Dissertações - Biologia Geral e Aplicada - IBB

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Repercussões da dieta ocidental e da exposição ao ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-d) sobre a próstata de camundongos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-07-28) Rocha, Vanessa Aguiar; Scarano, Wellerson Rodrigo [UNESP]; Barbisan, Luís Fernando [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A dieta ocidental (DO), rica em gorduras saturadas e carboidratos simples, está associada ao desenvolvimento de “patologias da civilização”, incluindo distúrbios reprodutivos e aumentando a probabilidade dos indivíduos desenvolverem doenças prostáticas. Adicionalmente, o uso de herbicidas, como o 2,4-D, um interferente endócrino, gera resíduos nos alimentos e em ambiente doméstico acima dos níveis permitidos. A literatura tem avaliado a ação desses fatores separadamente, no entanto, eles coexistem no ambiente e podem atuar como fatores sinérgicos, predispondo doenças crônicas sistêmicas e aumentando a susceptibilidade à carcinogênese. Dessa forma, como intuito de avaliar a ação do herbicida 2,4-D sobre a próstata de camundongos expostos cronicamente à DO, camundongos machos C57Bl/6J receberam simultaneamente uma dieta hiperlipídica, rica em sacarose e solução de açúcares, e 2,4-D nas doses de 0,02, 2,0 ou 20,0 mg/kg p.c./dia por via oral, por 6 meses. Dados de consumo de ração, peso corpóreo e peso de gordura foram registrados. Após o tratamento, foi realizado o teste de tolerância à glicose (GTT) e após laparotomia, a próstata ventral foi coletada para avaliações histológicas e moleculares, onde a expressão gênica foi quantificada por RT-qPCR. Nossos resultados mostraram que a DO foi capaz de induzir obesidade nos animais. O tratamento com a DO aumentou o peso e a gordura corpórea, induziu intolerância a glicose e alterações morfológicas com modificação nos compartimentos da glândula prostática, aumento na quantidade de colágeno e mastócitos. A imunohistoquímica revelou aumento de células positivas para o PCNA (proliferação celular) no grupo DO. Na análise molecular foi observado aumento na expressão gênica do Ar; de importantes genes antioxidantes (Sod1, Cat, Gsr); de citocinas relacionadas a inflamação (Il10, Il6, Tnfα); de genes relacionados ao reparo e turnover celular (Tp53, Ki67, Casp3) e de alvos relacionados a metilação de DNA (Dnmt1) e biossíntese de miRNAs (Dicer e Drosha) no grupo DO em relação ao controle. O 2,4-D, no tratamento combinado, mostrou modular os parâmetros metabólicos, a morfologia prostática e a expressão dos genes alterados pela DO, sobretudo nas duas menores doses, assemelhando-se aos valores observados no controle negativo. Em contrapartida, o grupo tratado com a maior dose do herbicida no contexto da DO, apresentou redução no consumo da ração e redução no peso corpóreo, além de aumento da expressão de Ar, Ki67, Casp3 e Dnmt1 em relação ao controle negativo. Nossos resultados dão suporte a novas pesquisas para permitir uma melhor compreensão do papel do 2,4D no tratamento combinado com a DO sobre a próstata.
Avaliação do tratamento preventivo com o citral sobre o eixo tecido adiposo-hipotálamo em camundongos obesos induzidos por dieta hiperlipídica
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-07-31) Raimundo, Priscila Romano [UNESP]; Lima, Clélia Akiko Hiruma [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Em 2022, a obesidade já atingiu mais de 41 milhões de brasileiros. O alto consumo de nutrientes e o baixo gasto energético provocam injúria do tecido adiposo (TA), desencadeando um processo de inflamação crônica de baixo grau com o predomínio na liberação de adipocinas pró-inflamatórias e diminuição de mediadores anti-inflamatórios. Ocorre também um aumento de espécies reativas de oxigênio (EROs) devido ao aumento de infiltração de células do sistema imunológico e amplificação da inflamação na região do hipotálamo. Diante do desbalanço sistêmico, ocorre um desequilíbrio da homeostase energética. Contudo, são poucos os estudos que investigam as vias de sinalização envolvidos na interação do eixo TA-hipotálamo como potenciais alvos terapêuticos para o tratamento da obesidade. O citral é um monoterpeno, de origem vegetal, que possui atividade antioxidante e anti-inflamatória já comprovada na literatura. Assim, nosso objetivo foi avaliar a ação preventiva do citral na inflamação ocasionada pela obesidade em camundongos C57BL/6J, investigando os mecanismos anti-inflamatórios e antioxidantes do eixo TA-hipotálamo. Foram utilizados camundongos machos C57BL/6J com 6 semanas de idade (n=10), e a indução de obesidade com dieta hiperlipídica (HFD; 60% calorías provenientes de lipídios) durante 17 semanas (CEUA nº 3547180722). Os animais foram separados em cinco grupos: alimentados com dieta padrão (DP) e os que receberam HFD mais o veículo e os tratamentos com o citral por via oral (25, 100 ou 300 mg/kg). Ao final do período de indução, foram realizados os testes de tolerância à glicose e insulina (TOTG e TTI). Os TA epididimal e hipotalâmico foram coletados para quantificação de mediadores inflamatórios interleucina (IL)-4 e IL-10 pelo ensaio Luminex. Para a análise de expressão gênica dos mediadores inflamatórios IL-6 e IL-10, assim como o receptor de adiponectina no hipotálamo pela técnica de RT-qPCR. Foi realizada a determinação de mecanismos antioxidantes no tecido hipotalâmico, através quantificação da atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) e quantificação da enzima catalase (CAT). Por fim, foi executado a quantificação de leptina e adiponectina através do imunoensaio ELISA sanduíche, no TA e soro. Foi efetuado o teste de normalidade e em seguida, os dados foram submetidos ao teste t de Student não pareado para comparação entre dois grupos e análise de variância (ANOVA) de uma via ou duas vias para comparação entre três grupos ou mais, seguido do teste de Tukey (p < 0,05). Observamos o aumento significativo da massa corporal, índice de adiposidade e hiperglicemia dos animais que receberam HFD em comparação ao grupo DP. O tratamento dos animais HFD com citral 300 mg/kg foi capaz de promover a redução da massa corporal dos animais em relação ao grupo HFD sem tratamento. O grupo de animais tratados com citral 300 mg/kg apresentou redução da glicemia e diminuição da ingestão calórica. Tais resultados podem ser explicados pelo aumento da IL-4 no tecido hipotalâmico, aumento da IL-10 e IL-6 no TA com os animais HFD previamente tratados com citral na dose de 300 mg/kg em relação aos animais HFD que receberam somente o veículo. Também, o citral foi capaz de promover a redução dos níveis séricos de leptina e aumento de adiponectina. Em síntese, a administração de citral na dose de 300 mg/kg promoveu uma ação anti-inflamatória na resolução de alterações metabólicas decorrentes da obesidade. Diante disso, os novos desafios serão caracterizar mecanismos neurais da atuação do citral sobre neurônios hipotalâmicos.
Desenvolvimento e aplicação de um novo modelo computacional de ruído realístico associado a biosusceptometria de corrente alternada
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-05-26) Almeida, Michael José Abílio de; Miranda, José Ricardo de Arruda [UNESP]; Guilherme Augusto Soares; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Métodos não invasivos são utilizados para avaliar a fisiologia e estrutura dos tecidos biológicos, porém possuem algumas desvantagens, como alto custo e ausência de portabilidade. A Biosusceptometria de Corrente Alternada (BAC) é uma alternativa portátil e de baixo custo, eficaz na avaliação de parâmetros fisiológicos e farmacotécnicos in vitro, in vivo e ex vivo. O denominado problema inverso pode ser aplicado para resolver a distribuição de concentração de traçadores magnéticos e obter imagens de maior resolução. Na técnica BAC, esse problema foi definido pela construção de um conjunto de equações lineares que descrevem a dependência do valor da tensão induzida nas variáveis independentes de massa e propriedades magnéticas do traçador magnético, bem como as relacionadas ao campo gerado e resposta magnética. A resposta magnética do sensor depende do modelo de aquisição do sinal e dos componentes do sensor. Agrupando esses fatores, definimos a matriz de sensibilidade do sistema. A matriz de sensibilidade é construída usando protocolos para medir um fantoma padrão em todos os pontos em um field of view (FOV) predeterminado. Isso pode obtido in vitro ou in sílico. Os testes in vitro requerem a construção de sensores que podem ser caros e demorados, tornando impraticável otimizar as configurações do sistema para aplicações específicas. O teste in sílico é uma alternativa mais eficiente e acessível, permitindo a fácil variação de parâmetros. Para tornar os resultados in sílico mais confiáveis, ruídos realistas devem ser incluídos nas simulações. Isso garante que a relação sinal-ruído (SNR) em resultados simulados seja semelhante à de sistemas reais, o que é crítico para a confiabilidade. O realismo do modelo de ruído utilizado nas simulações computacionais afeta diretamente as estimativas de sensibilidade e resolução espacial de sistemas reais. Perfis de distribuição gaussiana são comumente usados em modelos de ruído, mas modelos de ruído realistas baseados na caracterização de sinal real demonstraram uma melhor precisão das simulações em técnicas biomagnéticas altamente sensíveis. Desenvolvemos modelos computacionais de ruídos realistas baseados na caracterização de sinais reais, possibilitando a otimização do sistema BAC por meio de simulações computacionais. Resultados mostraram que a metodologia foi eficaz na avaliação dos limites de sensibilidade e resolução espacial das medidas in sílico em comparação com as medidas in vitro.
