Dissertações - Biotecnologia - IQ

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Estudos computacionais de complexo de cobre e paládio II com potencial atividade anticâncer envolvendo a topoisomerase II alfa e as catepsinas B e L
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-07-28) Buanar, Hilário Moniz; Nascimento Júnior, Nailton Monteiro do [UNESP]; Farias, Renan Lira de; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Câncer é considerado umas das principais causas de morte em todo mundo. Conjunto de doenças que faz referência a características comuns, a metástase e a angiogênese. Embora haja uma produção de medicamentos para esta doença, existe baixa seletividade celular por parte dos fármacos comercializados para o tratamento. Com vista a encontrar soluções para o tratamento do câncer, surge a oportunidade de explorar novos complexos inorgânicos, que apresentem seletividade frente as células tumorais. Os complexos de cobre contendo subunidades da tiossemicarbazona e complexos de paládio com subunidades bipiridina e fenantrolina têm sido estudas por possuírem várias aplicações na Química Medicinal. Neste sentido foram ancoradas 32 substâncias para os sítios ativos das catepsinas B e L, assim como para os sítios do etoposídeo e ATP da topoisomerase II alfa. As enzimas proteolíticas como catepsinas (B e L) são ativamente envolvidas em etapas importantes da formação da célula tumoral, enquanto a enzima da topoisomerases II alfa é alvo, devido ao seu papel importante no gerenciamento da estrutura do DNA, em células tumorais, estas proteínas (catepsnia B e L assim como topoisomerase II alfa), são altamente expressas. Inicialmente, foi realizada a validação de modelos in silico para as catepsinas (B e L), visto que, a validação dos sítios do ATP e do etoposídeo haviam sido feitos num outro trabalho pelo nosso grupo de pesquisa. Assim, os resultados da redocagem molecular, possibilitaram analisar as interações dos ligantes com os resíduos de aminoácidos do sítio ativo, onde foi possível verificar sistematicamente interação dos resíduos de aminoácidos, Q23, G27, C29, W30, G73, G74, A173 e G198, do sítio da catepsina B, e a mesma análise foi feita nos resultados do sítio ativo da catepsina L, onde foi possível verificar interação do ligante com os resíduos de aminoácidos de Q19, C25, W26, G61, G67, G68, L69, A135, M161, D162, H163 e A214. Os resultados no sítio ativo do etoposídeo demonstraram interações com os resíduos de Y805, M766 e M762, enquanto no sítio do ATP foram verificadas interações com os resíduos de K378 e N150.
Análogos de Histatina 5 complexados com íons metálicos de prata como alternativa para o combate a Candida albicans
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-02-27) Zolin, Gabriela Vieira Silva; Garrido, Saulo Santesso [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A Candida albicans é principal causadora de infecções fúngicas. As limitadas classes de medicamentos disponíveis para o tratamento das infecções, assim como seu uso excessivo, potencializam o surgimento de resistência aos medicamentos. Peptídeos antimicrobianos (AMPs) foram identificados em diversos organismos e possuem diversas estruturas e funções, como atividades antimicrobianas e imunomoduladoras, e são candidatos promissores para o desenvolvimento de novos medicamentos antifúngicos. A histatina 5 é um AMP encontrado na cavidade oral, que possui a mais alta atividade antifúngica contra C. albicans, incluindo cepas resistentes aos agentes antifúngicos mais comumente usados. A atividade do peptídeo, porém, pode sofrer interferências na cavidade oral, bem proteólise mediada ou não pela C. albicans. Adaptações na estrutura do peptídeo, como o uso de fragmentos proteolíticos e a troca de resíduos de aminoácidos, foram empregados visando uma maior eficiência da ação antimicrobiana do peptídeo, bem como a redução da proteólise. O trabalho também propôs a coordenação dos peptídeos com íons metálicos de prata, como uma alternativa para o desenvolvimento de agentes antifúngicos. O uso de fragmentos bioativos contendo a porção C-terminal da Hst5 demonstraram atividade antifúngica otimizada em relação ao peptídeo original, e a troca de fragmentos de lisina por arginina foi capaz de aumentar a eficiência dos fragmentos proteolíticos. Os compostos de coordenação foram formados entre os peptídeos e Ag(I) na proporção molar 1:1, como comprovado pelos estudos de supressão de fluorescência e espectrometria de massas. Além disso, foi possível observar uma mudança na conformação dos peptídeos quando coordenados com Ag(I), perdendo a tendência de α-hélice, indicando uma associação na parte central das moléculas, pelas cadeias laterais dos resíduos de histidina. Os compostos de coordenação apresentaram forte ação antifúngica quando comparados aos peptídeos isolados, chegando a concentrações inibitórias mínimas de 10 e 20 μmol L-1 em diferentes cepas de C. albicans. Os peptídeos e compostos de coordenação foram avaliados quanto sua toxicidade, e apresentaram margem de segurança para uso como tratamentos antifúngicos em suas concentrações inibitórias mínimas.
