Dissertações - Microbiologia - IBILCE

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Caracterização bioquímica e biofísica de enzima ácido ferúlico descarboxilase e aplicação na produção de 4-vinilguaiacol a partir de ácido ferúlico
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-03-07) Navarrete, Vitória Gonçalves; Eleni, Gomes [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A crescente valorização dos processos industriais sustentáveis e limitações na obtenção de alguns produtos de importância industrial têm tornado a tecnologia enzimática uma alternativa cada vez mais oportuna. A biossíntese de compostos permite produção contínua, sem impacto ou interferência sazonal, maior controle e otimização de parâmetros e maior especificidade dos produtos. A enzima ácido ferúlico descarboxilase (FADase) catalisa a descarboxilação não oxidativa do ácido ferúlico (AF) em 4-vinilguaiacol (4VG), um composto fenólico volátil utilizado como aromatizante em alimentos e bebidas. O 4VG, composto com aroma picante de cravo, é um produto de interesse industrial cuja demanda não é suprida por fontes naturais e com alto custo de produção por via química. Com a finalidade de entender a dinâmica estrutural e parâmetros funcionais da FADase heteróloga, derivada do gene da bactéria Klebsiella pneumoniae, para aplicação na produção de 4VG, foram realizados estudos bioquímicos e biofísicos da enzima. Para futura aplicação em processos industriais de produção, também foram realizadas tentativas de imobilização da enzima. Os testes de capacidade de conversão de AF em 4VG pela enzima purificada e em extrato bruto tiveram consumo de substrato e formação de produto foram confirmados por HPLC. A temperatura e pH ótimos determinados foram 40 oC e pH 5,5, e a faixa de estabilidade variou entre 35 oC e 50 oC e pH 5,0 a 5,5. O melting point de 60 oC foi determinado por Differential Scanning Calorimetry (DSC) e a investigação de um possível estágio intermediário de desenovelamento foi feito por Circular Dichroism (CD) nas faixas de 218 e 222nm, que apontou apenas dois estágios. A modelagem computacional da enzima possibilitou a confirmação da estrutura, seu sítio catalítico e sugeriu compatibilidade com glutaraldeído como agente reticulante a ser utilizado para imobilização. Nos ensaios de imobilização com CLEAs (cross-linked aggregates) e m-CLEAs (magnetic cross-linked aggregates), observou-se perda da atividade da enzima. Visando o entendimento deste resultado, a interação da FADase com o ligante foi analisada por espectroscopia de fluorescência, a partir da qual foram determinados dois sítios de ligação e uma constante de associação muito baixa para que a ligação fosse estável. Entretanto, estes resultados ainda são inconclusivos e novos ensaios são necessários para se definir as condições de imobilização adequadas para a enzima.
Triagem de fungos filamentosos para degradação de lignina: avaliação da atividade ligninolítica e da enzima lacase
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-03-03) Toneti, Matheus Henrique; Bonilla-Rodriguez, Gustavo Orlando [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A utilização de recursos fósseis e fontes de carbono não-renováveis para a obtenção de produtos químicos e energia mostrou, por inúmeros estudos, ter impactos negativos significativos no que diz respeito a aspectos ambientais e socioeconômicos para a sociedade. Por outro lado, a utilização de biomassa vegetal para a obtenção de biocompostos e bioenergia tem ganhado cada vez mais espaço e vem recebendo a atenção e investimentos devido ao seu potencial econômico e sustentável. A obtenção de biocompostos se dá principalmente pela ação de enzimas produzidas por microrganismos que, após degradar o substrato derivado de biomassa vegetal, são capazes de liberar moléculas de alto valor agregado. O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial de duas espécies de fungos filamentosos (Trichoderma harzianum Rifai PAMB-86 e Coriolopsis byrsina SXS16) em degradar lignina e produzir compostos de alto valor agregado. O substrato utilizado foi o licor obtido por hidrólise alcalina de bagaço-de-cana, mistura rica em lignina e hemicelulose. A fermentação foi suplementada com vinhaça e com meio mineral, e os resultados obtidos foram comparados. A degradação da lignina foi estimada pela absorbância no comprimento de onda de 280 nm e os resultados foram promissores: após os 10 dias, mais de 50% de degradação foi observada para as espécies Trichoderma harzianum e Coriolopsis byrsina em meio contendo vinhaça e cerca de 70% para meio contendo solução mineral. Além disso, foi confirmada a possibilidade da utilização de vinhaça, um subproduto da indústria sucroalcooleira, como suplemento para o crescimento dos microrganismos, visto que os resultados obtidos se assemelham, e em alguns casos são superiores aos experimentos utilizando solução mineral como suplemento. Outros parâmetros também foram monitorados: o pH do meio, que aumentou com relação ao controle abiótico, confirmando a liberação de compostos básicos; e a atividade da enzima lacase que alcançou valores próximos de 100 µmol.min-1 para o Trichoderma harzianum e 50 µmol min-1 para o Coriolopsis byrsina no meio suplementado com meio mineral. Por outro lado, no meio suplementado com vinhaça não se observou atividade dessa enzima. Por fim, confirmou-se que o crescimento microbiano das cepas no meio de cultivo contendo o licor ocorreu de forma satisfatória e promissora, abrindo espaço para novas pesquisas envolvendo esses microrganismos para a produção de compostos de valor agregado.