Efeito do tratamento com melatonina sobre o potencial metastático de células de carcinoma ovariano.
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-03-01) Vígaro, Renan Aparecido; Chuffa, Luiz Gustavo de Almeida [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O câncer de ovário (CO) é a quinta causa de morte por câncer no mundo. O CO possui uma alta taxa de malignidade pelo seu diagnóstico tardio, sendo muitas vezes confundido com outras patologias ginecológicas, apresentando alta incidência no período pós-menopausa, quando há a senescência ovariana. A transição epitélio-mesenquimal é um processo pela qual a célula epitelial polarizada sofre uma conversão fenotípica para invadir, migrar e gerar metástase em órgãos distantes. A melatonina (N-acetil-5-metoxi-triptamina), hormônio secretado pela glândula pineal, exerce inúmeras funções antioxidantes, antitumorais e imunomodulatórias, e o baixo nível de melatonina na célula tumoral pode estar relacionado com a progressão tumoral. O presente trabalho evidenciou o potencial da melatonina como agente antitumoral e antimetastático em células de câncer de ovário (linhagem SKOV-3) e testou se os efeitos são dependentes do receptor de membrana MT1. Para tanto, as células de CO foram expostas a concentração próxima da fisiológica de 3,4 µM (IC50), por um período de 24 h. Assim, foram avaliados os seguintes parâmetros pós-tratamento: contagem celular, ensaio de MTT, ensaio de anoikis, teste de invasão e migração celular, ensaios de western blotting para imunoexpressão da proteína E-caderina e Per-1, além da expressão gênica pra vimentina, twist e e-caderina, moléculas envolvidas na transição epitélio-mesenquimal (TEM). A melatonina demostrou efetividade para modulação dos genes estudados, reduzindo a expressão de Vimentina e Twist independente do receptor MT1; esses genes estão relacionados com mudança de fenótipo celular, perdendo característica epitelial e ganhando característica mesenquimal, facilitando a TEM. A melatonina regulou de forma positiva o gene CDH1e a proteina E-caderina, responsáveis pela ancoragem celular, de maneira dependente de seu receptor MT1. Além disso, a melatonina foi efetiva na diminuição do potencial invasivo e migratório das células de CO, independentemente de seu receptor MT1. Assim, a melatonina diminui fatores relacionados com a perda de fenótipo epitelial e aumenta fatores de ancoragem, sem, no entanto, afetar a resistência a anoikis. A melatonina auxilia na atenuação da TEM, mesmo em baixas concentrações em período de exposição de 24 h, podendo ser um aliado importante na terapia contra o CO.
Ação do mirceno no modelo de Retocolite Ulcerativa induzida por dextran sulfato de sódio em camundongos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-03-26) Assunção, Renata [UNESP]; Hiruma-Lima, Clélia Akiko [UNESP]; Rocha, Lúcia Regina Machado da; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A retocolite ulcerativa (RCU) é uma doença inflamatória intestinal, caracterizada por inflamação crônica e pelo desenvolvimento de úlceras no cólon. A inflamação provoca infiltração de neutrófilos, aumento do estresse oxidativo e ativação de vias inflamatórias. Apesar de ser uma doença que está se tornando cada vez mais comum ao redor do mundo, ainda não existe um tratamento efetivo. O mirceno é um monoterpeno com comprovada ação antioxidante, anti-inflamatório e gastroprotetora em estudos pré-clínicos in vivo e in vitro. Esse trabalho teve como objetivo avaliar o efeito do mirceno no quadro de RCU aguda em camundongos C5BL/6J machos. Para a realização desse estudo foram usadas duas concentrações (2% e 2.5%) de Dextran Sulfato de Sódio (DSS), assim como diferentes doses do mirceno (3.75, 7.5, 11.25, 50, 100 e 200 mg/kg). Assim como foram utilizados camundongos machos C5BL/6J (n=15) que foram induzidos por DSS durante 7 dias consecutivos ofertados no bebedouro. O tratamento com o mirceno (pela via oral) foi realizado concomitantemente a indução da colite com DSS. Ao longo do período de indução mais tratamento, foi analisada a progressão dos sintomas da RCU através do Índice de Desenvolvimento da Doença (IDD). Através da análise do soro e do tecido obtido do cólon foram realizadas observações morfometrias (massa e comprimento do cólon) e bioquímicas por meio dos marcadores de inflamação (mieloperoxidase - MPO, malondialdeído - MDA, citocinas anti-inflamatórias – IL 4, 5, 10, 13 e 33) e do estresse oxidativo (glutationa redutase - GSH, superóxido dismutase - SOD e catalase – CAT). Para a análise estatística foi realizado teste de Shapiro-Wilk para determinação de normalidade e ANOVA de uma via para comparação de três ou mais grupos, seguidos do teste de Dunnett ou Tukey, ou teste de Wilcoxon, para conjuntos de dados não paramétricos. Com valor de significância mínimo de p < 0,05. As diferentes concentrações de DSS (2% vs 2.5%) resultaram no aumento significativo do IDD no 6º de tratamento. O tratamento dos animais com mirceno promoveu aumento do IDD a partir do 5º dia em ambas concentrações de DSS. Se observou um encurtamento do comprimento dos cólons dos animais submetidos ao DSS em ambas concentrações sendo que nos animais tratados com DSS a 2.5% houve uma redução significativa do comprimento em comparação com os animais tratados com DSS a 2%. Após o tratamento, houve aumento da massa do cólon e baço (DSS 2%), estomago e baço (DSS 2.5%) dos animais submetidos as diferentes concentrações de DSS em relação aos animais brancos. As análises bioquímicas demonstraram que a aplicação do DSS a 2% foi capaz de reduzir os níveis de GSH e SOD assim com a IL-4 no grupo de animais tratados com o veículo em comparação com os animais branco. A indução do DSS a 2.5% reduziu os níveis de GSH dos animais tratados com mirceno e aumentou a atividade de MPO no grupo de animais que recebeu mirceno (200 mg/kg) em comparação com branco. Através dos resultados desse trabalho foi possível concluir que a indução com DSS em ambas concentrações foi capaz de elevar o IDD, porém o tratamento dos animais com mirceno nas doses utilizadas não foi capaz de proteger os animais dos danos causados pelo DSS.
Determinação de biomarcadores para tratamento personalizado a partir do interactoma do câncer colorretal
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-02-28) Caxali, Gabriel Henrique [UNESP]; Delella, Flávia Karina [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O câncer se trata de uma doença complexa, quanto à sua fisiologia, progressão e alta mortalidade. Neste contexto, o tumor colorretal apresenta grande destaque, afinal se trata do segundo mais comum entre ambos os sexos, atrás apenas de tumores sexo específicos. Um dos grandes agravantes do câncer em questão, e a sua progressão lenta e silenciosa, o que se relaciona com um diagnóstico tardio e pior prognóstico. Como tratamentos possíveis há a ressecção cirúrgica, mas a quimioterapia assume papel fundamental pois em muitos momentos a ressecção é impraticável. Contudo tal tumor, apresenta resistência ao tratamento quimioterápico, e assim a busca de biomarcadores para este câncer é de suma importância, pois fornece indicadores prognósticos e terapêuticos que possibilitem tratamento personalizado e precoce. Desta forma, nosso estudo verificou os genes diferencialmente expressos que são secretados pelo CRC e atuam como ligantes e receptores das células tumorais, para assim compreender vias relacionadas com a carcinogênese deste tumor, bem como alvos passíveis de intervenção. Para melhor compreensão e elucidação de como tais marcadores interagem, realizamos o interatoma deste tumor. Para elencar os marcadores mais relevantes no interatoma formado, realizamos a clusterização dos 10 genes que mais apresentaram relações no interatoma formado, para assim verificar quais tinham interações descritas com fármacos. Logo, identificamos MMP9, EFGR e PLAU como possíveis alvos terapêuticos e marcadores diagnósticos, e para verificar o comportamento destes no microambiente tumoral, realizamos estudos de single-cell, verificando em qual tipo celular estes ocorriam. Desta forma, ficou evidente a importância destes no ambiente tumoral do CRC, bem como a possível possibilidade destes serem fatores terapêuticos, pois interagem com fármacos que não são comumente utilizados no tratamento deste tumor, sendo eles Sirolimus, Curcumina, Geldanamicina, Celecoxib.