Investigação biológica e química dos fungos endofíticos isolados de Galianthe thalictroides com atividade antagônica frente ao fitopatógeno Sclerotinia sclerotiorum
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-02-24) Nunes, Emanuel Victor dos Santos; Gamboa, Ian Castro; Teles, Helder Lopes; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O fungo Sclerotinia sclerotiorum, causador da doença popularmente conhecida como “mofo branco”, é um dos fitopatógenos mais devastadores da área agrícola, afetando colheitas de feijão, amendoim e soja, e causando milhões de dólares em danos no mundo inteiro. A técnica mais comum de manejo do S. sclerotiorum ocorre através do emprego extensivo de produtos químicos potencialmente danosos ao meio ambiente e à saúde humana, o que aumenta a demanda por formas alternativas de controle. Uma das alternativas em desenvolvimento é o emprego de metabólitos de fungos endofíticos, microrganismos que habitam naturalmente o interior dos tecidos vegetais, de forma assintomática, e se apresentam como promissores na produção de novos antibióticos naturais e outros metabólitos com interesse biotecnológico. O presente trabalho avaliou o antagonismo de fungos endofíticos associados à espécie vegetal Galianthe thalictroides, uma planta medicinal do pantanal sul-mato-grossense, frente ao S. sclerotiorum. A linhagem identificada como Penicillium javanicum (GTB-10) inibiu o crescimento do fitopatógeno em 72% em triagem por antibiose em co-cultura e foi investigada quimicamente utilizando a abordagem OSMAC (One Strain Many Compounds), técnicas de metabolômica global por CL-EM/EM, e atividade antifúngica dos extratos AcOEt. Análises metabolômicas permitiram a anotação de 14 substâncias, incluindo estatinas como a mevastatina e dihidromevastatina, a 2,5-dicetopiperazina felutanina A, e a isoflavona daidzeína. Análises estatísticas permitiram avaliar que o meio de cultura foi a variável com a maior contribuição para a variação metabólica, e ainda indicou as estatinas como agentes da atividade antifúngica contra o S. sclerotiorum. Esse foi o primeiro estudo de fungos endofíticos isolados da espécie vegetal G. thalictroides, e os resultados corroboram o potencial biotecnológico de endófitos de plantas medicinais do Pantanal.
Estudos de caracterização da proteína NPF, um homólogo da proteína p55 de Drosophila, presente em complexos de remodelagem de cromatina em Neurospora crassa em condições de estresse
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-01-12) Orives, Karina Gabrielle Resges; Freitas, Fernanda Zanolli [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Torna-se cada vez mais evidente que modificações covalentes introduzidas em cromatinas, tais como a metilação de resíduos de aminoácidos específicos em proteínas histonas, podem afetar profundamente as funções dos genomas de diferentes organismos. O complexo PRC2, composto por proteínas Polycomb, é um regulador que em plantas, animais e fungos, trimetila o resíduo de lisina 27 da histona H3 (H3K27me3), levando a cromatina a um estado transcricional reprimido. Embora ausente nas leveduras, os componentes centrais do complexo PRC2 são bastante conservados e em Neurospora crassa são representados pelas proteínas SET-7, EED, SU(Z)12, e NPF. Utilizando uma abordagem proteômica para encontrar o fator de transcrição modulando negativamente a expressão do gene gsn durante o estresse térmico, nosso grupo encontrou entre vários candidatos, a proteína NPF do complexo PRC2, sugerindo um papel para a mesma na resposta ao estresse térmico. Considerando que a repressão da expressão gênica mediada por H3K27me3 é ainda bastante desconhecida em fungos, e que inicialmente NPF foi descrita estar relacionada ao estresse térmico, aproveitamos o sistema relativamente simples de N. crassa para explorar possíveis relações entre NPF-PRC2 e decifrar algumas das respostas adaptativas do fungo a diferentes formas de estresse. Para isto, analisamos inicialmente o comportamento de uma linhagem do fungo nocauteada no gene npf (Δnpf) após exposição a várias condições estressantes, tais como alta temperatura (45° C), valores de pH ácido (4,5) e alcalinos (7,2 e 7,8), alta osmolaridade (sorbitol e NaCl), agentes oxidantes (menadiona, H2O2 e paraquat) e altas concentrações de íons cálcio, tendo como controle a linhagem mutante genotipicamente recuperada e como background a linhagem selvagem do fungo. Nossos resultados demonstraram que a linhagem Δnfp possui um fenótipo defectivo durante o crescimento vegetativo, tais como uma conidiação reduzida, baixa produção de carotenoides, micélio com hifas bastante ramificadas e extensões encurtadas e uma taxa de extensão de hifas basais tardia. Quando cultivada em pH alcalino, a linhagem mutante apresentou uma redução acentuada no diâmetro da colônia e também um crescimento prejudicado em níveis elevados de íons cálcio, agentes osmóticos (sorbitol e NaCl) e agentes oxidantes (paraquat, menadiona e peróxido de hidrogénio), sugerindo que as vias de regulação de osmolaridade, pH e desintoxicação dos fungos são de alguma forma moduladas por NPF e que esta proteína pode ser um hub para o crosstalk entre as diferentes vias de sinalização. Quando submetida a estresse térmico, a linhagem Δnfp mostrou crescimento radial drasticamente reduzido, que foi acompanhado por uma redução do conteúdo de glicogênio. Considerando os dados da literatura para NPF, esta é a primeira vez que é atribuída a esta proteína um papel no metabolismo de carboidratos e na resposta fúngica ao estresse. Nossos resultados são, portanto, inéditos e indicaram que NPF é importante para as células modularem adequadamente a expressão gênica e responderem aos desafios ambientais em fungos e participarem na resposta adaptativa ao estresse. Se NPF participa diretamente ou não destes eventos e se NPF-PRC2 estão envolvidas em eventos de remodelagem da cromatina, necessita ser melhor investigado, uma vez que o crescimento tardio da Δnfp pode ser devido a um papel desta proteína em outros complexos que não seja o PRC2.
