Teses - Biologia Geral e Aplicada - IBB

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Exposição ao antidepressivo sertralina associado ou não ao estresse/ou probiótico em diferentes períodos do desenvolvimento: uma abordagem sobre os impactos reprodutivos e neurocomportamentais em roedores
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-07-31) Lozano, Ana Flávia Quiarato; Kempinas, Wilma De Grava [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A depressão, o estresse e a ansiedade são comumente observados na população, e como consequência o consumo de antidepressivos tem aumentado exponencialmente nos últimos anos. A sertralina (SE), classificada como inibidor seletivo de recaptação de serotonina (ISRS), é um antidepressivo/ansiolítico utilizado por pessoas com distintos transtornos psiquiátricos e diferentes faixas etárias. Os ISRS podem provocar graves efeitos colaterais, no entanto existem poucos relatos sobre os impactos da SE em aspectos reprodutivos e comportamentais, tampouco há tratamentos adjuvantes que amenizem seus efeitos indesejáveis. Sabendo-se dos benefícios dos probióticos no eixo microbiota-intestino-cérebro e sua ação benéfica na saúde reprodutiva, o presente estudo investigou os impactos da exposição à SE associada ou não ao estresse/ ou probiótico, em diferentes períodos do desenvolvimento de roedores. Testes estatísticos utilizados: ANOVA (seguido pelo teste de Tukey) ou Kruskal-Wallis (seguido pelo teste de Dunn) (p≤0.05). Para o experimento I e II, ratas Wistar prenhes foram distribuídas nos grupos (n=20-18 ratas/grupo): CO - receberam água filtrada; SE – receberam 20 mg/kg de SE; ST - animais submetidos ao estresse por contenção e receberam água filtrada; ST/SE - animais submetidos ao estresse e receberam 20 mg/kg de SE. O tratamento foi realizado por via gavagem entre os dias gestacionais (DG) 13 ao 20. Parte das fêmeas prenhes foram eutanasiadas no DG 20 para análise dos fetos, e o restante foi mantida até o final da lactação. No experimento I, a maturação somática, o desenvolvimento de reflexos, e o neurocomportamento foram investigados na prole masculina. No experimento II, foram analisados no DG 20, e nos dias pós-natais (DPN) 21, 45 e 110, a histologia dos testículos e epidídimos, bem como a imuno-histoquímica testicular do antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) e proteína do tumor de Wilms (Wt1). A morfologia, motilidade e vitalidade espermáticas foram observadas no DPN 110, assim como a produção diária de espermatozoides e seu tempo de trânsito epididimário. Os resultados do experimento I mostraram que a exposição gestacional à SE provocou redução do peso corporal e sangramento vaginal nas mães. Já a prole masculina do grupo SE apresentou atrasos na erupção dos incisivos, no aparecimento de pelos e na realização de geotaxia negativa. Além disso, o grupo SE foi menos exploratório (personalidade ansiosa) em comparação com os grupos CO e ST. No experimento II, observou-se que os testículos fetais apresentaram grande número de células acidófilas, que representam células em processo de morte celular, nos grupos expostos à SE. O grupo ST/SE também apresentou diminuição do volume nuclear das células de Leydig. Este mesmo grupo mostrou baixa expressão de PCNA e WT1, diminuição do peso dos testículos e epidídimo, menor distância anogenital (DAG) e atraso na instalação da puberdade. Os animais adultos, expostos in útero à SE apresentaram alterações na morfologia e motilidade espermática. O experimento III foi conduzido de forma a investigar as repercussões reprodutivas e comportamentais da exposição lactacional à SE. Para tanto, 30 ratas Wistar lactantes foram distribuídas em 3 grupos experimentais (n=10/grupo): grupo CO- recebeu água filtrada, grupos S10 e S20 receberam, respectivamente, 10 e 20 mg/kg/dia de SE. O tratamento foi realizado por via gavagem do 1º ao 20º dia de lactação. Nesse período, observou-se o desenvolvimento de reflexos e somáticos da prole masculina, bem como o comportamento materno. No dia 21, as mães foram eutanasiadas, e nos dias 21, 45 e 100, um macho de cada ninhada foi eutanasiado. Além das metodologias realizadas no experimento I e II, também foram observados o comportamento sexual e fertilidade natural. Os