Aplicação metagenômica para detecção de viromas em carrapatos coletados de animais silvestres
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-03-03) Geraldini, Dayla Bott; Rahal, Paula [UNESP]; Oliva, Cintia Bittar [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Arbovírus são vírus que utilizam vetores artrópodes hematófagos, como por exemplo, os mosquitos e carrapatos, para serem disseminados, circulando em ciclos urbanos e silvestres. Os carrapatos são artrópodes hematófagos, parasitas obrigatórios, que utilizam de uma ampla gama de hospedeiros. Como vetores, os carrapatos são capazes de transmitir uma grande variedade de patógenos, e estão entre os mais importantes vetores de doenças, afetando animais selvagens e domésticos e, os seres humanos, representando um sério risco para a saúde pública. O Brasil possui uma grande diversidade de artrópodes e de animais vertebrados, que juntamente com as condições climáticas, constituem características favoráveis à ocorrência dessas doenças. A maioria dos vírus transmitidos por carrapatos tem genomas de RNA que tendem a acumular mutações gerando grande variabilidade genética. Essas mudanças genômicas podem influenciar a disseminação de vírus para novos habitats e hospedeiros, levando a emergência de novos vírus que podem representar uma ameaça à saúde pública. Portanto, a investigação dos vírus que circulam nos carrapatos é importante para entender sua diversidade, variedade de hospedeiros e de vetores, prevendo novos patógenos emergentes. A metagenômica viral é uma ferramenta útil para identificar simultaneamente todos os vírus presentes em uma amostra, incluindo novas variantes de vírus já conhecidos ou vírus completamente novos. Assim, o objetivo deste projeto foi investigar o viroma de carrapatos provenientes de animais silvestres recebidos e atendidos no Zoológico Municipal de São José do Rio Preto – SP, através de uma abordagem metagenômica. Foram coletados 273 carrapatos, que inicialmente, foram identificados morfologicamente, e separados em 71 pools, o RNA foi extraído e a identificação das espécies foi confirmada, por análise molecular através do gene mitocondrial, mais especificamente, a subunidade I do citocromo c oxidase (COI). Em seguida, as bibliotecas genômicas foram preparadas para a realização do sequenciamento de nova geração (NGS) utilizando a plataforma MiSeq (Illumina). As análises mostraram evidências moleculares importantes sobre um potencial novo vírus pertencente ao grupo dos Jingmenvirus em carrapatos coletados de animais silvestre. É importante ressaltar que não existem estudos sobre o viroma de carrapatos na região estudada, e o foco em animais silvestres é raro devido à dificuldade de manejo dos mesmos. Além disso, esse estudo revela a importância de caracterizar os vírus que circulam em carrapatos de animais silvestres para compreender potenciais riscos de emergência de zoonoses, que possam causar impactos na saúde humana, além dos potenciais impactos para a vida silvestre da região, e com isso fornecer informações para contribuir com a vigilância epidemiológica na região. Em suma, as pesquisas sobre JMTV ainda estão em estágio inicial, sendo necessários mais estudos para elucidar a patogenicidade desse vírus aos animais e suas características epidemiológicas na natureza.
Síntese e avaliação de dimetoxichalconas halogenadas como agentes antidermatofíticos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-03-06) Avesani, João Gabriel Giaretta; Regasini, Luís Octavio [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
As dermatofitoses são infecções causadas por fungos queratinofílicos que acometem pele, pelos e unha. São as infecções prevalentes dentre as dermatomicoses, podendo atingir 15 a 32 % da população mundial. Dentre os fatores que corroboram o surgimento e manutenção das dermatofitoses, incluem-se idade, clima, classe socioeconômica e ocupação. Possuem um tratamento medicamentoso longo e de alto custo econômico, o qual promove alto índice de abandono, provocando recidivas e cronicidade. As chalconas são substâncias de plantas e que possuem inúmeros efeitos bioativos, principalmente antifúngico. Em trabalhos anteriores realizados pela equipe do Laboratório de Antibióticos e Quimioterápicos – LAQ, observou atividade antifúngica de dimetoxichalconas contra Candida spp. No presente trabalho, buscou-se a síntese e avaliação antifúngica de 12 análogos halogenados da 2’,5’-dimetoxichalcona. Em uma primeira etapa avaliou-se a atividade antifúngica por meio dos valores de concentração inibitória mínima (CIM). Os compostos 3F e 4F apresentaram valores de CIM de 7,8 µg/mL contra cepas de Trichophyton rubrum e Trichophyton mentagrophytes. A substância 4Cl exibiu valores de CIM de 15,6 µg/mL contra cepas de T. rubrum, T. mentagrophytes e Microsporum canis. Esses três compostos foram selecionados para avaliações de bioatividade adicionais (como...). O experimento de checkerboard indicou uma ação aditiva dos três compostos com os fármacos terbinafina, itraconazol e fluconazol, exceto 4F que apresentou ação indiferente com o fluconazol. Para elucidar uma possível ação contra a membrana e parede celular fúngicas, foi conduzido ensaios com ergosterol e sorbitol adicionados no meio de cultura. Observou-se uma ação em membrana citoplasmática, com um aumento de 16 vezes na CIM com o meio suplementado com ergosterol. Pelo ensaio de tempo de morte foi possível verificar que 3F e 4F apresentaram ação fungicida, inibindo em 100% o crescimento de T. rubrum em 24 e 8 horas respectivamente. O composto 4Cl exibiu ação fungistática. O ensaio de toxicidade in vitro foi realizado contra queratinócitos humanos (HaCaT), onde observou uma alta toxicidade e um índice de seletividade (IS) menor que 0,5. No ensaio de toxicidade in vivo contra larvas de Tenebrio molitor, as mesmas apresentaram uma taxa de 30 a 60% de sobrevivência frente as chalconas. Os resultados obtidos demonstram uma alta probabilidade no desenvolvimento de novos agentes antidermatofíticos, auxiliando assim o tratamento dessas infecções.
Investigação de curcuminoides monocetônicos como agentes antibacterianos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-06-30) Moraes, Graciele Ribeiro de; Regasini, Luis Octávio [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Infecções bacterianas constituem um grande problema de saúde em todo o mundo, o qual é agravado pela resistência aos antibacterianos. A busca por novos agentes vem sendo um desafio e os produtos naturais têm sido fonte de descobertas de novas substâncias bioativas. A curcumina exibe destaque por suas propriedades terapêuticas, entretanto com algumas limitações em sua estrutura. Nesse contexto, a simplificação molecular pode conduzir análogos mais potente. Portanto, para esse trabalho, uma série de curcuminoides monocetônicos foram planejados, sintetizados, caracterizados e investigados contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas de importância clínica. Foram sintetizados 14 compostos, dentre eles 13 totalmente inéditos na literatura. Os análogos foram caracterizados por RMN de 1H e RMN de 13C, os valores de log Po/w foi entre 1,55 a 3,36, com grau de pureza de 95,9 a 99,0%, o que confirma que a estrutura planejada foi formada. Entre a série, o análogo GRM12 obteve ação de amplo espectro pois exibiu atividade contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas com valores de CIM de 3 a 60 µM. Outro fator importante foi a ação contra cepas resistentes, inclusive muitas delas, resistente a várias classes de antibióticos. O GRM12 exibiu uma CIM de 1 a 79 µM, valor igual ou próximo à tetraciclina, somente contra P. aeruginosa (ATCC 27453) o GRM12 foi fracamente ativo com uma CIM 1.000 µM. No estudo in silico, foi analisado padrões físico-químicos do GRM12, o que é crucial para molécula em fase experimental. Neste mesmo ensaio utilizamos a plataforma computacional (SwissTargetPrediction) para elucidar possíveis mecanismo de ação, no qual projetou forte interação com protease, enzima apagadora e quinase bacteriana. Com essa investigação esclarecemos pontos justificáveis a CIM tão baixo. No ensaio de permeação de membrana o GRM12 apresentou 75% de dano a membrana de S. aureus (ATCC 29213), o que pode associar ação desse análogo na ruptura da membrana bacteriana. Em teste de citotoxidade in vivo para Galleria mellonella, o GRM12 não demonstrou toxidade nas concentrações testadas, contribuindo no seguimento para outros ensaios. O biofilme é um mecanismo desafiador para inserção de antibióticos convencionais por decorrência da sua matriz muito bem organizada, tornando rígido a sua erradicação, entretanto o GRM12 foi capaz de inibir o biofilme formado em 50% contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas tendo uma ação bacteriostático contra a biomassa. Em contrapartida, a curva de morte bacteriana provocada pelo GRM12 foi igual ou menor aos fármacos, como vancomicina e tetraciclina, validando o GRM12 a um candidato promissor para futuros ensaios. Dentre a série de curcuminoides monocetônicos, outros compostos foram fortemente ativos. O GRM01, obteve atividade contra H. pylori (ATCC43526) com uma CIM 44 µM, GRM03 e GRM11 apresentaram atividade antibacteriana contra H. pylori (ATCC43526) e a cepa resistente MRSA (ATCC BAA44) com CIM entre 39 e 177 µM, respectivamente. Portanto, conclui-se que a simplificação molecular ocasionou curcuminoides ativos, corroborando o potencial da curcumina como um protótipo no planejamento de substância com competências antibacterianas. Um análogo com característica de amplo espectro em sua bioatividade e padrões mínimos predefinidos para viabilizar um futuro candidato a fármaco.