Leishmanioses, derivados guanidínicos e cisteíno proteases: atividade biológica in vitro e in vivo para o desenvolvimento racional de fármacos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-10-04) Mela, Michele Ferreira da Silva; Graminha, Márcia Aparecida Silva; Gonzalez, Eduardo Rene Perez; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
As leishmanioses são um conjunto de doenças causadas por parasitas do gênero Leishmania e acometem milhares de pessoas no mundo anualmente. Até o momento, há poucos fármacos disponíveis para o tratamento destas doenças, além de apresentarem elevada toxicidade, efeitos colaterais graves e baixa eficácia, o que torna urgente a busca por novas opções terapêuticas. Neste sentido, este trabalho teve como objetivo identificar compostos guanidínicos com atividade leishmanicida e potencial atividade inibitória da enzima cisteíno protease rCPB2.8, importante fator de virulência do parasita Leishmania. As moléculas foram avaliadas frente a Leishmania infantum e/ou Leishmania amazonensis, com destaque para os compostos G1, G2, G3, G7 e G30, os quais apresentaram potência frente à promastigotas de L. infantum, com destaque para G1, G6 e G7, as quais também mostraram-se promissoras frente a amastigotas intracelulares (IC50AMA < 10 µM), além de serem pouco citotóxicas quando avaliadas em macrófagos murinos, indicando índice de seletividade > 10. Em busca de potenciais alvos moleculares para entendimento do mecanismo de ação, estes derivados guanidínicos foram avaliados quanto à sua capacidade de inibição da enzima recombinante rCPB2.8, uma protease importante para sobrevivência e virulência de Leishmania spp, sugerindo que G6 tenha esta protease como potencial alvo de ação, (IC50CPB = 6 µM) , com análise do gráfico duplo-recíproco Lineweaver e Burk, indicando que esta molécula diminui a afinidade da enzima pelo substrato. Ensaios in vivo em modelo experimental Balb/c infectado com L. amazonensis, seguindo um protocolo de tratamento de administração intraperitoneal de 2 mg/Kg/dia, durante 15 dias, mostram que G6 e G7 levaram a diminuição das lesões cutâneas dos animais, com redução da carga parasitária de 79,4% e 66,5%, respectivamente, não indicando danos hepáticos e renais. Estes dados evidenciam o potencial desta classe de moléculas para as próximas etapas de desenvolvimento de fármacos antileishmaniais para o tratamento de leishmaniose cutânea e também para leishmaniose visceral.
Avaliação da atividade leishmanicida de porfirinas associadas à terapia fotodinâmica
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-10-17) Sánchez Uría, Maricely; Graminha, Marcia Aparecida Silva [UNESP]; Velasquez, Angela Maria Arenas; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
As leishmanioses são doenças negligenciadas que afetam milhões de pessoas em todo o mundo. Os fármacos disponíveis para o tratamento apresentam diversos efeitos colaterais e difícil via de administração, o que causa abandono do tratamento pelo paciente e surgimento de cepas resistentes. Nosso grupo de pesquisa atua na etapa pré-clínica de desenvolvimento de fármacos contra as leishmanioses, testando moléculas de origem natural e/ou sintética e investigando seus possíveis mecanismos de ação. Neste trabalho, foi avaliada a atividade leishmanicida (EC50) in vitro de oito porfirinas tetra-catiônicas (4-PtTPyP, 3-PtTPyP, 4-PdTPyP, 3-PdTPyP, 4-TPyP, 3-TPyP, 4-TMePyP, e 3-TMePyP) frente a L. amazonensis através de Terapia Fotodinâmica (TFD). Os compostos foram avaliados quanto à sua foto-citotoxicidade (CC50) em macrófagos murinos e seus Índices de seletividade (IS) foram calculados. As porfirinas 3-PtTPyP (EC50: 8,7 ± 0,4 nM; IS: 213), 3-PdTPyP (EC50: 15 ± 5 nM; IS: 85,2) e 3-TPyP (EC50: 25,5 ± 7,5 nM; IS: 61,9) utilizadas como fotossensibilizadores (FS) através de TFD mostraram-se as mais fototóxicas frente às formas promastigotas do parasita. Já na atividade anti-amastigota (EC50- AMA) foi constatado que em geral os FS: 3-TPyP (47,9 ± 4,4 nM; IS: 32), 3-PdTPyP (38,8 ± 11,5 nM; IS: 32,9) e 3-PtTPyP (27,6 ± 6,7nM; IS:67) são ótimos candidatos para serem futuramente testados in vivo. Devido a interação entre os FS e a luz, foi mensurada a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), encontrando-se que as porfirinas 4-PtTPyP, 3-PtTPyP e 3-PdTPyP induziram os níveis mais altos de EROs no parasita. Adicionalmente, ensaios de co-localização com as porfirinas foram realizados utilizando os marcadores MitoTracker Orange (marcador de mitocôndria) e LysoTracker Green (marcador de lisossomos ou pools acídicos) por microscopia confocal, encontrando-se co-localização das moléculas em ambas as organelas, mitocôndria e pools acídicos. Análises do tipo de morte celular potencialmente induzida pelos FSs foram realizadas através da marcação com brometo de etidio/laranja de acridina (BE/LA). As moléculas 3-PdTPyP, 3-PtTPyP e seus isômeros (4-PdTPyP, 4-PtTPyP) na presença de luz branca após 6 e 24 h de irradiação mostraram-se como os FSs com maior efeito leishmanicida. 3-PdTPyP e 3-PtTPyP induziram a morte do parasita principalmente por necrose (74,2% e 52,2% após 6h, respectivamente; e 79% e 78% após 24h, respectivamente). Enquanto que o isômero 4-PtTPyP induz a morte das promastigotas por like-apoptose (81%) após 6h de irradiação, e após 24 h direccionou os parasitas a morte por necrose (33,6%) e like-apoptose (28,2%), similar ao observado no isômero 4-PdTPyP em ambos os tempos (40% necrose/20%like-apoptose e 54,5%necrose/25,5%like-apoptose, após 6h e 24h de irradiação, respectivamente). Estes dados sugerem que as porfirinas tetra-catiônicas de platina e paládio aqui utilizadas têm um grande potencial para serem utilizadas no tratamento da leishmaniose cutânea por meio de terapia fotodinâmica. Palavras-chave: Leishmanioses, Terapia Fotodinâmica, Leishmania amazonensis, Porfirinas, mitocôndria, lisossomos.