resultados mostraram que a prole masculina exposta à SE apresentou menor peso corporal, menor DAG e alterações no desenvolvimento dos reflexos, além de alterações histológicas nos testículos. Na idade adulta, a maioria dos parâmetros analisados foram normalizados, porém, a qualidade espermática mostrou-se alterada, sem comprometimento da fertilidade natural. O experimento IV investigou os efeitos da SE nos parâmetros reprodutivos de camundongos adultos, bem como verificou se o probiótico Lactobacillus rhamnosus (Lr) reduz os efeitos colaterais desse antidepressivo. Assim, duas etapas consecutivas foram desenvolvidas. Na 1ª etapa, quatro grupos experimentais (n=6/grupo) foram formados: Grupo CO recebeu água filtrada (veículo); e grupos S10, S20 e S40 receberam respectivamente 10, 20 e 40 mg/Kg de SE diluída em veículo. O tratamento ocorreu via gavagem por 30 dias. Ao final do tratamento, foram analisados a qualidade espermática, o peso de órgãos e a histologia dos testículos e epidídimos. Na 2ª etapa, 32 camundongos foram distribuídos em 4 grupos experimentais (n=8/grupo): Grupo CO recebeu água filtrada (veículo); grupo S –recebeu 20 mg/Kg de SE; grupo P- recebeu o probiótico Lr (1×109 UFC), diluído em veículo; e grupo SP que recebeu tanto LR quanto SE. Ao final do tratamento, por via gavagem, foram analisadas a histologia dos testículos e epidídimos, qualidade espermática, verificação da fertilidade natural. De forma complementar, ensaio in vitro foram realizados com o intuito de identificar os efeitos da SE sobre a reação acrossômica durante a capacitação e fertilização in vitro. Os resultados da 1ª etapa demonstraram que os animais dos grupos S10 e S20 apresentaram diminuição do peso das glândulas seminais em relação ao grupo CO (p<0.05). Na 2ª etapa, observou-se que o grupo S também teve uma menor glândula seminal. Esta, no grupo SP, manteve-se com peso semelhante ao grupo CO. Embora um atraso no tempo de trânsito espermático tenha sido observado no grupo SP, a fertilidade natural não foi comprometida. Além disso, esse mesmo grupo apresentou maior número de fetos e menor número de reabsorções comparado ao grupo S (p<0.05). Nos testes neurocomportamentais, observou-se que os perfis dos animais dos grupos P e S foram diferentes entre si (p<0.05), sendo este último menos exploratório e mais ansioso. Assim, os quatro experimentos aqui desenvolvidos demonstram que a SE tem impacto no sistema reprodutor e no neurocomportamento de roedores em diferentes fases da vida. E pela primeira vez, demonstrou-se que o probiótico foi capaz de atenuar estes efeitos colaterais.
Ação antibacteriana da própolis vermelha sobre Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) e imunomoduladora sobre monócitos humanos in vitro
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-07-07) Ripari, Nicolas; Sforcin, José Maurício [UNESP]; Fernandes Júnior, Ary [UNESP]; Rall, Vera Lúcia Mores [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O objetivo desta tese de doutoramento foi analisar a atividade antibacteriana da própolis vermelha em associação ou não com antimicrobianos sobre Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA), a ação imunomoduladora em monócitos humanos (CD14+ ) isolados por beads magnéticas, e a capacidade de killing bacteriano dos monócitos sobre MRSA. Inicialmente, foi realizada uma revisão de literatura sobre a possibilidade de a própolis e seus constituintes exercerem ação contra MRSA. Em seguida, foi investigada a ação da própolis vermelha em combinação ou não com β-lactâmicos sobre MRSA e mecanismos envolvidos. Finalmente, as concentrações de própolis vermelha e de antimicrobiano que melhor exerceram ação antibacteriana in vitro foram avaliadas em monócitos, para observar um possível efeito imunomodulador. A revisão inicial demonstrou que os diversos tipos de própolis encontrados no globo e seus principais constituintes podem agir de forma inibitória contra diversas cepas e isolados de MRSA bem como em suas principais moléculas relacionadas à sua resistência à drogas. No capítulo 2, apresentamos o manuscrito proveniente da primeira fase da realização deste projeto, onde demonstramos que a própolis vermelha apresentou baixas concentrações inibitórias (MIC) para diversos tipos de isolados