Bioprospecção de macrofungos brasileiros cultivados e selvagens: Investigação in vitro das atividades antixanthomonas, antiglicante, fotoprotetora, antioxidante e antiviral.
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-07-05) Della Torre, Olavo Henrique Petrucci; Regasini, Luis Octávio [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Cogumelo é o nome popular pelo qual são conhecidas as estruturas reprodutivas macroscópicas dos fungos pertencentes aos grupos Ascomycota e Basidiomycota. Esses organismos têm sido devidamente estudados em busca de moléculas bioativas produzidas em seu metabolismo com diversas atividades biológicas como anti-inflamatória, antitumoral, antioxidante, antiviral, dentre outras. Neste trabalho foram utilizadas 19 amostras de cogumelos cultivados e selvagens como matéria prima que passou por extração química, sequencialmente por ordem crescente de polaridade, dos metabólitos produzidos pelo macrofungo para realização dos testes antixanthomonas, antiglicante, antioxidante, fotoproteção solar e atividades citotóxica e antiviral dos extratos brutos obtidos. Dentre as atividades testadas nos screenings com todos os extratos, a atividade biológica que se destacou com bons indicadores foi atividade antiviral contra Mayaro Vírus demonstrada pelos extratos 04 acetato com 65% de proteção e 70% de viabilidade a 250 ug/mL, 11 acetato com 24% de proteção e 79,8% de viabilidade a 7,8 ug/mL, 12 acetato com 63% de proteção e 85% de viabilidade na concentração de 125 ug/mL, 18 hexânico com proteção celular de 44% e zero toxicidade a 125 ug/mL, indicando o potencial para a extração e síntese de análogos para o desenvolvimento de fármacos antivirais a partir de macrofungos.
Síntese e avaliação de chalconas O-preniladas contra os vírus Oropouche e Mayaro.
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-10-25) Lemos, Rodrigo Raposo de; Regasini, Luis Octavio [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Os vírus Oropouche (OROV) e Mayaro (MAYV) são vírus envelopados causadores da febre oropouche e mayaro, respectivamente. Ambas as infecções podem ser consideradas como zoonoses emergentes e possuem sintomas semelhantes a outras arboviroses, o que dificulta o diagnóstico clínico, causando uma consequente ampla subnotificação nos países da América Latina e Caribe. Não existem vacinas e fármacos disponíveis para a profilaxia e tratamento das infecções por OROV e MAYV. Dessa forma, torna-se necessária a busca e o desenvolvimento de novas substâncias, capazes de interromper o ciclo replicativo desses vírus. Nesse contexto, chalconas podem ser um grupo químico de partida promissor para essa investigação, uma vez que apresentam atividade antiviral contra vários vírus, incluindo o vírus da dengue (DENV), vírus da imunodeficiência humana tipo I (HIV-1), vírus do mosaico do tabaco (TMV) e citomegalovírus (CMV). Nesse presente trabalho foram sintetizadas dez chalconas O-preniladas por meio de duas etapas; (i) reação de O-prenilação do seringaldeído e (ii) reação de Claisen-Schmidt entre os seringaldeído O-prenilado e respectivas acetofenonas. Os rendimentos globais dessas reações variaram de 3% a 17%. As substâncias foram purificadas utilizando cromatografia em coluna de fase normal e de permeação em gel. As estruturas das substâncias foram confirmadas por meio da análise dos espectros de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio. Os procedimentos químicos permitiram a obtenção dos produtos isolados em quantidades e pureza adequadas aos ensaios de toxicidade contra células Vero E6 e antiviral. Sete chalconas O-preniladas demonstraram toxicidade contra células Vero E6 na maioria das concentrações testadas e ausente ou fraca inibição da replicação de OROV e MAYV. A chalcona 17, substituída por um grupo amina na posição 2’ do anel A colaborou com uma viabilidade celular em 50% das células Vero E6 infectadas por OROV a 4,7 μM e 9,4 μM.
Detecção e vigilância do vírus SARS- CoV- 2 em Estação de Tratamento de Esgoto (ETE) de São José do Rio Preto.