Análises celulares e moleculares do efeito do óleo essencial de Artemisia absinthium em modelo celular de fibrose hepática
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-09-28) Barreto, Indyanara Inacio; Moraes, Karen Cristiane Martinez de [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A fibrose hepática é uma resposta anormal de regeneração, em que as células lesadas são substituídas por um excesso de material extracelular rico em colágenos, produzido pelas células estreladas hepáticas ativadas após a lesão, que contribuem para o início e progressão da fibrose. Até o momento, não há terapia aprovada para a doença. A planta Artemisia absinthium é utilizada na medicina tradicional de forma expressiva para problemas hepáticos, dentre seus compostos ativos, o óleo essencial possui propriedades terapêuticas diversas ainda não investigadas em doenças hepáticas. Assim, utilizamos a linhagem de células estreladas hepáticas LX-2 para avaliar o potencial modulador do óleo essencial em vias relacionadas à fibrose hepática e ao estresse celular. Para tal, foram realizadas análises de microscopia de fluorescência, expressão gênica, análises bioquímicas e de perfil proteico, utilizando 4 grupos experimentais: 1. Células quiescidas-like (controle de condições não patológicas), 2. Células ativadas (controle de características pró-fibrogênicas), 3. Células ativadas + óleo essencial 0.3 μg/ μL e 4. Células ativadas + óleo essencial 0.4 μg/ μL, incubadas por 24 h. Das concentrações avaliadas, foram utilizados os resultados de 0.4 μg/ μL para discussão pela clareza das vias induzidas pelo óleo essencial nessa dosagem, a qual reduziu os marcadores pró-fibrogênicos e induziu perturbação na homeostase celular, desencadeando modulação do metabolismo lipídico, processos de estresse celular, detoxificação, elementos pró-inflamatórios e de transição epitélio mesenquimal. Assim, o tratamento demonstra potencial antifibrótico com toxicidade preditiva induzida na concentração e tempo de exposição utilizados.
Obtenção e estudos físico-químicos de biomembranas conjugadas de látex e peptídeos bioativos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2014-02-28) Miranda, Matheus Carlos Romeiro; Cilli, Eduardo Maffud [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A biomembrana de látex natural (NRL – Natural Rubber Latex), manipulada a partir do látex extraído da seringueira Hevea brasiliensis, tem apresentado grande potencial de aplicação no campo da biomedicina e dos biomateriais. Devido à sua biocompatibilidade e baixa taxa de rejeição, ela tem sido utilizada para próteses e enxertos, atuando como estimulante da angiogênese, adesão celular e matriz extracelular, além de atuar como barreira física a agentes infecciosos e liberação controlada de fármacos e extratos. O objetivo desse trabalho consistiu na incorporação de peptídeos bioativos em biomembranas de látex natural (NRL) e no estudo de sua liberação. Somado a isto, foi desenvolvido um novo método de polimerização das biomembranas utilizando o liofilizador e adição de água, caracterizado por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), teste de resistência mecânica (texturômetro) e ensaio de permeabilidade ao vapor de água. Este método, mostrou aumentar a porosidade da biomembrana, em comparação com a obtida pelo método convencional, que utiliza a estufa como ferramenta de secagem. O estudo de liberação dos peptídeos foi realizado inicialmente utilizando um espectrofotômetro na região do ultravioleta. Os peptídeos estudados foram o antimicrobiano Hylina a1[W6] e o peptídeo de crescimento osteogênico OGP(10-14), cuja liberação não evidenciada por CLAE e espectrometria de massas. Outros dois peptídeos de tamanho menor e mais simples em sua composição de aminoácidos também foram avaliados: Acetil-WAA e Acetil-WAAAA. Estes apresentaram liberação de 14% e 32% respectivamente. Os resultados obtidos indicaram que, provavelmente a presença de proteases no látex promoveu a degradação dos peptídeos Hylina a1[W6] e OGP(10-14). De uma forma geral, os resultados mostraram que a utilização da biomembrana como meio para liberação de peptídeos é sequência dependente. Somado a isto, as biomembranas polimerizadas via liofilizador mostraram ser uma ótima alternativa para estudo liberação controlada de fármacos.
Avaliação da atividade leishmanicida de 38 derivados chalcônicos (T1 - T51)
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2014-01-27) Passalacqua, Thais Gaban; Graminha, Márcia Aparecida Silva [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
As leishmanioses atingem milhões de pessoas no mundo e são consideradas uma das Doenças Tropicais Negligenciadas (DTNs) por afetar, principalmente, as populações dos países em desenvolvimento. Há poucos fármacos disponíveis para o tratamento das leishmanioses, os quais são tóxicos e muitas vezes ineficazes devido ao surgimento de cepas resistentes; desta forma, a busca por novos compostos com atividade leishmanicida é justificada. Este trabalho iniciou-se com a triagem de 38 derivados chalcônicos, os quais foram avaliados quanto ao seu potencial leishmanicida e citotóxico. O derivado chalcônico T10 foi efetivo em ensaios utilizando formas promastigotas (IC50=3,4 μM) e em formas amastigotas intracelulares (IC50=4,7 μM), apresentando uma promissora atividade biológica e exibindo bom índice de seletividade (SI=41,0 μM). Portanto, este foi selecionado para realização de ensaios preliminares de análise de perfil proteico (eletroforese bidimensional) para fins de compreensão de mecanismo de ação do composto. Foi possível observar mudanças mais significativas na expressão de sete spots diferentes após tratamento com T10, os quais tiveram suas expressões aumentadas ou diminuídas quando comparados ao controle (sem tratamento).