Caracterização epidemiológica e de fatores de virulência de Burkholderia cepacia, isoladas de casos de bacteremia em pacientes e da água da unidade de hemodiálise
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-02-27) Silva, Gousilin Leandra Rocha da; Rall, Vera Lúcia Mores [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A insuficiência renal provoca a diminuição da diurese e o acúmulo de substâncias nitrogenadas no organismo. Para aumentar a sobrevida do paciente, a hemodiálise é utilizada como substituto parcial da função renal. Entretanto, a contaminação da água utilizada nesse tratamento, causando bacteremia nos pacientes, é uma preocupação em todo o mundo. O complexo Burkholderia cepacia (Bcc), grupo de bactérias com mais de 20 espécies, é frequentemente isolado de amostras de água de hemodiálise e compreende bactérias oportunistas, afetando pacientes imunodeprimidos, devido sua ampla variedade de fatores de virulência, além da resistência inata a vários antimicrobianos, contribuindo para a permanência no ambiente hospitalar e para a patogênese no hospedeiro. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar molecular e fenotipicamente isolados do Bcc, coletados da água e dialisato da Unidade de Hemodiálise e do sangue de pacientes com bacteremia de um Hospital Público, em Botucatu, entre 2019 e 2022. Foram utilizados 36 isolados de Bcc, previamente obtidos de hemoculturas de pacientes com bacteremia, em tratamento de hemodiálise e 24 isolados, obtidos a partir de amostras de água e dialisato. Todos os isolados foram testados para a verificação da presença de alguns genes que codificam fatores de virulência como cblA, esmR e ZmpB. Considerando-se a epidemiologia do surto, os isolados Bcc foram caracterizados molecularmente por Multi Locus Sequence Type (MLST) e por gel de eletroforese em campo pulsado (PFGE). A verificação e quantificação de biofilme em microplaca de poliestireno foi realizada submetendo os isolados à diferentes temperaturas de incubação (20°C, temperatura média da água e 35°C, temperatura ótima de crescimento do grupo). O antibiograma das amostras de hemocultura (Microscan Walkaway 96 Plus) foi gentilmente cedido pelo Laboratório Clínico do Hospital. Foi identificada a presença de ZmpB em todos os isolados, enquanto o ZmpA foi observado em 96,5% dos isolados e nenhum deles apresentou os genes cblA e esmR. O antibiograma de 33 isolados de humanos apontou que todos eram resistentes à gentamicina, à colistina, à ampicilina/sulbactam e ao imipenem. 16 (48,5%) isolados apresentaram resistência à amicacina e menores taxas de resistência foram observadas com relação ao meropenem, ceftazidima, cefepime, ciprofloxacina e piperaciclina/tazobactam (6,1%). Segundo os resultados do PFGE, todos os isolados obtidos de humanos e de água pertenciam ao mesmo pulsotipo (1), cuja identificação como a espécie B. cepacia foi confirmada pelo sequenciamento do gene recA como¸ pertencendo ao sequence type ST-767. Pela observação de um único pulsotipo dessa espécie ao longo de três anos, pode-se observar a persistência desse isolado no encanamento, contaminando os pacientes submetidos ao tratamento de hemodiálise, apesar da rotineira desinfecção da água com ácido peracético. Provavelmente, essa persistência ocorre devido à produção de biofilme, que protege as bactérias dos desinfetantes. Tornando esse cenário mais crítico, vários isolados apresentaram não-suscetibilidade a pelo menos três classes de antimicrobianos, dificultando o tratamento dos pacientes.
Memória e hipocampo: implicações da redução da dieta em ratos adultos cujas mães sofreram restrição alimentar durante a prenhez e lactação
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-07-21) Silva, Gabriela Larissa Lima da; Horta Júnior, José de Anchieta de Castro e [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A memória é um componente cognitivo extremamente relevante e sua formação e consolidação dependem do hipocampo, estrutura muito sensível a fatores ambientais, incluindo a dieta. Atualmente cerca de 820 milhões de pessoas vivem em situação de fome, abrangendo gestantes e lactantes. A fome no período de prenhez e lactação é um importante indutor de programação fetal, conforme a teoria das Origens Desenvolvimentistas da Saúde e da Doença (Dohad). De acordo com a literatura, a restrição alimentar nas fases de desenvolvimento pode resultar em prejuízo do desempenho cognitivo e redução da plasticidade do hipocampo, ao passo que a redução alimentar na fase adulta pode ter o efeito oposto, a depender da intensidade e duração. Embora muitos estudos tenham sido feitos nesses dois sentidos, ainda é desconhecido o efeito da restrição da dieta em ambos os períodos, além de ser desconhecido o papel da programação por restrição na preferência alimentar. O objetivo deste trabalho foi avaliar a memória e o hipocampo de ratos Wistar submetidos à redução alimentar na fase adulta associada à programação por restrição da dieta no período de prenhez e lactação, além de determinar o efeito da programação na preferência alimentar de ratos na infância. Para sua execução, ratos Wistar prenhas foram separadas em dois grupos: programação controle (PC), dieta normal ad libitum; e programação por restrição calórica (PR), dieta de 50% de restrição em relação ao grupo controle durante os períodos de prenhez e lactação. Aos 30 dias cada ninhada realizou um teste de preferência alimentar ou teste de preferência à sacarose. Estes grupos foram posteriormente subdivididos com relação à restrição alimentar na fase adulta: o grupo alimentação controle, dieta ad libitum (AC) ao longo de toda vida e o grupo alimentação restrita (AR), que recebeu dieta com redução de 30% em relação ao controle dos 60 aos 100 dias de idade, totalizando 4 grupos: PC-AC, PC-AR, PR-AC e PR- AR. Foram realizados os testes comportamentais de Campo Aberto (CA), Labirinto em Cruz Elevado (LCE), Reconhecimento de Novo Objeto (NORT), Localização de Objeto (OLT) e Labirinto de Barnes. Após estes testes, os animais foram perfundidos e os encéfalos coletados. No dia da eutanásia, foi mensurada a glicemia, peso corporal, peso do encéfalo, distância naso-anal, gordura (visceral, periepididimal e retroperitoneal) e foram coletados os pêlos dos animais para análise da razão isotópica de nitrogênio e carbono. Os encéfalos foram submetidos ao protocolo de imuno histoquímica para GFAP, doublecortina, FOS e NeuN. Em relação à preferência alimentar, os animais programados apresentaram maior coeficiente de preferência à dieta hiperglicídica em relação ao Grupo Controle. Nos resultados de LCE, NORT e OLT não foi possível observar efeitos relevantes, enquanto em CA observou-se diferenças no perfil exploratório dos animais, sendo que os animais programados apresentaram menor tempo de imobilidade e mais levantares. No labirinto de Barnes foi observado que houve aprendizado em todos os grupos, sendo que o grupo PR-AC teve um maior número de erros no teste de retenção de memória. Os dados biométricos mostraram que os animais programados apresentaram encéfalos menores, embora não tenham alterações no índice de encefalização. Os valores de peso, distância naso-anal e gorduras refletiram a aplicação das dietas, onde o grupo PR-AR apresentou os menores valores em todas as análises. Ademais, foi encontrada diferença nas razões isotópicas de carbono e nitrogênio, denotando mudanças na constituição corporal entre os grupos. Houve ainda alteração significativa na expressão da proteína FOS no giro denteado inferior dos animais, sendo que os grupos com restrição alimentar em qualquer fase apresentaram mais células marcadas que o grupo controle. Em relação à neurogênese, o grupo PR-AR apresentou menos células marcadas do que o grupo PC-AC, no entanto, não foram encontradas diferenças em relação ao GFAP e NeuN. Concluímos que a restrição alimentar realizada em duas fases da vida gerou alterações biométricas, reduziu a neurogênese, aumentou a expressão de FOS, embora não tenha gerado alterações na memória de reconhecimento, na ansiedade e na citoarquitetura hipocampal.