MRSA (MIC90 = 125 µg/mL). As combinações de própolis com imipenem apresentaram sinergismo pelo método de Ckeckerboard (FICI = 0,5) e de curva de sobrevivência bacteriana com diferença estatística entre o grupo controle (p ≤ 0,0001). Esta mesma diferença estatística foi observada quando própolis e imipenem foram combinados com 25% de suas MICs nos testes de formação de biofilme, apresentando porcentagem de inibição do crescimento de biofilme menor que somente própolis ou imipenem à 75% de suas MICs sobre a maioria dos isolados (~ 47% - 64%). A porcentagem de condutividade de membrana dos isolados chegou a 100% também para esta combinação. Predições de molecular docking indicaram que o índice de energia livre de ligação dos compostos da própolis vermelha sobre a proteína ligante de penicilina 2a (PBP2a) foi parecido com ceftarolina (kcal/ mol = -7,1 a 7,8). A última fase foi avaliar a ação imunomoduladora da própolis e imipenem nas mesmas concentrações da fase I, em monócitos humanos. Observamos uma down-regulação de TLR-2 e exercida pela própolis vermelha e aumento na produção de IL-6 exercido pela combinação nos monócitos tratados. A capacidade de killing bacteriano dos monócitos, após tratamento com própolis, chegou próximo do controle LPS (~90%). A própolis vermelha em combinação com imipenem pode ser uma alternativa para o tratamento de MRSA por impedir sua multiplicação, formação de biofilme e modular ação bactericida de monócitos, provavelmente por aumento na produção de IL-6.
Identification of germ cell-intrinsic players (gdnf and long non-coding rnas) involved in the spermatogonial stem cell fate of adult zebrafish
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-06-23) Doretto, Lucas Benites; Nóbrega, Rafael Henrique [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A espermatogênese é um processo controlado por células-tronco no qual uma única célula-tronco espermatogonial (SSC) se diferencia em muitos espermatozoides haploides. A divisão de uma SSC pode resultar em duas células tronco (divisão simétrica), ou em uma célula tronco e outra diferenciada (divisão assimétrica). Independentemente do tipo de divisão celular, o processo de auto-renovação e diferenciação é controlado por numerosos sinais provenientes do tecido somático circundante, assim como também de fatores intrínsecos da própria SSC. Nesse sentido, estudos recentes mostraram que RNAs não codificantes (microRNAs, cirRNAs, lncRNAs) podem desempenhar um papel fundamental na reprodução, em particular na regulação da determinação sexual, diferenciação sexual e gametogênese. Entre os RNAs não codificantes, os lncRNAs se destacam por desempenhar papel regulatório na transcrição de "genes mestres" envolvidos em vários processos biológicos, incluindo a diferenciação e manutenção da pluripotência de células-tronco. Considerando esse contexto, este estudo teve como objetivo entender a sinalização Gdnf-Gfrα1 em testículos de zebrafish combinando abordagens in vivo, in silico e ex vivo, além dos efeitos biológicos do Fsh em lncRNAs testiculares. Nossos dados revelaram que o Gdnf, fator derivado de célula germinativa, está envolvido na manutenção da pluripotência das células germinativas por meio da criação de nichos espermatogoniais, dando suporte ao desenvolvimento de cistos espermatogônicos e inibindo a diferenciação tardia de espermatogônias de maneira autócrina e parácrina. Além disso, neste estudo, identificamos 5161 novos lncRNAs dos quais 76 foram diferencialmente regulados pelo rzfFsh. Além disso, análises de enriquecimento das DEGs demonstrou que esses transcritos estão amplamente relacionados à sinalização e sistemas orgânicos, como o sistema endócrino. Quando focamos nos mRNAs, encontramos 270 DEGs, sendo 174 “up-regulated” 96 “down-regulated”. Interessantemente, as vias mais enriquecidas estavam relacionadas à sinalização do hormônio da tireoide e esteroidogênese. Por fim, predições de interação entre lncRNAs-mRNA-proteínas mostraram que alguns lncRNAs podem interagir, e consequentemente, modular a expressão de genes de pluripotência de SSCs, como o pou5f3, nanos3 e nanog. Em conjunto, nossos dados indicam uma provável atividade do Fsh em criar um ambiente mais favorável para a diferenciação de espermatogônias tronco.