Leishmanioses e a busca de compostos de origem marinha: as macroalgas como matriz sustentável para estudos de atividade leishmanicida
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2014-12-02) Torres, Fábio Aurélio Esteves; Graminha, Márcia Aparecida Silva [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Diversas doenças causadas por protozoários atingem milhões de indivíduos no mundo, afetando países que não possuem infraestrutura ou recursos para realizar um combate efetivo às enfermidades, denominadas de doenças negligenciadas. Leishmanioses e a tripanossomiase africana humana são consideradas doenças negligenciadas com poucos fármacos voltados para o tratamento destas doenças. Além disso, estes fármacos são tóxicos, muitas vezes ineficazes devido ao surgimento de cepas resistentes. Desta forma, este estudo realizou a triagem de extratos de diferentes espécies de macroalgas provenientes das regiões Antártica (continente Antártico) e Subantartica (Chile) e Tropicais (costa brasileira). O extrato hexânico da alga Antártica Himantothalus grandifolius apresentou a melhor atividade antiprotozoária e, portanto, também foi avaliada quanto aos seus componentes químicos com potencial atividade antiprotozoária. O subfracionamento do extrato hexânico de H. grandifolius mostrou-se 2,6 vezes mais potente quando comparada com seu extrato bruto. A análise química por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a Espectrometria de Massa de ambas subfrações revelou um pico majoritário correspondente ao composto 13E-Docosenamide, o qual, provavelmente, é o responsável pela ação leishmanicida deste extrato.
Biologia sintética aplicada no desenvolvimento de uma vacina recombinante para o controle da leishmaniose visceral canina
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-09-21) Santos, Gabriel Duarte dos; Graminha, Márcia Aparecida Silva [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A Leishmania infantum (syn. Leishmania chagasi) é o agente etiológico da leishmaniose visceral, presente nas Américas, tendo os cães como seu principal reservatório do parasita, seguido de posterior ocorrência de casos humanos. Para controle da doença, novas soluções preventivas em cães, como a produção de novas vacinas, faz-se necessário. Um fragmento protéico de 206 aminoácidos de L. infantum denominada Lc24, que já teve sua antigenicidade anteriormente avaliada pelo nosso grupo de pesquisa, é alvo do presente estudo. Primeiramente foi feita a clonagem do fragmento correspondente a 624 pb no vetor pMAL-p5X para a obtenção de um produto protéico fusionado à proteína Maltose Binding Protein (MBP), seguido de confirmação por sequenciamento. Devido ao insucesso da expressão da proteína recombinante, utilizou-se como estratégia alternativa a síntese de peptídeos. Para isso, utilizouse uma estratégia de imuno-informática para seleção de epítopos contidos em sequências peptídicas pequenas, passíveis de serem sintetizadas, mas que guardassem as propriedades imunológicas de Lc24. A sequência protéica completa foi analisada utilizando os servidores BepiPred 2.0 e o ABCpred para reconhecimento de regiões de epítopos referentes a células B e, posteriormente, os servidores EpiDOCK, Rankpep, IEDB e NetMHCpan, para a predição de epítopos para os alelos H-2Kb, H-2Kd, H-2Db, H-2Dd e H-2Ld (para MHC-I) e IA-b, I-Ad e IE-d (para MHC-II), para reconhecimento por células efetoras do tipo T (CD4+ e CD8+ ). Os peptídeos selecionados também foram analisados in silico quanto a propriedades de antigenicidade, alergenicidade, toxicidade e similaridade frente a sequências de proteínas caninas e humanas. Dentre os diferentes peptídeos identificados, selecionou-se o peptídeo GD2102, tendo como base a metodologia de classificação de melhor peptídeo estudado neste trabalho para a síntese química. Importante destacar que foi adicionado uma valina na porção N-terminal para ajudar na estabilidade e solubilidade do peptídeo, e a sequência peptídica RS09, um conhecido adjuvante sintético. Adicionalmente, parte dos peptídeos também foram encapsulados em lipossomas para promover um processo mais lento de liberação. Embora não tenha sido detectado anticorpos IgG, IgG2 e IgG2a antígeno específicos em camundongos BALB/c e swiss imunizados com os peptídeos livres ou encapsulados (dias 0, 14 e 21 para a linhagem BALB/c e dias 0 e 14 para a linhagem swiss), novas análises são necessárias como a adição de uma aplicação de uma terceira imunização e/ou aumento na quantidade de peptídeos livres e encapsulados.
Estudos de caracterização e aplicação de lipossomas associados à peptídeos antifúngicos derivados da histatina-5 visando o combate de Candida albicans
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-08-19) Oliveira, Jessica Ellen; Garrido, Saulo Santesso [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Os lipossomas PEGuilados apresentam capacidade de duração in vivo capaz de realizar a liberação prolongada de moléculas, esta ação, pode ser um fator capaz inibir o crescimento de microrganismos patogênicos e a formação de biofilme. Assim, a proposta deste trabalho consiste no desenvolvimento de formulações PEGuiladas associada ao derivado de Histatina-5, 0WHistatina-5, para tratamento de candidíase oral e inibição de biofilmes orais formadas por Candida albicans. Para isso, foi aplicado o método de síntese de peptídeo em fase sólida, utilizada a cromatografia de alta eficiência e caracterização em espectrometria de massas com ionização por eletrospray modo positivo (LC/ESI-MS+) para obtenção dos derivados de 0WHistatina-5 e 1WHistatina-5, com obtenção dos peptídeos foram realizadas as análises antimicrobianas de concentração inibitória mínima (CIM), no qual 0WHistatina-5 demonstrou atividade inibitória a 1,03 μg/mL, sendo o peptídeo escolhido para as demais análises. Para os sistemas lipossomais foi proposto o método de evaporação em fase reversa, o qual, permitiu a associação aos derivados peptídicos em até 88,65% de eficiência para o peptídeo 0Whistatina-5. Visando a caracterização morfológica, os lipossomas foram analisados por técnica de espalhamento de luz dinâmico com estabilidade a 4ºC por 42 dias, tendo como desestruturação em pH 4,5 sendo um fator de seletividade. As análises de variação de temperatura de 0ºC a 100ºC por calorímetro diferencial de varredura e dicroísmo circular evidenciaram a interação entre o sistema lipossomal PEGuilado e o peptídeo 0Whistatina-5. Para curva de crescimento e cinética de morte, ensaio de morte celular, viabilidade celular por resazurina (AlamarBlue®) e microscopia confocal com aplicação de calcofluor-white, Concavalina A e isocianato de fluoresceína foi utilizada a cepa ATCC 10231 resistente ao fluconazol e produtora de biofilme orais. Tais, técnicas permitiram inferir que a formulação composta por fosfolipídio e polietilenoglicol (PP) gerou a liberação prolongada do peptídeo antifúngico 0Whistatina-5 após 12 horas com inibição parcial do microrganismo, assim como as células presente no biofilme. Portanto, o método de evaporação reversa demonstrou-se eficiente para associação de macromoléculas em sistemas lipossomais de segunda geração, como os lipossomas PEGuilados gerando efeito prolongado do peptídeo 0WHistatina-5.