Restrição proteica materna associada ao consumo de açúcar pós-desmame na prole: efeitos sobre o perfil proteômico no fígado de ratos jovens e senis
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-02-24) Ribeiro, Isabelle Tenori; Santos, Sérgio Alexandre Alcantara dos; Justulin Junior, Luis Antonio [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Condições gestacionais adversas podem acarretar alterações morfofuncionais irreversíveis na prole, conceito este estabelecido como Origens Desenvolvimentistas da Saúde e da Doença (DOHaD). A restrição proteica materna (RPM), modelo utilizado para os estudos sobre DOHaD, tem sido associada ao aumento da incidência de doenças cardiovasculares, renais, além de afetar parâmetros reprodutivos e o desenvolvimento de alguns tipos de câncer. Além disso, a exposição pós-natal a dietas hipercalóricas/hiperlipídicas pode amplificar os danos causados pela RPM, aumentando a incidência destas doenças com o envelhecimento. Existem evidências de que o alto consumo de alimentos ultraprocessados, hipercalóricos, ricos em açúcares e sódio têm uma relação considerável com o desenvolvimento de doenças metabólicas ao longo da vida. Nesse contexto, tem-se demonstrado que o fígado, órgão central no controle do metabolismo e detoxificação, também é afetado pela exposição a dietas obesogênicas no início da vida. Nosso grupo de pesquisa demonstrou que a RPM impacta nos parâmetros metabólicos da prole no início da vida e no envelhecimento. Assim, este projeto tem como objetivo identificar o impacto da restrição proteica materna no fígado de ratos jovens e velhos, associado ao consumo de açúcar pós-natal. Os ratos foram divididos nos seguintes grupos experimentais: 1- Controle (CTR): Ratos nascidos de mães que consumiram ração normal (17% proteína) e água ad libitum durante a gestação e lactação; 2- Controle+açúcar (CTR+AÇU): O mesmo tratamento do CTR e que consumiram solução de açúcar (10% diluído em água) a partir do dia pós-natal (DPN) 21 até o DPN 90; 3- Restrição proteica gestacional e lactacional (RPGL): Ratos nascidos de mães que consumiram ração hipoprotéica (6% de proteína) durante a gestação e lactação e que posteriormente consumiram ração normal e água ad libitum até o DPN 90; 4- Restrição proteica gestacional e lactacional+açúcar (RPGL+ACU): ratos nascidos de mães alimentadas com ração hipoproteica durante a gestação e lactação e que consumiram ração normal e solução de açúcar (10% diluído em água) ad libitum a partir do dia pós-natal 21 até o DPN 90. Nos DPN 90 e 540 os animais foram anestesiados, pesados, eutanasiados e os fígados foram coletados. Foram feitas análises biométricas e nutricionais, teste de tolerância à glicose oral (TTGO), análises morfológicas e morfométricas, análise de estresse oxidativo, análises metabólicas, análise de glicogênio hepático, imuno-histoquímica, Western Blotting e proteômica. Após isto, foram realizadas análises integrativas e comparativas destes dados entre os grupos experimentais. Os resultados obtidos demonstram alterações nos parâmetros biométricos e nutricionais, alterações nas enzimas antioxidantes. Além disso, a proteômica indicou alterações no metabolismo desses animais, tanto no DPN 90, quanto no DPN 540. Na imuno-histoquímica observamos presença de imunomarcação de GST-P1 significativas nos grupos RPGL e RPGL+AÇU. Os resultados indicam que a RPM resultou em menor peso da prole durante todo o experimento, alterações morfofisiológicas hepáticas e efeitos diretos sobre as atividades enzimáticas e metabolismo do fígado, tanto no DPN 90, quanto no DPN540. Já quando a RPM é associada ao consumo de açúcar, altera os níveis de glicose, causando intolerância à glicose e, possivelmente, sensibilidade à insulina. Portanto, os resultados demonstram que a RPM associada ou não ao consumo pós-natal de açúcar modulam proteínas e vias metabólicas importantes no fígado de animais adultos e velhos, o qual pode ter consequências negativas não só sobre o tecido hepático, como também no ambiente sistêmico.
Avaliação da ação farmacológica do monoterpeno Citral como tratamento preventivo para as doenças inflamatórias intestinais
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-03-28) Zarricueta, Melina Luzzi; Hiruma-Lima, Clélia Akiko [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
As doenças inflamatórias intestinais (DII) são inflamações crônicas que acometem o TGI do paciente, podendo causar quebra da barreira epitelial, lesões ulcerativas, mudanças no peso e comprimento do tecido, alteração na microbiota intestinal (disbiose), desencadear uma resposta autoimune e manifestações extraintestinais. A ativação do sistema imune desencadeia o mecanismo de inflamação local aguda, ocorrendo o aumento de células leucocitária, liberação de enzimas de sinalização inflamatória e estresse oxidativo tecidual. Sendo assim, as terapias existentes no tratamento das DII são utilizadas para que o paciente se manter em remissão, diminua os sintomas da doença e module a resposta imune. Porém, os medicamentos utilizados causam efeitos colaterais, o que torna necessária a busca de novas terapias para as DII. Os produtos naturais são alternativas promissoras para minimizar o uso desses fármacos, como é o caso do monoterpeno Citral, que já foi descrito como um composto anti-inflamatório e antiulcerogênico para algumas doenças do TGI. Portanto, o presente estudo apresenta resultados da ação do Citral, na forma de tratamento preventivo, em modelo agudo de DII induzida por um agente químico (TNBS). Ratos Wistar machos, com 8 semanas de idade, receberam um pré tratamento 48, 24 e 1 horas antes da indução da DII, assim como 24 e 48 horas depois, sendo eles: controle negativo – tween 80 a 1% (10 mL/kg), três doses do monoterpeno (25, 100 e 300 mg/kg) e o sham (não colítico). Passadas 72 horas da indução, os animais foram eutanasiados e seus órgãos coletados. Foram feitas análises do tamanho e massa do cólon, escore da lesão, quantificação da atividade da mieloperoxidase (MPO), os níveis de glutationa reduzida (GSH) e malondialdeido (MDA). A análise estatística foi realizada com o teste de Kruskal-Wallis - dados não paramétricos - e análise de variância (ANOVA) – dados paramétricos, sendo adotado p < 0.05. O Citral, na dose de 300 mg/kg, foi capaz de diminuir o infiltrado neutrofílico no tecido do cólon adjacente, evidenciado pela menor atividade da enzima MPO, assim como manter os estoques de GSH intracelular. A dose de 100 mg/kg manteve os estoques de GSH no tecido adjacente. Para as análises do tamanho e comprimento do cólon, o escore de lesão e o aumento da massa do baço, os pré-tratamentos com o monoterpeno não foram capazes de impedir essas alterações. Portanto o Citral administrado na forma de tratamento preventivo, na dose de 300 mg/kg, demonstrou que pode ser uma alternativa para melhorar o estresse oxidativo tecidual e a inflamação local. Com esses resultados em um modelo agudo de DII, torna-se importante a investigação de outras possíveis ações do monoterpeno que possa modular o sistema imune e as citocinas pró-inflamatória em um tratamento preventivo.