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-05-26) Martins, Renan Moura; Calmon, Marilia de Freitas [UNESP]; Rahal, Paula [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A Organização Mundial de Saúde declarou os casos de Síndrome Respiratória Aguda Grave causada pelo vírus SARS-CoV-2, como uma Emergência de Saúde Pública de Interesse Internacional e o status de pandemia foi oficialmente reconhecido pela OMS em 11 de março de 2020. A Epidemiologia Baseada em Águas Residuais ganhou grande notoriedade uma vez detectada a presença do novo agente ao redor do globo em diversas amostras ambientais, tal técnica já fora anteriormente descrita em trabalhos monitorando outros vírus a nível comunitário, como: Poliovirus, Enterovirus, Adenovirus Rotavirus e Vírus da Hepatite A. Através da detecção de material genético nas águas residuais a técnica atua como uma ferramenta complementar importante de alerta precoce. Nosso objetivo com este trabalho foi avaliar a presença do RNA do SARS-CoV-2 nos efluentes domésticos de São José do Rio Preto- SP/ Brasil, e sua dinâmica durante o período de um ano, e investigar a relação com outros parâmetros ambientais. De 15 de julho de 2020 a 16 de julho de 2021 foram coletadas amostras de esgoto primário provenientes da Estação de Tratamento de Esgoto de São José do Rio Preto. As amostras passaram por uma etapa de concentração viral por ultracentrifugação, seguida por extração do RNA viral e posterior transcrição reversa para a quantificação através de Reação em Cadeia pela Polimerase em tempo real (RT-qPCR). No método de análise (one-step) o RNA de SARS-CoV-2 foi detectado nas 150 amostras em pelo menos um dos alvos, sendo a proporção de 100% para o alvo N1 e de 96,6% para o alvo N2. A quantificação variara de 1 X 103 até 1.3 X 105 cópias de RNA viral por litro de esgoto para o alvo N1, e 0 até 8.6 x 104 cópias de RNA viral por litro de esgoto para o alvo N2. Os dados a carga viral no esgoto doméstico são capazes de predizer uma variação do número de infectados na população com um atraso médio de cinco dias. Observamos ainda uma correlação negativa entre a temperatura do esgoto e o sinal viral no esgoto, e o número de casos notificados de infecções por SARS-CoV-2. Observamos uma correlação negativa entre a temperatura do ar e o título viral de SARS-CoV-2. Uma correlação estatística também foi encontrada entre o fluxo médio de esgoto na estação com os títulos virais do alvo N1 do SARS- CoV-2. Também foi observado um número maior de cópias virais, para o alvo N1, nas águas residuais coletadas em dias não chuvosos. Com base nos dados obtidos, propomos que o monitoramento amplo dos efluentes domésticos permite uma visão mais ampla e comunitária da doença, e em combinação com a investigação clínica contribui para um melhor entendimento da dinâmica de circulação do vírus na população, sendo uma estratégia importante para a tomada de decisão das autoridades sanitárias em países pobres ou com renda média, servindo como um sistema de alerta rápido e barato capaz de antecipar futuros surtos de COVID-19, além de poder ser usada em cenários de falta de testes diagnósticos individuais.
Produção de vanilina por bactérias cultivadas em hidrolisados de bagaço de cana-de-açúcar pré tratados com ozonólise.
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-07-01) Biancheti, Lara Maria; Gomes, Eleni [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A cultura de cana-de-açúcar para produção de açúcar e álcool é a maior geradora de resíduos agrícolas do Brasil. A principal dificuldade no uso dos resíduos lignocelulósicos em biotecnologia é a complexidade de suas estruturas havendo necessidade de tratamentos específicos para a desconstrução dessa organização estrutural, sendo a lignina o composto responsável pela maior parte da resistência à degradação química e biológica da fibra do bagaço. Os tratamentos químicos, como a hidrólise ácida ou alcalina, são os mais utilizados pela indústria, porém, a de pré-tratamentos aumentam a eficiência da hidrólise. Entre os agentes oxidantes químicos, o ozônio é o que possui maior reatividade sobre as substâncias com grupos funcionais com alta densidade eletrônica, incluindo aqui as ligações de alcenos, tais como aquelas amplamente presentes em lignina, tendo como vantagens a bioconversão efetiva da lignina em seus compostos derivados; não produção de resíduos tóxicos e o fato de que as reações podem ser realizadas à temperatura e pressão ambiente. O presente trabalho visou testar a ozonólise como mecanismo de pré-tratamento do material lignocelulósico de modo a empregá-lo, por meio da biotransformação mediada por microrganismos, na produção de vanilina, substância de grande interesse comercial com aplicação nas industrias alimentícia, farmacológica e química. Verificamos que o tratamento foi eficiente e que seus compostos derivados conseguiram ser convertidos em vanilina através do metabolismo bacteriano. A produção por Micrococcus luteus chegou a 145 mg/L às 10 horas de cultivo com compostos derivados do tratamento hidrotérmico, demonstrando um grande potencial de se obter compostos de importância econômica, como vanilina e acetovanilona, a partir de bagaço de cana hidrolisado usando cultivo microbiano. Além disso, outras substâncias foram geradas a partir do pré tratamento de ozônio, como o ácido ferúlico (52 mg/L) e ácido cumárico (149 mg/L), que podem ser utilizadas tanto como produtos finais, quanto como precursoras na produção de outros compostos na indústria.
Caracterização da microbiota intestinal em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico e correlação com a dieta
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-05-13) Martins, Luisa Sales; Oliveira, Gislane Lelis Vilela de [UNESP]; Penna, Ana Lucia Barretto [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Alterações na diversidade e função da microbiota intestinal, a chamada disbiose, pode causar ou contribuir para o desenvolvimento de doenças autoimunes. O objetivo geral deste trabalho foi caracterizar a microbiota intestinal de pacientes com lúpus eritematoso sistêmico (LES) e comparar com a microbiota intestinal de indivíduos sadios. Amostras de fezes foram utilizadas para a caracterização da microbiota intestinal por sequenciamento das regiões V3/V4 do 16S bacteriano e PCR em tempo real. As comparações entre a composição da microbiota intestinal entre pacientes com LES e controles foram realizadas utilizando o teste de Mann-Whitney. As correlações dos dados da microbiota com os dados demográficos, clínicos e hábitos alimentares foram realizadas pelo teste de Spearman. Valores de P<0,05 foram considerados estatisticamente significativos. O grupo de pacientes com LES foi constituído por 14 pacientes do sexo feminino, com idades entre 26 e 55 anos (média e desvio padrão = 45 ± 9,84). Em relação ao SLEDAI, 7,14% dos pacientes apresentam inatividade da doença; 7,14% atividade leve; 7,14% atividade moderada; 35,71% atividade alta; e 42,85% atividade muito alta. O grupo controle compreendeu vinte e oito pacientes do sexo feminino (93,33%) e dois pacientes do sexo masculino (6,67%), com idades entre 25 e 70 anos (51,8 ± 12,93). Nos resultados de sequenciamento genômico, observamos que os pacientes com LES apresentaram disbiose intestinal, visto pelas diferenças significativas nas análises de beta diversidade. Os gêneros Sphingomonas, Acidaminococcus, Enteobacter, Pelomonas, Veillonella, Parasutterella, Bilophila, Lachnospira e Odoribacter apresentaram abundância relativa significativamente aumentadas no LES. Os gêneros Blautia, Hespellia, Eubacterium e Butyvibrio encontram-se reduzidos no grupo LES. Por PCR em tempo real observamos que as unidades relativas de expressão dos gêneros Prevotella e Bacteroides estavam significativamente maiores no LES em relação aos controles. Ao contrário a abundância relativa de Bifidobacterium estava significativamente menor em pacientes com LES. Encontramos correlação inversa entre a abundância relativa de espécies do gênero Prevotella nas fezes dos pacientes com o SLEDAI e o SLEDAI-2K. A modulação da microbiota pode ser uma estratégia potencial para enfrentar as consequências sistêmicas da disbiose e controle do LES.