Avaliação dos mecanismos de lenta geração de doadores de elétrons por materiais lignocelulósicos no processo de biorredução de sulfatos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-07-29) Natale Júnior, Raul; Bevilaqua, Denise [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Drenagens ácidas de minas representam um sério problema ambiental. Uma estratégia promissora em seu tratamento é a associação da redução biológica de sulfato com a precipitação química de sulfetos metálicos. Esse processo depende das Bactérias Redutoras de Sulfato (BRS), que exigem um doador de elétrons para converter SO42- a S2- em seu processo respiratório. O S2- precipita os íons metálicos, que são removidos da solução por sedimentação. O uso de doadores de elétrons de lenta liberação (DELL), permite melhor sedimentação de partículas de sulfetos metálicos. No entanto, aspectos fundamentais deste processo não estão esclarecidos. Este trabalho utilizou resíduos de grão de cevada (RGC) como DELL para investigar os mecanismos desse processo. Foi feito enriquecimento de consórcio em reatores em batelada utilizando lodo de avícola como inóculo inicial. O consórcio enriquecido apresentou abundância relativa de 46,96% de unidades taxonômicas operacionais (UTO) afiliadas a bactérias fermentativas, como 25,68% de Macellibacteróides sp. e 21,28% de Enterococcus sp. As BRS representaram 32,76% da abundância relativa no consórcio enriquecido, destacando-se as UTOs pertencentes aos gêneros Desulfomicrobium sp. (9,09%) e Desulfohabdus sp. (7,64%). O ensaio de identificação dos doadores de elétrons comparou reatores sulfetogênicos com condição controle na ausência de SO42-. Nessa última, verificou-se variedade de ácidos orgânicos, como propiônico e butírico, além de etanol. O ensaio de potencial do doador de elétrons acompanhou a redução de SO42- até o exaurimento do DELL em reatores com massas iniciais de 1g, 2g e 5g de RGC. A maior proporção de RGC em relação ao SO42- levou a um maior direcionamento do fluxo de elétrons para fermentação, levando a acidificação dos reatores. Esta, por sua vez, deslocou a concentração de H2S para a fase gasosa. O ensaio de toxicidade comparou reatores concentrações iniciais crescentes de sulfeto (0, 250, 500 e 700 mg S2-.L-1) A alta concentração inicial não inibiu a atividade dos reatores, mas aumentou o período de fase lag em até 10 dias.
Desenvolvimento de método alternativo para clarificação do caldo de cana utilizando compostos naturais: avaliação antioxidante e pró-oxidativa
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-06-03) Granero, Filipe Oliveira; Silva, Regildo Márcio Gonçalves da [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Síntese e avaliação biológica de peptídeos contra o SARS-CoV-2
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-05-20) Peiró, Augusto; Cilli, Eduardo Maffud; Sanches, Paulo Ricardo da Silva; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Pandemias como a causada pelo SARS-CoV-2 afetam todos os setores da sociedade trazendo danos difíceis de serem superados. A alta e rápida disseminação da COVID-19 promoveu a saturação de hospitais e centros de saúde, fato que contribuiu para o aumento de mortes em todo o mundo. Diante do atual quadro de pandemia e do grande problema de saúde pública mundial que o vírus SARS-CoV-2 representa, além da necessidade de desenvolvimento de tratamentos eficazes para essa doença e possíveis epidemias/pandemias futuras, é de suma importância o estudo voltado para a identificação de novos compostos com ação antiviral. O presente estudo tem por objetivo sintetizar e avaliar o potencial de dois peptídeos e um bioconjugado contra o SARS-CoV-2. Neste trabalho, estes compostos foram sintetizados, purificados e avaliados quanto a sua atividade antiviral, capacidade de inibição de protease e toxicidade em células Vero. Além disso, estudos de dicroísmo circular e permeabilização de vesículas também foram realizados. Todos os compostos mostraram tendência em estruturar em α-hélice, principalmente em TFE. Os estudos de permeabilização mostraram que os peptídeos AG-M5 e o dímero M5 possuem uma grande capacidade de interagir e permeabilizar a membrana, enquanto que o peptídeo M5 demonstrou uma baixa capacidade de permeabilização. Esses resultados estão de acordo com os dados de citotoxicidade, onde o peptídeo dímero M5 demonstrou ser bastante tóxico, sendo que o peptídeo M5 mostrou a menor citotoxicidade. Os compostos não mostraram atividade antiviral contra o SARS-CoV-2, no entanto, apresentaram atividade inibitória na enzima PLpro. Este fato, pode ser atribuído a baixa capacidade de penetração celular destes compostos. Apesar da falta de atividade antiviral, os compostos avaliados neste projeto podem colaborar no desenvolvimento de novas moléculas visando a inibição da enzima PLpro.