Caracterização funcional da quinase inositol polifosfato (IP6K) de Leishmania braziliensis
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-03-06) Ferri, Yete Gambarini; Silva, Marcelo Santos da; Silva, Marcelo Santos da; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Em eucariotos modelo, pirofosfatos de inositol (PP-IPs) – principalmente os chamados IP7 e IP8 – estão envolvidos em uma ampla gama de processos celulares, como regulação do comprimento dos telômeros e recombinação homóloga (HR). No entanto, as proteínas-alvo dos PP-IPs, assim como seu mecanismo de ação, ainda não estão bem estabelecidas. IP7 e IP8 são sintetizados através de vias complementares que envolvem a participação das quinases IP6K e PP-IP5K. Tripanossomatídeos (e.g., Leishmania spp. e Trypanosoma spp.) possuem um gene ortólogo para IP6K, mas aparentemente não possuem ortólogos para PP-IP5K, i.e., teoricamente não sintetizam IP8, o que os torna excelentes modelos para o estudo de IP7. Este projeto consistiu em caracterizar funcionalmente a quinase IP6K de Leishmania braziliensis (LbrIP6K). Além disso, também realizamos a caracterização da quinase IP5K, a qual será utilizada como controle em ensaios futuros. Para isso, realizamos análises in silico utilizando o banco de dados TritrypDB. Encontramos os genes IP6K (LbrM.14.0340) e IP5K (LbrM.20.3290) e desenhamos primers para amplificação dos mesmos a partir do DNA genônico de L. braziliensis. No caso de LbrIP6K, amplificamos seu sítio catalítico (LbrIP6Kdomain). Adicionamos sítios para enzimas de restrição nas extremidades 5’ de cada primer para permitir posterior subclonagem direcional. Os produtos de PCR (amplicons) foram purificados, clonados em vetor de clonagem, inseridos por transformação em bactérias competentes E. coli, selecionados na presença de X-gal/IPTG, multiplicados e recuperados através de extração plasmidial. Realizamos a confirmação da clonagem por PCR e digestões enzimáticas. Em seguida, LbrIP6Kdomain e LbrIP5K foram excisados do plasmídeo utilizando enzimas de restrição específicas e subclonados direcionalmente no vetor de expressão pET28a+. O produto desta ligação foi transformado em bactérias competentes E. coli (cepas BL21-CódonPlus (DE3)-RP e Arctic Express RIL) para posterior expressão induzida por IPTG. As expressões de LbrIP6Kdomain e LbrIP5K foram analisadas em SDS-PAGE e confirmada por Western Blot utilizando anticorpos α-His-Tag. Os resultados demostraram que essas quinases são expressas na fração insolúvel do extrato bacteriano quando lisadas utilizando sonicação. Porém, ao lisar as células por alta pressão (French-press), conseguimos solubilizá-las parcialmente. Após isso, realizamos a purificação das proteínas pelo método de cromatografia de alta afinidade por metal imobilizado (IMAC) e confirmamos a eluição de ambas proteínas recombinantes por SDS-PAGE e Western Blot.
Ação imunomoduladora de constituintes isolados da própolis de jurema-preta (Mimosa tenuiflora) em células mononucleares do sangue periférico
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-02-15) Sartori, Arthur Alves; Sforcin, José Maurício [UNESP]; Santiago, Karina Basso; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Inflamação é um conjunto de eventos vasculares, moleculares e atividade celular desencadeado por estímulos nocivos. Caso não seja devidamente controlada, a cascata de eventos inflamatórios pode levar ao desenvolvimento de diversas condições patológicas. Diferentes intervenções terapêuticas têm sido utilizadas para o controle e tratamento de doenças inflamatórias, mas o uso prolongado de anti-inflamatórios glicocorticoides como a dexametasona pode ocasionar efeitos colaterais como imunossupressão. Assim, o interesse por novas estratégias para o tratamento de doenças inflamatórias, como o uso de produtos naturais com propriedades anti-inflamatórias tem sido crescente. A própolis é um produto apícola com diversas atividades biológicas. Recentemente, está sendo investigada uma nova amostra de própolis produzida na caatinga nordestina, tendo como fonte vegetal predominante a Mimosa tenuiflora (Willd.) Poir. O presente trabalho foi delineado visando avaliar o potencial efeito imunomodulador do extrato de própolis de M. tenuiflora e de três de seus constituintes isolados (santin, sakuranetin e kaempferide) em células mononucleares do sangue periférico (PBMC). Foi avaliada a viabilidade celular e produção de citocinas (TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 e IL-10) de PBMCs estimuladas previamente ou não com LPS. Também foi analisada a produção de metabólitos do ácido araquidônico (PGE2 e LTB4), e vias intracelulares (NF- κB e p38 MAPK). Apenas as maiores concentrações de própolis afetaram a viabilidade celular. Em condições basais, santin estimulou a produção de citocinas, enquanto kaempferide apresentou perfil inibitório. Todos os tratamentos reduziram a produção de citocinas pró-inflamatórias induzida pelo LPS, mas apresentaram perfis diferentes em relação à produção da citocina anti-inflamatória estudada (IL-10). Nenhum dos tratamentos, nem mesmo o LPS, afetou a produção de PGE2 e LTB4, o que pode não ter sido devidamente detectado. A expressão gênica de vias intracelulares não apresentou resultados conclusivos. Nossos dados evidenciam a ação imunomoduladora da própolis de jurema-preta e seus compostos isolados sobre PBMCs, especialmente a ação anti-inflamatória de todos os tratamentos estudados após ativação das culturas celulares com LPS. Este trabalho abre perspectivas para novos estudos junto a esta linha de pesquisa e fornece subsídios para a elaboração de novos fármacos e abordagens terapêuticas incluindo os constituintes isolados desta amostra de própolis da caatinga.
Avaliação do efeito protetor do citral na doença do refluxo gastroesofágico em camundongos eutróficos e obesos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-09-22) Fioretto, Ana Carolina; Hiruma-Lima, Clélia Akiko [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A Organização Mundial da Saúde vem alertando sobre a epidemia de obesidade que tomou proporções globais. Estudos têm demonstrado a prevalência de doenças associadas à obesidade, dentre elas a doença do refluxo gastroesofágico (DRGE), uma condição crônica proveniente do refluxo do conteúdo estomacal, que ocasiona lesões teciduais e sintomas como azia e regurgitação ácida. A DRGE aumenta fatores de estresse oxidativo (EO), que produzem espécies reativas de oxigênio (EROs) e causam danos ao tecido. O combate ao EO pode ocorrer através de enzimas, como o superóxido dismutase (SOD) e a catalase (CAT) ou de antioxidantes não enzimáticas como a glutationa reduzida (GSH). Células de defesa também estão presentes nesse processo, como os neutrófilos que secretam a enzima mieloperoxidase (MPO). Os níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias, como fator de necrose tumoral (TNF)-α, interleucina (IL)-1β e IL-6, atuam na resposta inflamatória e induzem o agravo ocasionado pelo refluxo. Um ponto importante na recuperação do tecido esofágico é o processo de remodelagem, controlado pela atividade de metaloproteinases de matriz (MMP), que regulam a cicatrização dos danos teciduais. Atualmente, a terapia farmacológica utilizada para o tratamento da DRGE é o uso dos fármacos inibidores da bomba de prótons (IBPs), como o lansoprazol (LZ), que atuam na inibição da liberação de íons H+ para o lúmen gástrico. Na maioria das vezes, os IBPs são eficazes, mas seu tratamento a longo prazo pode gerar efeitos colaterais, como diarreia, náusea e complicações renais. Novos agentes terapêuticos, como produtos provenientes de plantas medicinais que são opções terapêuticas com eficácia. Dentre eles, encontra-se o citral (CT), um monoterpeno presente em óleos essenciais de plantas, como o capim-limão. Esse monoterpeno possui diversas propriedades farmacológicas comprovadas, como: anti-inflamatórias, anti-diabéticas, anti-adipogênicas e ação gastroprotetora no tratamento de úlceras induzidas por fármacos anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs). Contudo, não existem dados na literatura, que demonstrem a ação do CT no combate à DRGE. Em face a essa lacuna, esse estudo se propôs a avaliar o efeito do CT na DRGE em animais eutróficos e obesos. Foram utilizados camundongos machos (C57BL/J6) que receberam dieta padrão (DP) ou dieta hiperlipídica (HFD), por 18 semanas, para indução da obesidade. Posteriormente, avaliamos o efeito preventivo do citral (25, 100 ou 300 mg/kg) frente a DRGE. Os camundongos foram tratados oralmente por gavagem e, após uma hora, foram submetidos ao procedimento cirúrgico de indução do refluxo gastroesofágico, sendo eutanasiados após quatro horas para coleta do esôfago. Nossos resultados demonstram que o tratamento prévio com CT nos animais que receberam ambas as dietas foi efetivo na prevenção das lesões induzidas pelo refluxo gastroesofágico, em relação ao grupo tratado com veículo (p < 0,001 e p < 0,0001, respectivamente). Além disso, no grupo DP houve diminuição do pH esofágico dos animais que receberam a dose de 100 mg/kg de CT, quando comparado ao grupo Sham. No grupo HFD, houve um aumento significativo do pH esofágico nos grupos tratados com LZ e com CT (300 mg/kg) quando comparados aos grupos veículo ou Sham (p < 0,01). Observou-se uma diminuição significativa dos níveis de CAT nos animais tratados com LZ e CT do grupo DP (25, 100 ou 300 mg/kg), porém em comparação ao grupo Sham. Com relação aos níveis de SOD e GSH, não foi observada diferença significativa entre os tratamentos, em ambas as dietas. A atividade da enzima MPO foi quantificada e houve uma redução significativa em sua atividade nos animais tratados com CT na dose de 300 mg/kg, quando comparado ao grupo veículo no grupo DP (p < 0,05). No grupo HFD, a redução da atividade da MPO foi evidenciada nos grupos LZ e CT (100 ou 300 mg/kg) quando comparado ao grupo veículo DP (p < 0,05). Por outro lado, o tratamento com CT não promoveu alterações significativas nos níveis de MMP-2 e 9 do tecido esofágico. Também, observamos um aumento significativo da IL-6 no grupo tratado com CT (300 mg/kg) quando comparado ao grupo Sham, em ambas as dietas. Além disso, os resultados mostraram um aumento significativo de TNF-α nos animais tratados com CT (300 mg/kg) quando comparado ao grupo Sham que recebeu DP. Sendo assim, esse trabalho demonstrou que o CT apresentou uma ação protetora na DRGE nos grupos tratados com CT, porém observamos uma maior efetividade no grupo que recebeu HFD de acordo com os parâmetros avaliados.