Biotransformação bacteriana de ácido p-cumárico a 4-vinilfenol
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-04-25) Pereira, Érike Jhonnathan; Gomes, Eleni [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A biomassa lignocelulósica (lignina, celulose e hemicelulose) oriunda da indústria sucroalcooleira (bagaço de cana-de-açúcar) é atualmente subutilizada para geração de calor através de sua queima em caldeiras para produção de energia elétrica. No entanto, essa biomassa pode se tornar uma fonte potencial para obtenção de açúcares fermentáveis e de compostos fenólicos, que também podem passar por processos de bioconversão para obtenção de compostos químicos de alto valor agregado. Dentre os compostos fenólicos presentes na biomassa de cana-de-açúcar, destaca-se o ácido p-cumárico (AC) que através de reação de descarboxilação pode ser convertido a 4-vinilfenol (4VF) sendo este um composto de alto valoragregado e de grande aplicabilidade na indústria de química fina. Logo, o presente trabalho propôs a biotransformação bacteriana do AC em 4VF em solução modelo. Das cinco cepas bacterianas estudadas, Ochrobactrum intermedium TG 3.48, Stenotrophomonas acidaminiphila TD 4.7 e 3 isoladas, entretanto, ainda não identificadas: TD 2.18.1, TD 2.18.2 e TG 4.48.2, somente a cepa Ochrobactrum intermedium mostrou-se capaz de tolerar concentrações de AC de até 300 mg L-1. A referida cepa consumiu 92% do AC inicial, com um rendimento de 92% de 4VF em 3 horas de fermentação. Experimentos realizados em meio de cultura sem glicose indicaram que a cepa Ochrobactrum intermedium TG 3.48 continua sendo capaz de fazer a bioconversão, no entanto o consumo de AC (89%) apresentou uma pequena queda se comparado ao experimento que continha glicose, contudo, o rendimento se mantém em igual proporção.
Assessment of tolerance to inhibitors derived from plant biomass hydrolysis and xylose consumption by yeasts isolated from the environment
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-02-21) Zaiter, Mohammed Anas; Silva, Ronivaldo Rodrigues da [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A tendência por esgotamento das reservas de petróleo e os problemas ambientais decorrentes do uso de combustíveis de origem fóssil têm evidenciado a necessidade por fontes alternativas de energia sustentáveis e baratas. Isso impulsionou o uso de etanol como combustível líquido, especialmente em países como EUA e Brasil. Contudo, para suprir esta crescente demanda por combustíveis, no Brasil extensas áreas de terras são ocupadas por cana-de-açúcar, e têm competido com outras culturas vegetais, especialmente para suprimento da cadeia de alimentos. Como alternativa, nos últimos anos têm se intensificado estudos para produção de etanol a partir da biomassa vegetal residual, como bagaço de cana-de-açúcar e outros subprodutos da agroindústria, uma vez que este material é subaproveitado e rico em hexoses (C6) e pentoses (C5). Para que a hidrólise enzimática da biomassa vegetal resulte em açúcares fermentescíveis, são necessárias etapas de pré-tratamento deste material, os quais tendem a gerar compostos inibidores de crescimento microbiano. Desta forma, leveduras resistentes a estes inibidores e capazes de co-fermentar açúcares C5 e C6 são amplamente investigadas. Diferentemente da levedura Saccharomyces cerevisae, algumas espécies não-Saccharomyces têm se mostrado capazes de assimilar pentoses, mas ainda são muito pouco exploradas, frente a diversidade de espécies na natureza. Investigar leveduras fermentadoras de xilose, assim como suas tolerâncias a inibidores do crescimento microbiano, pode suportar futuros estudos de engenharia metabólica para capacitação da linhagem industrial S. cerevisiae. Portanto, este trabalho propôs-se a avaliar a capacidade das leveduras Pichia ofunaensis e Trichosporon multisporum para assimilar xilose, e suas tolerâncias a alguns compostos inibitórios, bem como suas capacidades para produção de etanol a partir de xilose. As leveduras foram cultivadas em meio YEPX, pH 4,5 contendo, separadamente, os inibidores hidroximetilfurfural (HMF), furfural, ácido ferúlico, ácido acético, ácido fórmico e vanilina, cultivadas a 28 ºC e 150 rpm por 96 h. A levedura P. ofunaensis apresentou crescimento em todas as concentrações destes inibidores e foi capaz de consumir completamente a xilose presente nos meios de cultivo, exceto em 20 mM de furfural, onde houve consumo de 40% da xilose, e entre 80 a 90% em maiores concentrações de ácido ferúlico (3 mM), ácido fórmico (40 mM) e vanilina (10 mM). Em presença de ácido acético 80 mM, a levedura não cresceu, e nas concentrações de 60 mM e 40 mM consumiu 20% e 90% da xilose presente nos meios, respectivamente. A levedura T. multisporum, em presença de furfural, exibiu crescimento até 15 mM e consumiu 30% da xilose. Em meio com ácido ferúlico, HMF e ácido fórmico, houve crescimento em todas as concentrações e consumo de até 40% (ácido ferúlico e HMF) e 30% (ácido fórmico) da xilose. Com vanilina, observamos crescimento até 5 mM deste inibidor e máximo consumo de 30% da xilose, e em meio contendo ácido acético a levedura não apresentou crescimento a 20 mM, exibindo consumo de até 40% de xilose em concentrações inferiores. A levedura P. ofunaensis se mostrou mais tolerante aos compostos considerados potencialmente tóxicos, exibindo melhor crescimento e consumo de xilose em comparação a levedura T. multisporum. Furfural e ácido acético se mostraram os compostos mais prejudiciais ao crescimento das leveduras. Por fim, na fermentação alcoólica, detectamos a produção de etanol apenas no cultivo da levedura P. ofunaensis, com máxima produção de 0,51 g/L após 96 h de cultivo em meio salino contendo 50 g/L de xilose.