Aplicação de resíduo do processamento industrial da goiaba em reatores anaeróbios para produção de bioprodutos de valor agregado
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-03-07) Carvalho Júnior, Romário Pereira de; Maintinguer, Sandra Imaculada [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A fruticultura tem grande importância para a economia brasileira, tendo em vista o consumo, industrialização e exportação. A goiaba contribui com a produção nacional anual total de 44 milhões de toneladas de frutas. Entretanto, a quantidade de resíduos gerados no seu processamento industrial é elevada. Os resíduos agroindustriais são altamente poluidores e devem ser tratados para redução de matéria orgânica previamente à sua disposição final. A digestão anaeróbia pode ocorrer em dois estágios, permitindo a produção de biohidrogênio, AGVs, álcoois e biometano a partir de tais resíduos. O presente trabalho avaliou o potencial do resíduo do processamento da goiaba em reatores anaeróbios operados em batelada, em codigestão com esgoto sanitário, visando determinar condições ótimas para produção de bioprodutos e identificar os microrganismos envolvidos no processo. Quatro ensaios foram realizados num sistema anaeróbio em dois estágios, com diferentes relações S/I (substrato/inóculo) (0,67, 1,0, 2,0 e 3,0 g DQO g-1 SV), em triplicata de reatores em batelada (1 L), headspace (0,3 L, N2 99,99%), a 37ºC e a 120 rpm. Primeiro estágio: resíduo, esgoto sanitário, inóculo pré-tratado e pH inicial de 5,5; segundo estágio: efluente do primeiro estágio, lodo granular anaeróbio de reator UASB e pH inicial de 7,0. Além disso, foi realizada a digestão anaeróbia em único estágio (relação S/I de 1,0). No sistema em dois estágios, o melhor rendimento de H2 foi obtido na relação S/I de 0,67 (5,26 mL H2 g-1 SV) e de CH4 nas relações S/I de 0,67 e de 1,0 (266,27 e 256,88 mL CH4 g-1 SV, respectivamente). Na relação S/I de 0,67, o ácido acético foi o principal metabólito gerado (0,96 g DQO L-1). Ao se aumentar a relação S/I, a rota metabólica predominante foi a do propionato e houve acúmulo de ácido valérico. Paraclostridium e Clostridium foram os gêneros dominantes no estágio acidogênico, enquanto gêneros de arqueias acetoclásticas e hidrogenotróficas foram identificados no estágio metanogênico. O sistema em dois estágios proporcionou produção acumulada de metano 21% maior do que em único estágio. Estudo de superfície de resposta foi desenvolvido para otimização da fermentação escura, para maximizar os rendimentos de H2 e de metabólitos, além da remoção de carboidratos. Para isso, 15 condições foram testadas em duplicata de reatores anaeróbios (100 mL) com resíduo da goiaba, esgoto sanitário e lodo granular pré-tratado, variando relação S/I, temperatura e pH inicial. Os três fatores analisados influenciaram a fermentação escura do resíduo. A melhor recuperação energética foi verificada para relação S/I de 0,3, em pH inicial de 6,79 e a 49,8ºC, com 78% na remoção de carboidratos, gerações de metabólitos de 715,21 mg DQO g-1 SV e rendimentos de 0,21 mmol H2 mmol-1 Carb. Ácidos acético e butírico foram os principais metabólitos gerados. Novas possibilidades foram abertas para a valorização do resíduo da goiaba, objetivando sua destinação sustentável.
Imobilização de ficina em pó de sabugo de milho e obtenção de hidrolisados proteicos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-12-17) Davanso, Maísa [UNESP]; Guimarães, Luis Henrique Souza [UNESP]; Bassan, Juliana Cristina; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Ficina (EC 3.4.22.3) é um grupo de endoproteases extraída a partir do látex de figueira (Ficus carica). Para a execução e conclusão desse trabalho, a ficina foi extraída, caracterizada, imobilizada e aplicada na hidrólise de extratos proteicos. Foram testados três diferentes métodos de concentração proteica, precipitação com acetona, liofilização e precipitação com sulfato de amônio. A atividade enzimática do extrato foi avaliada em diferentes valores de pH e temperaturas, usando dois substratos a caseína (macromolecular) e BAPNA (sintético), apresentando picos de atividade em 55°C com o pH 9,0 (84,69 ± 1,21 U mg-1) e 6,0 (0,202 ± 0,01 U mg-1), respectivamente. A enzima foi imobilizada em dois suportes, agarose e pó de sabugo de milho, com três ativações químicas distintas, imobilizando a enzima de forma covalente e iônica. Foi avaliada a manutenção de atividade dos derivados produzidos em diferentes condições de temperatura (45, 55 e 65ºC) e pH (5, 7 e 9). De todos os derivados obtidos por imobilização em pó de sabugo de milho (SM), SM-Glioxil-F e SM-Gluta-F foram selecionados considerando as estabilidades e atividades recuperadas, para serem utilizados na produção de hidrolisados proteicos a partir de extratos de grão-de-bico, ora-pro-nóbis e clara de ovo que também foram submetidos a hidrólise com a ficina na forma solúvel (livre) em um sistema de mistura operado em batelada. Os hidrolisados produzidos foram avaliados através da dosagem de proteínas, SDS-PAGE, atividade antioxidante pelo radical ABTS e atividade quelante de ferro. A partir da análise desses resultados, o derivado enzimático SM-Glioxil-F foi utilizado para hidrólise de extrato de grão de bico em reator de leito fixo operado de forma contínua por até 10h, com tempo espacial de 71 min. Foi possível realizar a imobilização da ficina em suporte alternativo e os derivados utilizados foram capazes de promover a hidrólise de proteínas presentes nos extratos avaliados, em ambas as formas de operação, indicando que a ficina imobilizada apresenta potencial de hidrólise de proteínas e produção de peptídeos bioativos.