O consumo crônico de etanol impacta o desempenho e a produção de energia do ventrículo esquerdo de ratos machos e fêmeas
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-08-26) Camargo, Victória Mokarzel de Barros; Martinez, Francisco Eduardo [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Introdução: Nosso grupo de pesquisa encontrou feixe de fibras espaçadas, estriações celulares menos evidentes, deposição de feixes de fibras colágenas e maior presença de fibroblastos no tecido cardíaco de ratos que ingeriram etanol, de forma voluntária e crônica. Além disso, observamos aumento na divisão e morte celular de cardiomiócitos. Para descobrir se essas alterações levam a diminuição do desempenho do coração e geram danos mitocondriais, alguns testes clínicos e moleculares foram realizados. Objetivo: investigar se a ingestão crônica de etanol altera o desempenho e a produção de energia do ventrículo esquerdo de ratos machos e fêmeas da variedade UChB. Material e métodos: dez machos e dez fêmeas adultas de ratos da variedade Wistar, denominados UChB (Universidade do Chile), bebedores espontâneos de alta concentração de etanol (consumo maior que 2 g de etanol / Kg de peso corpóreo / dia) e dez ratos UChB machos e dez ratas UChB fêmeas adultas, não expostos ao etanol, ratos UChBC (controles) foram utilizados. O desempenho cardíaco foi avaliado pelo teste de esforço, eletrocardiograma e ecocardiograma. A determinação da taxa de reposição tecidual foi feita com o Ki 67 (mitose) e CYCS (apoptose). A avaliação do dano mitocondrial foi realizada através da quantificação da COX-IV, SDH-A e ADH. Resultados: O etanol crônico gera menor ganho de peso e aumento do peso relativo do coração em machos e fêmeas expostas, aumento do intervalo QT, diminuição do intervalo RR e aumento da FC em fêmeas expostas. Aumento da espessura diastólica da parede posterior do VE (EDPP), da espessura diastólica do septo interventricular (EDSIV) e espessura relativa do VE (ERVE) foram verificados em machos expostos. Entre os sexos, a exposição levou ao aumento do diâmetro diastólico (DDVE), diâmetro sistólico (DSVE), espessura diastólica do septo interventricular (EDSIV) e índice de desempenho miocárdico (Tei) nos machos. Nas investigações acerca da biogênese mitocondrial e sobrevivência celular, verificamos menor quantidade das proteínas SDHA e COXIV em machos e fêmeas expostos e aumento na concentração de CYCS em fêmeas expostas. Conclusões: há remodelação cardíaca concêntrica e lesão mitocondrial, diminuindo o desempenho e a produção de energia do ventrículo esquerdo de ratos machos e fêmeas da variedade UChB, sendo as fêmeas mais sensíveis.
Efeitos subletais e transgeracionais do Sulfoxaflor sobre o inseto não-alvo Ceraeochrysa claveri (Neuroptera: Chrysopidae)
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-05-30) Pereira, Aime Giovanna; Santos, Daniela Carvalho dos [UNESP]; Scudeler, Elton Luiz; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A espécie Ceraeochrysa claveri é um importante predador polífago na sua fase larval, atuando em diferentes agroecossistemas, o que o torna um potente aliado dos produtores agrícolas no combate a insetos pragas. Porém, o uso de novas moléculas inseticidas pode prejudicar as fases de desenvolvimento ou comprometer as funções metabólicas de inimigos naturais, necessários para o controle natural de pragas. Inseticidas a base de sulfoxaflor como princípio ativo estão se tornando populares entre os agricultores por possuir um amplo espectro de eficácia contra pragas, sendo utilizado em agroecossistemas que também acomodam C. claveri. Com o propósito de avaliar os efeitos do sulfoxaflor em C. claveri, posturas de ovos de Diatraea saccharalis foram tratadas com soluções contendo sulfoxaflor (formulação comercial Verter SC®), nas concentrações correspondendo a 10, 30 e 50% da CL50 e posteriormente oferecidas ad libitum para larvas de primeiro instar de C. claveri durante 10 dias. Após esta exposição por ingestão, o mesêntero (intestino médio) e os túbulos de Malpighi das larvas foram coletados para análise morfológica (histológica e ultraestrutural). Adultos (Geração F0) que foram submetidos aos tratamentos quando larva, foram sexados e separados em casais para avaliarmos parâmetros biológicos, como longevidade dos adultos, fertilidade e fecundidade, período de pré-oviposição e ovoposição, mortalidade e duração das fases do ciclo de vida, os dados foram utilizados para análise estatística. Larvas (Geração F1) oriundas do cruzamento de F0 foram acompanhadas durante todo seu ciclo de vida para avaliação de possíveis efeitos transgeracionais na progênie, parâmetros biológicos como mortalidade e duração das fases do ciclo de vida foram avaliados diariamente. Os resultados obtidos indicaram alterações morfológicas nas células dos órgãos investigados, assim como algumas diferenças estatísticas significativas dos grupos experimentais em relação ao controle, tanto na geração F0 quanto na geração F1. Foram identificadas diferenças estatísticas na fecundidade e fertilidade dos insetos da geração F0 e no ciclo de vida das larvas da geração F0 e da F1. As células do epitélio intestinal e dos túbulos de Malpighi dos grupos experimentais apresentaram grande vacuolização citoplasmática e aumento da atividade autofágica. Nas células do mesêntero, protusões citoplasmáticas apicais e descolamento/espaçamento basal em relação à membrana basal também foram detectadas, além da presença de grande quantidade de grânulos de cálcio nas células dos órgãos dos grupos experimentais, principalmente nas células epiteliais dos túbulos de Malpighi, o que pode estar relacionado ao papel deste íon no aumento da produção dos fluidos para excreção e, consequentemente, para o processo de desintoxicação celular. Apesar dos resultados estatísticos relacionados aos parâmetros biológicos e transgeracionais de C. claveri mostrarem diferenças significativas relacionadas aos efeitos do inseticida nos grupos experimentais e os resultados morfológicos apresentarem alterações celulares importantes, o impacto do sulfoxaflor, neste modelo de bioensaio, não foi expressivo negativamente, a ponto de comprometer a sobrevivência da espécie no ambiente onde se faz uso de subdoses deste inseticida, o que parece indicar uma tolerância deste inseto ao inseticida avaliado.