Obesidade induzida por dieta hipercalórica: avaliação do efeito do citral na inflamação metabólica
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-09-01) Rodrigues, Vinícius Peixoto [UNESP]; Hiruma-Lima, Clélia Akiko [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A obesidade é um dos maiores problemas de saúde pública no mundo, a Organização Mundial da Saúde (O.M.S.) estima que mais de 700 milhões de adultos serão obesos em 2025. A obesidade é caracterizada por um acúmulo excessivo de gordura que pode comprometer a saúde. O tecido adiposo (TA), além de regulador energético do organismo, assume uma função imune diretamente envolvida no início e manutenção da resposta inflamatória que se estabelece com a instalação da obesidade. O TA é regulado por leucócitos e mediadores anti-inflamatórios, porém com o desenvolvimento da obesidade esse ambiente torna-se pró-inflamatório com o intuito de proteger o organismo. Essa inflamação metabólica é responsável pelo surgimento de enfermidades como diabete tipo 2 e doenças cardiovasculares. Encontrar um tratamento adequado à obesidade e seus desdobramentos têm se mostrado um grande desafio. Estudos prévios demonstraram o potencial anti-inflamatório e antiadipogênico do citral, um monoterpeno obtido das folhas do capim limão. Essas ações tornam o citral um excelente candidato a agente terapêutico no tratamento da inflamação metabólica, combatendo a obesidade e sua resposta inflamatória. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito curativo do citral no processo inflamatório relacionado à obesidade induzida por dieta hipercalórica em animais experimentais. A exposição da linhagem Swiss à dieta hiperlipídica por 84 dias induziu obesidade aumentando a massa corporal e índice de adiposidade, porém os animais não apresentaram as alterações metabólicas necessárias para que nossos objetivos iniciais fossem alcançados. A HFD oferecida aos C57BL/6J pelo mesmo período também induziu obesidade aumentando a massa corporal, índice de adiposidade, glicemia e perfil lipídico dos camundongos. O citral foi capaz de diminuir a glicemia sem alterar a sensibilidade à insulina dos animais tratados por dez e 17 dias, observou-se também a diminuição de mediadores próinflamatórios (TNF-α e IL-6) e um aumento nas citocinas anti-inflamatórias (IL-4. IL-5, IL-10, IL-13 e IL-17). nos animais obesos tratados com citral, indicando um efeito positivo contra a inflamação metabólica.
Estudo da citotoxicidade, genotoxicidade, monitoramento do ciclo celular, indução de apoptose e expressão gênica, dos extratos de folhas e caules de Rubus rosifolius em células humanas em cultura
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-12-17) Quadros, Ana Paula Oliveira De; Maistro, Edson Luis [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
As plantas com propriedades medicinais têm sido catalogadas, pesquisadas e usadas desde a antiguidade, permanecendo até hoje como fonte para o tratamento de diferentes condições. Contudo, tal utilização pode ser arriscada se não feita devidamente, daí a importância de pesquisas sobre a atividade genotóxica e citotóxica da planta em sua totalidade, bem como dos seus componentes. Rubus rosifolius, popularmente conhecida como “amora vermelha”, é uma planta medicinal comum na região Sul do Brasil, de fácil acesso, porém com propriedades biológicas pouco estudadas. Os principais usos atribuídos a ela são: antidiarreicos, para doenças estomacais, analgésico, antimicrobiano, anti-hipertensivo, dentre outras. Investigar e detalhar os potenciais efeitos tóxicos de plantas e seus constituintes é, portanto, imprescindível para que se possa garantir a segurança de seus usuários, assim como criar propostas farmacêuticas. Neste contexto, o presente estudo teve como objetivo analisar o extrato de folhas e de caules de R. rosifolius quanto aos seus potenciais efeitos citotóxicos e genotóxicos por meio de ensaios biológicos in vitro em células de hepatoma humano (HepG2/C3A) e leucócitos humanos. Os ensaios de citotoxicidade pelo teste do MTT e coloração com azul de tripan, nas concentrações entre 0,01 e 100 μg/ml de ambos os extratos, não evidenciaram diminuição significativa na viabilidade celular de células HepG2/C3A e leucócitos. Na exposição dos dois tipos celulares ao extrato de folhas, pôde-se observar efeitos genotóxicos (ensaio cometa e teste do micronúcleo) em concentrações a partir de 1 μg/ml, aumento no número de células na fase S do ciclo celular (HepG2/C3A), bem como aumento de células em apoptose nas concentrações de 10, 20 e 100 μg/ml (análises por citometria de fluxo em HepG2/C3A). Também foi observado aumento na expressão gênica do gene de metabolização de xenobióticos CYP3A4 (pelo ensaio RT-qPCR). A genotoxicidade induzida pelo extrato possivelmente