Processo de conversão de biomassa lignocelulósica visando a produção de ácido levulínico usando um catalisador à base de lignina
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-11-19) Santos, Miquéias Gomes dos [UNESP]; Medina, Kelly Johana Dussán [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Estudos que visam desenvolver tecnologias para a conversão de biomassa lignocelulósica em produtos como energia, combustíveis e químicos de valor agregado, são imprescindíveis para que, no futuro, biorrefinarias possam se estabelecer e se consolidar como sistemas alternativos às refinarias de petróleo. Partindo desse pressuposto, o presente trabalho contribuiu para o desenvolvimento de um processo que envolve a produção de um catalisador sólido ácido carbonáceo à base de lignina e sua utilização na reação de conversão de celulose em ácido levulínico, com a particularidade de que ambos, reagente e catalisador, são provenientes da mesma matéria-prima – uma mistura de palha e bagaço de cana-deaçúcar na proporção 1:1. A palha e o bagaço de cana-de-açúcar são importantes fontes de carbono renováveis produzidas em larga escala no território brasileiro e o ácido levulínico é um importante precursor sintético no setor químico que pode ser obtido por meio da catálise ácida da celulose, o constituinte majoritário dessas biomassas lignocelulósicas. O processo abrangeu as seguintes etapas: obtenção de celulose e lignina por fracionamento químico da biomassa de palha e bagaço de cana de-açúcar; carbonização incompleta da lignina obtida e sua posterior sulfonação com ácido sulfúrico concentrado para sintetizar um catalisador sólido ácido; e conversão direta da celulose em ácido levulínico via reações de hidrólise e desidratação simultâneas, catalisadas pelo sólido ácido carbonáceo. A caracterização química da mistura dessas biomassas revelou composição de aproximadamente 42% de celulose, 26% de hemicelulose e 28% de lignina. O delineamento experimental para recuperação da celulose e remoção da lignina mostrou que sob as condições reacionais relativamente brandas de 110 ºC, 117 min e relação sólido/NaOH (4,4%m/v) de 1:20, mais de 91% da lignina é dissolvida no licor negro, recuperandose um sólido com teor de celulose superior a 78%. A lignina, por sua vez, foi totalmente recuperada na forma de precipitado sólido por meio da redução do pH do licor negro para 3 (sob essa condição foram recuperados 11 g de precipitado por litro de licor) . Com a lignina recuperada foi possível, então, sintetizar um catalisador sólido carbonáceo com densidade de sítios ácidos totais de 7,3 mmol/g que foi capaz de converter 17,11 % da celulose e obter rendimentos de até 38,55% de ácido levulínico quando se aplicou uma relação catalisador/celulose de apenas 8:10 (m/m). O processo aqui proposto, portanto, tem o potencial de viabilizar a inclusão do ácido levulínico, um composto químico de alto valor agregado, entre os subprodutos do setor sucroenergético nacional, incrementando o potencial competitivo desse setor.
Avaliação do potencial vacinal de derivados de duas proteínas de Leishmania infantum para aplicação no controle da leishmaniose visceral
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-09-24) Laurindo, Wilquer Castro; Graminha, Márcia Aparecida Silva [UNESP]; Pedrolli, Danielle Biscaro; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Conjugação do peptídeo desCys11/Lys12/Lys13(p-BthTX-I)2K à moléculas orgânicas e seus efeitos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-10-08) Pereira, Marina Rodrigues; Cilli, Eduardo Maffud [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Peptídeos antimicrobianos (PAMs) são alternativas para o tratamento contra bactérias que apresentam resistência aos antibióticos comerciais utilizados atualmente. Os PAMs são oligopeptídeos, anfipáticos e, em sua maioria, quando dimerizados, aumentam sua atividade biológica de forma significativa. Neste trabalho, o peptídeo dimérico desCys11/Lys12/Lys13(p-BthTX-I)2K, que apresenta atividade seletiva contra células procariontes, e dois bioconjugados contendo o ácido gálico e o ferroceno na extremidade N-terminal, foram sintetizados, purificados e caracterizados. Outras modificações também foram realizadas, como o acoplamento do grupo acetila na extremidade N-terminal, e da obtenção de um homólogo linear. Os peptídeos e bioconjugados obtidos foram avaliados em relação a sua atividade antibacteriana, citotóxica e de permeabilização de vesículas. O peptídeo com ácido gálico acoplado à região N-terminal apresentou aumento da atividade antimicrobiana para S. Aureus (MIC = 64 μM) quando comparado ao peptídeo original (MIC = 128-256 μM), apresentando toxicidade para fibroblastos somente em 512 μM. Em bactéria Gram-negativa esse peptídeo apresentou diminuição de sua atividade. O peptídeo contendo Fc manteve a atividade contra a bactéria E. Coli (MIC = 4 μM) e um aumento em S. Aureus, no entanto, apresentou a maior citotoxicidade (menor viabilidade celular), que pode estar relacionado com sua capacidade de permeabilizar vesículas. Os peptídeos, acetilado e o homólogo linear apresentaram viabilidade celular acima de 90%, em todas as concentrações estudadas, no entanto a atividade bacteriana foi baixa. Estes resultados mostram a importância da estrutura dimérica na atividade do peptídeo e a importância da carga da extremidade N-terminal na atividade do peptídeo. Os resultados obtidos trazem informações do efeito da bioconjugação de moléculas orgânicas no peptídeo desCys11/Lys12/Lys13(p-BthTX-I)2K (código: p-BT), contribuindo para o desenvolvimento de novas moléculas ativas.

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