim de promover a segurança do paciente.
Sistemas multifuncionalizados empregando nanopartículas de quitosana ancoradas com metotrexato e incorporadas em micropartículas baseadas em amido resistente/pectina como estratégia para liberação cólon-específica do 5- fluorouracil como potencial para o tratamento do câncer colorretal
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2019-07-30) Santos, Aline Martins dos; Gremião, Maria Palmira Daflon; Ferreira, Miziara Barboza Ferreira; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
5-fluorouracil (5-FLU) e metotrexato (MTX) são utilizados no tratamento do câncer colorretal (CC), no entanto, sua eficácia clínica é limitada devido à falta de especificidade, levando a efeitos colaterais graves. Neste sentido, nanopartículas (NPs) baseadas em quitosana (QS), encapsuladas com 5-FLU e funcionalizadas com MTX, bem como a incorporação dessas NPs em micropartículas (MPs) de amido resistente e pectina (AR/P) para administração oral foram delineadas visando alcançar a liberação direcionada, e aumentar a concentração local do fármaco no cólon e/ou região tumoral. O método de geleificação ionotrópica utilizando tripolifosfato (TPP) como reticulante foi eficiente na obtenção de NPs de QS/TPP/5-FLU, as quais apresentaram diâmetro médio entre 122,2 a 155,0 nm, com índice de polidispersão (PDI) entre 0,24 e 0,35, valor de potencial zeta (acima de +21 mV) e forma esférica. A eficiência de encapsulação (EE) do 5-FLU nestas NPs variou entre 12,24 a 23,58%, demonstrando que a amostra com maior proporção de QS (4:1:1 QS/TPP/5-FLU) promoveu maior EE. A QS foi conjugada com sucesso ao MTX, e o teor do MTX obtido para as amostras QS-MTX-1; QS-MTX-2 e QS-MTX-3 foi de 16,92, 27,52 e 30,89%, respectivamente. As NPs funcionalizadas com MTX apresentaram diâmetro médio entre 376,4 e 407,8 nm, com valores de PDI entre 0,38 e 0,41 e potencial zeta entre +31,6 e +26,3 mV, demonstrando uma redução na EE do 5-FLU (15,71-18,23%). Ensaios de mucoadesão demonstraram que as NPs de QS/TPP sem e com adição de 5-FLU apresentaram maior capacidade mucoadesiva comparadas as NPs funcionalizadas com MTX, as quais promoveram uma redução nos valores de potencial zeta, indicando uma menor adsorção de mucina à superfície dessas NPs. As NPs de QS/TPP com e sem 5-FLU foram encapsuladas em MPs de AR/P usando o método de geleificação ionotrópica por gotejamento manual e/ou aerossolização, e as MPs carregadas com NPs apresentaram diâmetro médio acima de 800 µm e 10 µm, respectivamente. A forma esférica das MPs e a eficiência de incorporação das NPs nas MPs foram confirmadas em ambos os métodos. Os estudos de liberação in vitro do 5-FLU demonstraram que a encapsulação das NPs em MPs de AR/P promoveu um maior controle das taxas de liberação do 5-FLU, com redução significativa em meio ácido (53%). NPs de QS foram marcadas com sucesso usando o fluoróforo Cy5 para sua monitorização usando imagens ópticas multiespectrais em camundongos. Nos ensaios de biodistribuição in vivo, as NPs QS-Cy5 apresentaram uma distribuição mais rápida ao longo do trato gastrointestinal (TGI), ou seja, um tempo de trânsito mais curto em comparação com as MPs carregadas com NPs. Além disso, as NPs QS-Cy5 mostraram absorção não específica na corrente sanguínea com acúmulo no rim, enquanto que para as MPs carregadas com NPs não foi observado acúmulo significativo no sangue ou nos principais órgãos, indicando que a encapsulação das NPs em MPs de AR/P resultou em uma maior proteção das NPs ao longo do TGI após a administração oral. Portanto, o conjunto de resultados sugere que as MPs de AR/P são potenciais carreadores para a liberação de NPs carregadas de fármaco ao cólon e este trabalho contribuirá para o desenvolvimento de sistemas orais para o tratamento do CC.

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