Avaliação antifúngica de nanoestruturas de tungstato de prata contra leveduras e fungos dermatófitos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-10-08) Bianco, Letícia Monteiro; Almeida, Margarete Teresa Gottardo de; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
As infecções fúngicas representam um significante problema de saúde pública no cenário mundial e estão aumentando em incidência, principalmente em hospedeiros imunocomprometidos. A micose superficial é caracterizada pela infecção no estrato córneo, com baixa resposta inflamatória, e corresponde a principal causa de doença de pele, que afeta milhões de pessoas causadas por fungos dermatófitos, não dermatófitos ou leveduras. A alta tolerância e resistência dos fungos aos antifúngicos convencionais têm sido observado, esses fatores implicam na procura de compostos que sejam eficazes, que reduzam o tempo de tratamento e não apresentem riscos ao paciente. O tungstato de prata é um composto de tungstênio e prata, que ao ser irradiado com elétrons crescem partículas de prata com ação plasmônica, tornando-o mais bactericida e fungicida. O objetivo deste trabalho foi realizar a síntese das nanoestruturas de tungstato, pelo método de coprecipitação simples. A atividade antifúngica, in vitro, foi avaliada por microdiluição, obtendo-se a Concentração Inibitória Mínima (MIC) do tungstato de prata contra linhagens clínicas e cepas de referências (ATCC) de Candida spp., Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes e Microsporum canis, apresentando atividade antifúngica efetiva com valores de MIC entre 0,03-62,5 µg/mL. Cepas de C. krusei mostrou-se mais sensível e cepas de C. albicans mais resistentes ao composto sintetizado. O ensaio de toxicidade foi realizado em modelo in vivo usando larvas de Galleria mellonella. O teste foi executado por inoculação com a mesma concentração de α-Ag2WO4 usada nos testes de microdiluição anteriores, e não apresentou toxicidade. O ensaio de time kill foi realizado com cepas clínicas e referências das espécies de Candida e dermatófitos. Esses resultados mostram uma potencial aplicação no controle de infecções fúngicas inovando os protocolos terapêuticos.
Análise metagenômica da microbiota intestinal de pacientes com tireoidite de Hashimoto e correlaçao com citocinas inflamatorias séricas
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-07-02) Salis, Larissa Vedovato Vilela; Oliveira, Gislane Lelis Vilela de [UNESP]; Gomes, Eleni [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A disbiose, associada ao aumentoda permeabilidade intestinal e desregulação do sistema imune, podem contribuir parao desenvolvimento de doenças autoimunes. O objetivo deste trabalho foi avaliar adisbiose intestinal em pacientes com tireoidite de Hashimoto (TH) e correlacionar aos dados clínicos, dieta, e concentrações séricas de citocinas e zonulina. A frequência de consumo alimentar foi avaliada por questionário estruturado desenvolvido por nutricionistas. Amostras de fezes foram utilizadas para avaliar a microbiota por PCR em tempo real e sequenciamento 16S, e o soro para a dosagem decitocinas e zonulina, por citometria de fluxo e ELISA, respectivamente. Os resultadosforam analisados utilizando teste Qui-quadrado de Pearson, Mann-Whitney ecorrelação de Spearman. Foram incluídos 40 pacientes com TH (48,9 ± 13,2anos) e 53 indivíduos controles (45,6 ± 16,7 anos). Observamos diferençassignificativas entre pacientes e controles quanto ao consumo de carboidratos, proteínas, gorduras saturadas, verduras/legumes e laticínios. Foi detectada disbiose intestinal nos pacientes, com diferenças na riqueza e diversidade microbianas (P<0,05). A abundância dos gêneros Suterella, Intestinimonas, Acidaminococcus e Bacteroides estava aumentada nas fezes do grupo TH, enquanto Ruthenibacterium, Escherichia, Erysipelatoclostridium, Blautia, Anaerostipes e Bifidobacterium estavam reduzidos. O gênero Lactobacillus estava aumentado em pacientes que não tomavam levotiroxina. Bacteroides, Anaerostipes, Eubacterium hallii e Dorea longicatena correlacionaram de maneira inversa ao consumo de proteínas de origem animal. A ingestão de carboidratos correlacionou positivamente com Faecalibacterium prausnitzii, e o consumo de gorduras saturadas com Bacteroides cellulosilyticus, e negativamente com Eubacterium e Sutterella wadswortheusis. Catenibacterium, Bacteroides plebeius e Holdemanella biformis correlacionaram inversamente aos níveis de IL-6. Ruminococcus gnavus correlacionou diretamente às concentrações de TNF, Eubacterium rectale aos de IFN-, e Bacteroides stercoris e Blautia obeum aos de IL-17A. Além disso, observamos aumento significativo dos níveis séricos de zonulina nos pacientes, sugerindo maior permeabilidade da barreira intestinal. Concluímos que pacientes com TH apresentam disbiose e aumento da permeabilidade intestinal e que os hábitos alimentares desempenham papel importante na determinação da composição da microbiota intestinal.
Acridonas com potencial atividade antiviral na replicação do vírus Oropouche
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-07-08) Avilla, Clarita Maria Secco; Mazaro, Carolina Colombelli Pacca; Jardim, Ana Carolina Gomes; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O vírus Oropouche (OROV) é um arbovírus pertencente à família Peribunyaviridae, gênero Orthobunyavirus, foi isolado pela primeira vez em Trinidad Tobago em 1955. Em 1960 foi identificado pela primeira vez no Brasil, no estado do Pará e um ano depois foi registrada a primeira epidemia no mesmo estado. Depois disso, outras epidemias ocorreram, principalmente na região norte do Brasil. Todavia, relatos de casos e inquéritos sorológicos tem demostrado que o vírus esta se espalhado pelo Brasil e América Latina e é visto como candidato a uma próxima epidemia nas Américas. Os sintomas são semelhantes aos de outras arboviroses além de possíveis acometimentos no SNC. Atualmente, não existem vacinas ou antivirais contra o OROV. Desta forma, é de suma importância a busca por moléculas ativas no controle da infecção viral. Os derivados de acridonas já demonstraram atividade biológica no tratamento de doenças como câncer, Alzheimer, e em doenças infecciosas bacteriana, viral e por protozoários. Portanto, o objetivo deste estudo é analisar a ação de um painel de derivados de acridonas na inibição da replicação do OROV. Para tanto, um painel de onze acridonas (FAC2-FAC7, FAC15-FAC17 e FAC20-FAC22), foram testadas e quatro selecionadas (FAC16, FAC20, FAC21 e FAC22) para continuidade dos estudos. Inicialmente, realizou-se ensaio de viabilidade celular (MTT) (300-2,34µM), em linhagens celulares VERO, para definir a concentração viável dos compostos. Os resultados obtidos mostraram inibição total da replicação viral em células tratadas com as moléculas FAC20 e FAC22, não havendo formação de placas. Em relação a FAC21, a redução foi de 90%, enquanto a FAC16 reduziu aproximadamente 75% a formação de placas. Na avaliação da inibição da replicação viral pelo ensaio virucida a FAC20 inibiu completamente a formação de placas, já as FAC16 e FAC21 inibiram aproximadamente 85% e a FAC22 mostrou redução de 90% a replicação viral. Nos ensaios de imunofluorescência, os mesmos foram realizados com protocolo de tratamento, virucida e pré-tratamento, a inibição da replicação também foi observada nestes ensaios. Com o trabalho realizado, foi possível concluir que os derivados de acridona utilizados no presente estudo apresentam potencial na inibição da replicação do OROV in vitro.