Efeito do tratamento local com nanoemulsão de própolis verde no sítio de extração dental de ratas com os principais fatores de risco para osteonecrose dos maxilares associada à terapia medicamentosa
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-05-31) Freire, Jéssica De Oliveira Alvarenga [UNESP]; Ervolino, Edilson [UNESP]; Sforcin, José Maurício [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Os bisfosfonatos são medicamentos antirreabsortivos empregados para tratamento de doenças/lesões osteolíticas, cujo uso tem como efeito adverso a osteonecrose dos maxilares associada à terapia medicamentosa (ONM-M). O estabelecimento de terapias preventivas efetivas e seguras para a ONM-M é importante, pois seu tratamento pode ser pouco resolutivo. A própolis é um material resinoso produzido por abelhas que apresenta ações antimicrobiana, bioestimulatória, imunomodulatória, anti-inflamatória e antioxidante. Seu uso sob forma de nanoemulsão, com objetivo de melhora de solubilidade, absorção e efeitos, pode se constituir em uma promissora estratégia terapêutica preventiva para a ONM-M. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da administração local de nanoemulsão de própolis verde no sítio de extração dental de ratas com os principais fatores de risco da ONM-M. Sessenta ratas foram divididas em seis grupos experimentais: VEI, VEI-PRO1, VEI-PRO2, ZOL, ZOL-PRO1 e ZOL-PRO2. Grupos VEI foram tratados com veículo (solução de cloreto de sódio 0,9%) e grupos ZOL com zoledronato (100μg/kg) durante todo período experimental (7 semanas). Em todos os animais, o primeiro molar inferior esquerdo foi submetido à periodontite induzida por ligadura e extraído. Os grupos VEI e ZOL não receberam nenhum tratamento local após a exodontia. Nos grupos VEI-PRO1 e ZOL-PRO1 foi realizada administração local de nanoemulsão de própolis verde de baixa viscosidade e nos grupos VEI-PRO2 e ZOL-PRO2, nanoemulsão de própolis verde de alta viscosidade. Foram realizadas 10 sessões de tratamento local, começando imediatamente após a exodontia e a cada 48 horas. No 28° dia pós-operatório, as ratas foram submetidas à eutanásia. As hemimandíbulas esquerdas seguiram para as análises: clínica intra e extrabucal; histopatológica do sítio de extração dental e da mucosa sobrejacente; histométrica de porcentagem de tecido ósseo neoformado (PTONF) e de porcentagem de tecido ósseo não vital (PTONV) no sítio de extração dental e adjacências; e imunoistoquímica para TGF-β1, VEGF, BMP-2/4, OCN, TRAP e NF-κB. Os dados foram submetidos análise estatística com nível de significância de 5%. ZOL apresentou reparo severamente comprometido, reduzida PTONF e alta PTONV. VEI, VEI-PRO1 e VEI-PRO2 apresentaram padrões de reparo, PTONF, PTONV e padrões de imunomarcação semelhantes. ZOL-PRO1 e ZOL-PRO2 tiveram reparo mais favorável, maior PTONF e menor PTONV comparados com ZOL. Os padrões de imunomarcação para ZOL-PRO1 e ZOL-PRO2 foram mais parecidos com VEI que com ZOL. Assim, a nanoemulsão de própolis verde foi capaz de melhorar o curso do reparo alveolar e prevenir o desenvolvimento de lesões osteonecróticas em ratas com os principais fatores de risco para a ONM-M.
Desenvolvimento e performance reprodutiva da prole feminina de ratas Wistar expostas à sertralina associada ou não ao estresse na gestação ou na lactação.
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-05-27) Moura, Mayara Silva [UNESP]; Kempinas, Wilma De Grava [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Os inibidores seletivos de recaptação de serotonina (ISRS) são os medicamentos de escolha para mulheres com quadros depressivos nos períodos gestacional e lactacional. No entanto, o uso desses antidepressivos nos períodos pré e pós-parto tem sido correlacionado com diversas alterações na prole em animais e humanos. A sertralina (ST) é um dos ISRSs mais usados na gestação e na lactação, mas pouco se sabe sobre o impacto da sua utilização nestes períodos, especialmente em relação à prole feminina. Assim, o objetivo do presente trabalho foi avaliar os efeitos da exposição gestacional (associada ou não ao estresse) ou lactacional à ST sobre o desenvolvimento somático, de reflexos, neucomportamental e reprodutivo da prole feminina de ratas Wistar. Na exposição gestacional, ratas Wistar prenhes receberam ST (20 mg/Kg/dia diluída em veículo) via gavagem associada ou não a estresse de contenção por 1 h/dia nos dias gestacionais 13 ao 20 (n=7-10). Na exposição lactacional, ratas Wistar lactantes foram tratadas com a ST (10mg/Kg/dia e 20mg/Kg/dia diluída em veículo) via gavagem durante toda a lactação (n=9/10). O peso corpóreo das mães e o consumo de ração no período de tratamento foram avaliados no experimento da exposição lactacional. Em ambos os experimentos, a prole feminina foi avaliada quanto ao peso corpóreo, ganho de peso e marcos do desenvolvimento somático e de reflexos. O teste do labirinto em cruz elevado foi realizado na prole jovem e adulta em ambos os experimentos. Foram avaliados os seguintes parâmetros do desenvolvimento e da função reprodutiva: distância ano-genital, instalação da puberdade, ciclo estral, peso de órgãos genitais, histomorfometria do útero e do ovário das ratas púberes e adultas, comportamento sexual e teste de fertilidade. Os resultados foram comparados entre os grupos pelos testes paramétricos ANOVA two-way (para o experimento realizado durante a gravidez) e ANOVA one-way (para o experimento realizado durante a lactação) seguidos pelos testes de Tukey, e pelos testes não paramétricos Kruskal-Wallis seguido pelo teste de Dunn ou teste do Chi-quadrado. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando p ≤ 0,05. A exposição in utero à ST, independente da exposição ao estresse, reduziu o peso corpóreo ao nascimento, atrasou a erupção dos incisivos, aumentou o peso absoluto das tireoides no dia pós-natal (DPN) 80 e alterou o ciclo estral das ratas. A exposição à ST combinada ao estresse também provocou aumento no peso absoluto e relativo das tireoides no DPN 42, além de aumentar o peso relativo das tireoides, o peso absoluto do útero e a porcentagem de estruturas ovarianas DPN 80. No grupo ST, também foi observado peso corpóreo reduzido no DPN 21, menor ganho de peso no período pré-desmame, atraso no aparecimento de pelos e aumento do comportamento relacionado à ansiedade na prole jovem. O tratamento com a ST durante a lactação não alterou o peso corpóreo materno ou o consumo de ração. A exposição lactacional à maior dose de ST reduziu o peso corpóreo no DPN 7, enquanto ambos os grupos tratados apresentam pesos corpóreos reduzidos no DPN 21. No grupo tratado com a maior dose de ST, também foram observadas adrenais e hipófises com maiores pesos relativos no DPN 21. O grupo tratado com a dose de 10 mg/Kg apresentou atraso na ocorrência do primeiro estro e redução no peso absoluto da hipófise no DPN 42. Ambos os grupos expostos à ST apresentaram redução na altura do endométrio no DPN 75 e aumento nos pesos relativos das tireoides no DPN 42, embora apenas o grupo tratado com a maior dose tenha apresentado tireoides aumentadas no DPN 75. Conclui-se que o tratamento com ST, nessas condições experimentais, teve repercussões em parâmetros reprodutivos, no crescimento inicial, no peso das tireoides, na maturação somática e no desenvolvimento neurocomportamental e de reflexos da prole feminina de ratas, o que levanta o questionamento em relação a segurança da utilização desse antidepressivo na clínica humana nos períodos gestacional e lactacional.
Estabelecimento de modelo in vitro para estudo de efeitos de miRBARTs do EBV em células humanas de epitélio nasofaríngeo
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-05-06) Rocha, Viviana Loureiro; Oliveira, Deilson Elgui de [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A infecção pelo vírus de Epstein-Barr (EBV) está associada a alguns tipos de cânceres, como o linfoma de Burkitt (BL) e o carcinoma de nasofaringe (NPC). O EBV é ubíquo e infecta, de forma latente, a maioria da população adulta. A latência biológica do EBV é caracterizada por elevada restrição na expressão de produtos virais, sendo limitada a poucas proteínas e RNAs não codificantes, como os miR-BARTs. A superexpressão de miR-BART 7 no NPC regula a expressão do produto do gene supressor tumoral PTEN. O miR-BART 9, por sua vez, regula a expressão da oncoproteína viral LMP1 e de caderina E celular. A regulação da expressão destas proteínas sugere papel dos miR-BARTs 7 e 9 no fenômeno de transição epitelial-mesenquimal (EMT), importante para progressão de cânceres de origem epitelial. Dessa forma, este estudo tem como objetivo a criação de um modelo experimental para verificar o papel exercido por miR-BART 7 e miR-BART 9 na aquisição de características favoráveis a carcinogênese. O modelo estabelecido baseia-se em células de epitélio de nasofaringe infectadas com partículas virais selvagens ou mutadas para estes miRNAs. A construção deste modelo emprega a tecnologia CRISPR/Cas9 para edição do genoma do EBV em células Akata-EBV+. As células Akata-EBV+ com genoma selvagem ou mutado foram quimicamente tratadas para ativação de ciclo lítico, e produção de partículas virais. A validação foi realizada a partir da expressão de marcadores de ciclo lítico, BZLF1 e gp350, enquanto a quantificação das partículas produzidas foi realizada a partir de curva-padrão com o genoma B95-8. A infecção de células epiteliais de nasofaringe foi avaliada a partir da estimativa do número de cópias do genoma viral. As células Akata-EBV+ contendo os genomas com comprometimento da expressão dos miR-BARTs 7 ou 9 apresentaram deficiência na produção de partículas virais quando comparadas as células contendo o genoma selvagem, enquanto na infecção de células epiteliais de nasofaringe, o comprometimento da expressão dos miR-BARTs 7 ou 9 influenciou positivamente, aumentando o número de cópias virais nas células infectadas com as versões editadas. Os dados apresentados demonstram estabelecimento de modelo experimental de estudo dos miR-BARTs do EBV, e indicam uma possível relação com eventos relacionados ao ciclo lítico do vírus.