foi a principal causa do aumento do número de células na fase S do ciclo, numa tentativa de reparar o dano genético, e em apoptose, como indicado pelo aumento da expressão do gene CASP7. Nas análises do extrato de caules, foram observados efeitos genotóxicos nos dois tipos celulares a partir da concentração de 1 μg/ml. O ensaio com o citômetro de fluxo indicou aumento de células HepG2/C3A na fase G2/M (na concentração de 10 μg/ml e aumento de células em G0/G1 (na concentração de 100 μg/ml), bem como aumento de células em apoptose nas três concentrações testadas. Nas análises de expressão gênica, apenas o gene CYP1A2 de metabolização de xenobióticos teve a expressão relativa 14 Campus de Botucatu PG-BGA aumentada. Novamente os resultados indicam que os danos genotóxicos do extrato possivelmente foram responsáveis pelas alterações no ciclo celular e pelo aumento de células em apoptose. Diante das condições experimentais do presente estudo, os dados obtidos permitem concluir que os extratos de folhas e de caules de R. rosifolius apresentam toxicidade celular e genética, tanto em células com metabolização hepática ativa (HepG2/C3A), quanto em células sem metabolização por enzimas hepáticas (leucócitos humanos).
Comparação dos extratos aquoso e hidroalcóolico das folhas de Bauhinia holophylla (Bong.) Steud. quanto ao efeito hipoglicemiante, com vistas à produção de medicamento fitoterápico
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-05-16) Delgado, Aislan Quintiliano; Bosqueiro, José Roberto [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Diabetes mellitus (DM) é uma doença crônica, caracterizada por hiperglicemia decorrente de defeitos na ação ou secreção de insulina, ou ambos, sendo considerado um enorme problema de saúde no mundo todo. Os atuais tratamentos do DM incluem medicamentos hipoglicemiantes orais e/ou insulinoterapia. Entretanto, possuem muitos efeitos colaterais adversos que diminuem a qualidade de vida do paciente e a resposta por uso prolongado. As plantas medicinais vêm tornando-se alvo de diversas pesquisas cientificas para comprovação de suas ações na melhora do quadro diabético e também para o compreendimento de seus mecanismos de ação. Com isso, o interesse pela pesquisa com plantas medicinais com ação antidiabética, dentre elas, Bauhinia holophylla é cada vez maior. Por meio de estudos fitoquímicos, foram identificados três compostos principais que constituem o extrato e apresentam funções antidiabéticas, que são o p-pinitol, os heterosídeos de flavonoides e o cianoglicosídeo não cianetogênico litospermosídeo. O objetivo do presente trabalho foi avaliar e comparar os efeitos do tratamento por 14 dias com os extratos hidroalcoólico e aquoso na dose de 400 mg/Kg, esse último amplamente utilizado pela população em geral, de Bauhinia holophylla em camundongos diabéticos do tipo 1 induzidos por estreptozotocina, na busca de uma alternativa para o tratamento do diabetes. Para isso, foram utilizados camundongos machos Swiss que foram separados em um grupo normoglicêmico e quatro grupos diabéticos. Foram mensurados a glicemia em jejum nos dias 7 e 14, além da ingestão alimentar, hídrica e peso corpóreo mensurados diariamente. No 14° dia, foram analisadas as sensibilidades à glicose, insulina e piruvato. Após os 14 dias de tratamento, os animais foram eutanasiados e tiveram seus órgãos pesados. Foram retirados fragmentos de músculo gastrocnêmio para a quantificação de glicogênio hepático e muscular, e o sangue foi coletado para análise dos parâmetros bioquímicos, como o perfil lipídico e a hepatotoxicidade. Os tratamentos com ambos os extratos se mostraram capazes de aumentar a tolerância à glicose e a sensibilidade à insulina. Houve diminuição da perda de proteínas e da proteólise, assim como da desidratação e, consequentemente, diminuição da perda de peso e de massa muscular. O extrato hidroalcoólico também foi o responsável por provocou diminuição da ingestão hídrica e alimentar para valores próximos aos do grupo controle, enquanto o aquoso apenas diminuiu a ingestão alimentar. O tratamento também foi responsável por melhorar o perfil lipídico dos camundongos, diminuindo os níveis de colesterol total, triglicerídeos, LDL, VLDL e aumentando o colesterol HDL, albumina sérica, proteínas totais e o armazenamento de glicogênio hepático. Em suma, os tratamentos controlaram os níveis glicêmicos, bem como apresentaram efeito positivo sobre a massa corporal, das ingestões hídrica e alimentar, dos parâmetros bioquímicos e metabólicos (tolerância à glicose e sensibilidade à insulina), evidenciando, assim, que os extratos foram capazes de melhorar o quadro diabético por apresentarem propriedades. Por fim, foi possível observar que o extrato hidroalcoólico se sobressai em relação ao extrato aquoso.