Estudo da interação da proteína repressora de arginina (ArgR) de Clostridium botulinum, Porphyromonas gingivalis, Nocardia farcinica e Corynebacterium pseudotuberculosis com possíveis ligantes
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-07-08) Jeronymo, Giovanna Tavares; Mariutti, Ricardo Barros [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Clostridium botulinum é o agente etiológico do botulismo, que ocorre principalmente após o consumo de alimentos contaminados com a toxina botulínica. Essa toxina impede a contração muscular e provoca paralisia, podendo afetar os nervos autônomos. Já a bactéria Porphyromonas gingivalis está envolvida na patogênese da periodontite, sendo considerada também um fator de risco para outras complicações. A espécie Nocardia farcinica é um actinomiceto responsável por infecções pulmonares, abscessos subcutâneos e cerebrais e bacteremia. A bactéria Corynebacterium pseudotuberculosis é o agente etiológico da linfadenite caseosa (LC), doença infectocontagiosa crônica e de relevância econômica, que causa perdas econômicas significativas na produção de ovinos e caprinos. Todas essas espécies codificam a proteína repressora de arginina (ArgR), de forma que após atingir uma determinada concentração de arginina no citoplasma, esse ligante interage com a ArgR e o complexo formado (ArgR/Arg) se acopla ao promotor do DNA interrompendo a síntese. A sequência de aminoácidos da ArgR dos patógenos citados apresenta particularidades em relação ao sítio de ligação da arginina de forma que a ArgR de C. botulinum e C. pseudotuberculosis apresenta um resíduo de prolina na posição 115 (Pro115), enquanto P. gingivalis apresenta alanina (Ala115) e N. farcinica glicina (Gly115), diferentemente da maioria das ArgRs, as quais possuem aminoácidos Gln ou His na posição 115. O conhecimento dessas particularidades pode ser utilizado para o desenvolvimento de ligantes que possam inibir a via de síntese da arginina desses patógenos. Levando isso em conta, o objetivo do presente trabalho foi expressar a proteína ArgR de C. botulinum, P. gingivalis, N. farcinica e ArgR mutante P115H de C. pseudotuberculosis em Escherichia coli, purificá-las em condições nativas e desnaturantes e realizar ensaios de cristalização para a obtenção das estruturas tridimensionais cristalográficas dessas proteínas. Além disso, também foram realizados Ensaios de Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS), Dicroísmo Circular (CD), modelagem por homologia e simulações de Dinâmica Molecular. Ensaios de Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) sugerem que o ligante Tirosina pode induzir a hexamerização das ArgRs de P. gingivalis e N. farcinica. Já resultados obtidos por meio de modelagem e dinâmica molecular indicam que outros fatores além do volume do pocket das ArgRs podem influenciar na especificidade pelo ligante. Essas constatações podem ser usadas para o desenvolvimento de ligantes que possam ocupar o sítio de ligação da arginina da ArgR dos patógenos citados, de forma que sua via de síntese seja interrompida e resulte na inibição da proliferação desse patógenos.
Estudo do encapsulamento do Lactobacillus rhamnosus e avaliação da resistência ao trato gastrointestinal (TGI) simulado
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-07-08) Miranda, Artemiza da Silva; Souza, Fátima Pereira [UNESP]; Fossey, Marcelo Andrés [UNESP]; Caruso, Ícaro Putinhon [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A microbiota intestinal é composta por uma variedade de microrganismos que vivem em simbiose com o hospedeiro humano, proporcionando diversos benefícios como interação com sistema imunológico, influência na permeabilidade do epitélio e na produção de substâncias que atuam em processos metabólicos essenciais para o bom funcionamento do organismo. Estilo de vida, dieta e estresse são alguns dos fatores que podem contribuir para que ocorra a alteração da microbiota. A condição na qual se tem alteração da microbiota é denominada disbiose, e quando presente pode desencadear o desenvolvimento de muitas doenças, no entanto, a manutenção de uma microbiota equilibrada pode prevenir e até mesmo tratar diversas patologias, um dos métodos recomendados é a administração de formulações de probióticos. Os probióticos são microrganismos vivos, que quando administrados em quantidades adequadas conferem benefícios à saúde do hospedeiro, porém, algumas cepas não são capazes de tolerar as condições adversas do trato gastrointestinal (TGI), sendo necessário proporcionar uma barreira física externa como proteção. Portanto, o objetivo desse trabalho foi encapsular o probiótico Lactobacillus rhamnosus utilizando a quitosana, um polímero de origem natural, como matriz encapsulante e avaliar a sobrevivência desse microrganismo às condições gastrointestinais simuladas. Desse modo, os probióticos foram encapsulados com quitosana por meio do método de gelatinização iônica, a simulação do TGI foi realizada com os probióticos livres (não encapsulados) e encapsulados. A caracterização das nanopartículas foi realizada por meio da análise de microscopia eletrônica de varredura (MEV), diâmetro hidrodinâmico e do índice de polidisperssão (IPD). Para fins de comparação e análise da influência do processo de encapsulação na caracterização, foram produzidas nanopartículas vazias e nanopartículas com o probiótico. Os resultados mostraram que as nanopartículas com o probiótico apresentaram-se com diâmetro de 475 nm e as nanopartículas vazias obtiveram-se valores de 83,85 nm, em relação ao IPD ambas as amostras se apresentaram polidispersas. A análise de MEV das nanopartículas vazias evidenciou morfologias distintas, os resultados das fotomicrografias das nanopartículas encapsuladas sugerem a presença de agregação. Os resultados de digestibilidade evidenciam que os probióticos na forma livre não sobreviveram, visto que apresentaram contagem abaixo do limite de detecção ao final do processo, os resultados referentes aos probióticos encapsulados sugerem que o procedimento de encapsulação pode ter sido eficaz na proteção, uma vez que foi possível realizar a quantificação dos probióticos, apresentando valores de contagem inicial de 8,84 log UFC/mL e ao final da simulação 4,30 log UFC/mL. Entretanto ainda há necessidade de otimizar o processo de produção de nanopartículas, estabelecendo protocolo de avaliação da eficiência de encapsulação bem como evitar a presença de agregados uma vez que esse pode comprometer a aplicabilidade das nanopartículas com os probióticos.
Caracterização biofísico-química da proteína de matriz do vírus sincicial respiratório humano.