Expressão das conexinas 26, 32, 43 e panexina 1 em diferentes etapas da hepatocarcinogênese química associada à fibrose em camundongos C3H/HeJ.
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-05-27) Sensulini, Luis Artur; Barbisan, Luis Fernando [UNESP]; Cogliati, Bruno [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O câncer de fígado é a quarta maior causa de mortes relacionadas ao câncer com crescente aumento de incidência e mortalidade no mundo nas últimas décadas, tendo como principal representante o carcinoma hepatocelular (CHC). Um dos mecanismos de controle da homeostasia celular é a comunicação intercelular realizada por canais específicos que inclui as famílias de proteínas das conexinas (Cxs) e panexinas (Panxs). No fígado, a Cx32 e Cx26 são as principais formadoras de junções GAP hepáticas, além das células endoteliais sinusoidais que expressam, preferencialmente, a Cx43. Estudos demonstraram que a Cx26 e Cx32 tem expressão elevada no fígado normal e até mesmo em lesões pré-neoplásicas, mas baixa expressão no CHC. Outros estudos demonstraram correlação positiva entre a hiperexpressão da Panx1 com pior prognóstico e risco maior de ocorrência de metástase nos pacientes. Assim, no presente trabalho avaliou-se o comportamento da expressão das Cxs 26, 32 e Panx1 ao longo do processo de hepatocarcinogênese associada à fibrose em camundongos C3H/HEJ, em lesões pré-neoplásicas e neoplasias pela técnica de imunofluorescência. Dessa maneira, camundongos C3H/HEJ, com 14 dias de idade, receberam injeção intraperitoneal (i.p) de 25 mg/kg peso corpóreo (p.c.) de dietilnitrosamina (DEN), ou seu veículo (NaCl 0,9%) no caso do grupo controle. A partir da 8ª semana de vida, por um período de 8 a 29 (grupo interrupção) ou 8 a 46 semanas (grupo contínuo), os camundongos receberam 3 doses i.p semanais de tetracloreto de carbono (CCl4, solução a 10% em doses escalonadas de 0,25 a 1,50 µL/g peso corpóreo, sendo esta última mantida até o final das aplicações). Nas semanas 17, 30 e 47, os animais foram eutanasiados. Amostras de soro e de fígado (com ou sem tumores) foram coletadas para análise sérica de alanina aminotransferase (ALT) ou para histologia/immunoistoquímica e imunofluorescência. A incidência e multiplicidade de lesões hepáticas pré-neoplásicas e neoplásicas foram comparadas nos diferentes pontos de eutanásia. Em geral, os resultados demonstraram que a continuidade de aplicações de CCl4 da 30-46ª semana não influenciaram no tamanho e incidência das lesões macroscópicas ou de adenomas e CHC quando comparado com o grupo interrupção, embora com níveis séricos de ALT maiores no grupo contínuo. Os níveis de proliferação celular Ki-67+, nos adenomas e CHC, foram similares nos grupos de interrupção e contínuo de aplicações de CCl4. A deposição de colágeno nos grupos tratados com CCl4 foi mais intensa no grupo interrompido. Além disso, a expressão da Cx26 e Cx32 foi menor nas lesões hepáticas pre-neoplásicas e neoplásicas em comparação com tecido hepático normal (grupo controle) e no tecido adjacente (grupo DEN/CCl4), com correlação negativa de ambas Cxs com os níveis de Ki-67+. Não houve diferença significativa de expressão de Panx1 6 entre os grupos tratados ou controle, nos diferentes períodos de eutanásia ou evolução da hepatocarcinogênese. Em conclusão, os resultados indicam o modelo animal utilizado pode ser reproduzido com menor número de aplicações de CCl4 e que a expressão das Cxs 26 e 32 são marcadores precoces do processo de carcinogênese associado a fibrose. As próximas etapas, consistem na realização e análise da expressão gênicas das Cxs e Panx1, em amostras de RNA extraídas a partir de microdissecção a laser já realizada de áreas de FHA, adenomas e CHC e tecido hepático normal, além da quantificação de imunofluorescência da Cx43.
Filogenia e potencial de virulência de isolados híbridos de Escherichia coli enteropatogênica atípica/enteroagregativa (aEPEC/EAEC) do sorotipo O3:H2 obtidos durante a investigação de um surto de diarreia no Brasil
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-02-11) Lira, Daiany Ribeiro Paz de; Hernandes, Rodrigo Tavanelli [UNESP]; Santos, Luis Fernando dos; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) e enteroagregativa (EAEC) são dois dos principais patotipos de E. coli diarreiogênica (ECD) causadores de doenças ao redor do mundo. A EPEC atípica (aEPEC) produz a lesão attaching and effacing nas células hospedeiras infectadas, levando ao acúmulo de F-actina e à formação de estruturas semelhantes a um pedestal sob as bactérias aderentes. A EAEC adere às células epiteliais formando um arranjo semelhante a tijolos empilhados, conhecido como padrão de aderência agregativa (AA), devido à produção de várias fímbrias de aderência agregativa (AAF/I-AAF/V). O objetivo do presente estudo foi investigar as características genotípicas e fenotípicas de isolados de E. coli híbridos de aEPEC/EAEC, pertencentes ao sorotipo O3:H2, bem como de isolados de aEPEC e EAEC do mesmo sorotipo, todos obtidos durante a investigação de um surto de diarreia, com o intuito de avaliar a influência da combinação de fatores de virulência na patogenicidade e melhor compreender a evolução desses híbridos. A partir de um surto de diarreira, foram obtidos um isolado de aEPEC (eae+/bfpB-), quatro EAEC (aggR+) e três híbridos de aEPEC/EAEC (eae+/bfpB-/aggR+), sendo todos os oito isolados do sorotipo O3:H2. Esses isolados foram caracterizados quanto à classificação dos filogrupos de E. coli, presença de genes codificadores de fatores de virulência associados à patogênese de EPEC e EAEC, análise do perfil plasmidial, padrão de aderência em células HeLa, formação de biofilme e teste de FAS (fluorescent actin staining). Todos os oito isolados estudados foram atribuídos ao filogrupo A. Observou-se que as EAEC e os híbridos de aEPEC/EAEC albergam vários genes do plasmídio de aderência agregativa (pAA), como aatA, aap, orf3, aar, aggA e aggC (codificando a pilina e o usher de AAF/I, respectivamente), além de apresentarem um plasmídio de alto peso molecular. Por outro lado, os isolados de aEPEC e os híbridos aEPEC/EAEC albergam dois genes cromossômicos, nleC e nleF, que codificam efetores secretados pelo sistema de secreção tipo 3. Juntos, esses dados sugerem que o background de aEPEC deve ter servido como um receptor para o pAA, originando assim os isolados híbridos de aEPEC/EAEC. As EAEC e os híbridos aEPEC/EAEC produziram o padrão AA, enquanto a aEPEC aderiu esporadicamente às células epiteliais. Conforme observado no ensaio de FAS, a aEPEC foi incapaz de promover o acúmulo de F-actina sob as bactérias aderentes, enquanto os híbridos aEPEC/EAEC foram FAS-positivos. Diferentemente do isolado de aEPEC, os quatro isolados de EAEC e os três híbridos de aEPEC/EAEC produziram biofilme na superfície abiótica, apontando a influência do pAA para o estabelecimento deste fenótipo. Esse estudo revelou a alta plasticidade da E. coli patogênica do sorotipo O3:H2 na aquisição e manutenção de genes que codificam a virulência. No entanto, a busca por novos híbridos é continuamente necessária para melhor entender quais eventos estão envolvidos no surgimento desses híbridos e como diferentes combinações genéticas podem influenciar sua patogenicidade.

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