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-06-16) Guimaraes, Giovana Cavenaghi; de Souza, Fátima Pereira [UNESP]; Caruso, Ícaro Putinhon [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O Vírus Sincicial Respiratório Humano (hRSV) é o principal agente causador de infecções no trato respiratório inferior em crianças e idosos por todo o mundo. A proteína de matriz (M) é essencial para o ciclo viral, uma vez que atua no processo de replicaçãoo, interagindo com proteínas do complexo ribonucleoproteico (RNPs). Posteriormente, a proteína M atua coordenando a transferência dos RNPs para locais de jangadas lipídicas, a partir da interação com o citoesqueleto celular, auxiliando assim no brotamento e liberação de vírions. Sabe-se então, que a proteína atua na célula hospedeira e tem grande importância na replicação viral, desta forma, o objetivo do presente trabalho foi compreender as mudanças conformacionais que podem ocorrer na proteína em diferentes condições de pH, temperatura e salinidade. Utilizando a proteína de matriz recombinante, foram realizados experimentos de fluorescência, dicroísmo circular e calorimetria de varredura diferencial. Os resultados do presente trabalho demonstraram que o processo de desnaturação térmica da proteína é irreversível e apresenta temperatura de desenovelamento de aproximadamente 44 °C. Além disso, sua estrutura secundária é influenciada pelo pH. Porém, mesmo em condição extremamente ácida, a proteína ainda possui parte de sua estrutura preservada. Por fim, o aumento da concentração iônica leva a uma desestabilização da proteína, resultando em diminuição da sua temperatura de desenovelamento. Desta forma os resultados do presente estudo auxiliaram para uma melhor compreensão de características conformacionais da proteína de matriz do hRSV.
Investigação das mutações encontradas após adaptação por alternância de hospedeiros in vitro da linhagem africana de ZIKV
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-04-14) Marques, Nayara Nathie; Rahal, Paula [UNESP]; Batista, Mariana Nogueira; Bittar, Cintia [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O Zika vírus (ZIKV) é um arbovírus da família Flaviviridae que foi isolado pela primeira vez em 1947 e tornou-se uma preocupação de saúde pública após um surto em 2015 relacionado a outras manifestações clínicas graves: Síndrome de Guillain Barré e Síndrome Congênita de o vírus Zika. Transmitido principalmente pela picada do mosquito Aedes, o ZIKV é mantido em dois ciclos de transmissão: urbano e silvestre. Embora a passagem alternada entre diferentes hospedeiros equilibre sua sequência consenso conservada na natureza, devido à falta de atividade de correção da RNA polimerase dependente de RNA, o ZIKV exibe uma alta taxa de mutação e circula como quasiespecies com mutações pontuais. O objetivo deste estudo foi avaliar as mutações que surgiram no genoma viral da cepa africana do Zika vírus após infecções alternadas entre dois tipos celulares capazes de mimetizar o ciclo urbano (HEK-293 e C6/36) e o ciclo semi-silvestre (LLC-MK2 e C6/36) em dez passagens. O estoque do vírus foi produzido em células C6/36 e titulado a cada passagem através do ensaio de formação de placa em células Vero E6, de modo que sempre a mesma quantidade de vírus foi utilizada em cada infecção. O genoma completo do vírus estoque e do vírus da última passagem de cada ciclo foi sequenciado pela técnica de Sanger. No ciclo semi-silvestre, todas as dez passagens previstas foram realizadas e seus títulos virais demonstraram estabilidade. O ciclo urbano, no entanto, foi interrompidio na terceira passagem e não pôde ser titulado. Esses resultados vão ao encontro do que já é visto na literatura e na natureza: um ciclo bem estabelecido entre primatas não-humanos e baixa capacidade de circulação em humanos. Em ambos ciclos, mutações sinônimas apareceram nas regiões NS3 e NS5 e podem estar relacionadas ao viés de códon e adaptação do hospedeiro. Curiosamente, a mesma inserção de citosina foi observada na mesma posição 10697 na UTR 3' em ambos ciclos, uma possibilidade é que esta seja uma mutação adaptativa relacionada às células do vetor, utilizada em ambos. No ciclo semi-silvestre, uma das seis mutações que surgiram era não-sinônima na região NS2A, sem relação com nenhum dado da literatura. Mais estudos são necessários para elucidar os mecanismos de evolução viral, se as mutações identificadas podem realmente ser adaptações do hospedeiro e quais são seus impactos na aptidão viral.
Investigação de mutações no genoma do ZIKVBR após passagens in vitro em células de hospedeiro humano e símio
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-04-13) Molina, Bárbara Floriano; Rahal, Paula [UNESP]; Oliva, Cintia Bittar [UNESP]; Batista, Mariana Nogueira; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O Zika vírus (ZIKV) foi isolado pela primeira vez em 1947, mas se tornou uma preocupação mundial apenas após as epidemias de 2015, relacionado a manifestações clínicas severas como a Síndrome Congênita pelo vírus Zika e a Síndrome de Guillain-Barré. Transmitido principalmente pela picada de mosquitos Aedes sp., o ZIKV é mantido em dois ciclos de transmissão: urbano e silvestre, que envolvem humanos e macacos respectivamente. Ainda que a infecção alternada entre hospedeiros diferentes balanceie sua sequência consenso conservada na natureza, devido a ausência de atividade corretiva da RNA-polimerase dependente de RNA viral, o ZIKV possui alta taxa mutacional e circula em pools de quasiespécies com mutações pontuais que podem possibilitar adaptação a novos nichos e hospedeiros. O objetivo do presente estudo foi investigar mutações virais que surgiram após infecções alternadas em diferentes tipos celulares capazes de mimetizar os ciclos urbano (CUr) e semi-silvestre (CSi). Para isso, foram realizadas dez passagens alternadas para cada ciclo. Tanto o inóculo inicial quanto os vírus resultantes das décimas passagens de CSi e CUr tiveram seus genomas completos sequenciados pelo método de Sanger. Foram identificadas mutações sinônimas e não-sinônimas ao final das passagens de ambos os ciclos, sendo todas apresentadas como ambiguidades no eletroferograma. Substituições não-sinônimas foram encontradas nas proteínas E, NS1, NS2A, NS2B, NS3 e NS4B, em especial no resíduo 1263 (NS2A) que foi o único que apresentou mutações em ambos os ciclos, sendo que no CUr dois nucleotídeos do códon apresentaram variações resultando em quatro possíveis aminoácidos na população viral (V/A1263T/M/A/V). A conclusão das dez passagens alternadas do CSi demonstra a habilidade do ZIKVBR de infectar células de primatas não-humanos e chama atenção para a possibilidade de spillback. Além disso, os títulos alcançados no CSi sugerem que o vírus ainda não esteja bem adaptado ao hospedeiro mamífero não-humano visto que seguiram padrão de “alto-e-baixo” no decorrer das passagens, sendo os mais altos nas células de mosquito e mais baixos nas de macaco. Enquanto isso, os títulos de CUr mostraram maior estabilidade, reforçando o sucesso do ciclo urbano bem estabelecido e com rápida disseminação no mundo todo. Mais estudos são necessários para elucidar os mecanismos de evolução viral, se as mutações identificadas são adaptativas aos hospedeiros e quais seus impactos no fitness viral.

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