Efeitos do exercício aeróbico no músculo esquelético de ratos adultos submetidos à restrição proteica perinatal
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-02-24) Valente, Jéssica Silvino; Pai, Maeli Dal [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O tecido muscular possui uma capacidade de modulação fenotípica frente a diferentes estímulos (positivos ou negativos), alterando suas características metabólicas, funcionais e morfológicas. Sendo o maior órgão metabólico de armazenamento energético do corpo e de grande importância para locomoção e sustentação corporal, o entendimento da influência de estímulos diretos para essas características é de alta relevância. A restrição proteica materna (RPM) durante os estágios iniciais da vida (gestação e/ou lactação) leva a alterações no desenvolvimento fetal e adaptações fisiológicas da prole durante toda a vida, as quais envolvem distúrbios metabólicos sistêmicos, como obesidade e diabetes, além de alterações em diversos sistemas, como o músculo estriado esquelético. Por outro lado, sabe-se que a prática regular de exercício físico é benéfica para o organismo em resposta a diferentes doenças, sendo possível sua utilização como estratégia terapêutica para as alterações musculares derivadas da RPM. O objetivo deste trabalho foi analisar os efeitos do exercício físico aeróbico (EFA) nos músculos Sóleo (SOL), com metabolismo oxidativo/contração lenta, e Plantar (PL), com metabolismo glicolítico/contração rápida, em ratos adultos submetidos à RPM nos períodos de gestação e lactação. Foram utilizados ratos machos Sprague Dawley, provenientes de genitoras submetidas às dietas normocalóricas proteicas padrão (17%-controle) ou hipoproteica (6%-restrito) durante toda gestação e lactação. No dia pós-natal (DPN) 90, os animais foram divididos nos grupos experimentais: Controle Sedentário (CS); Controle Treinado (CT); Restrito Sedentário (RS) e Restrito Treinado (RT). Os animais dos grupos treinados foram submetidos ao protocolo de EFA de natação (oito semanas) com tempo/carga progressivos semanalmente, até completar as primeiras três semanas, com tempo/carga máxima nas últimas cinco semanas. No DPN 150, os animais foram anestesiados e sacrificados (morte humanitária), amostras dos músculos SOL e PL foram coletadas e processadas para as análises morfométrica (n=8), molecular (n=8), bioquímica (n=8) e proteômica (n=3). Os animais foram pesados durante todo o protocolo experimental (DPN 0, 21, 90, 120 e 150), e o teste oral de tolerância a glicose oral (TOTG) foi realizado no DPN 150. Os animais do grupo RS apresentaram um ganho de peso maior que os animais dos grupos controles (CS e CT), o qual foi menos acentuado nos animais RT. Os animais do grupo RS (vs CS) mantiveram as concentrações de glicose sanguínea elevada durante todo o TOTG, e aos 60min, os níveis glicêmicos foram reduzidos nos animais do grupo RT (vs RS). Os músculos SOL e PL apresentaram aumento na área de secção transversal das fibras musculares nos grupos RS (vs CS) e uma diminuição nos animais RT (vs RS). O músculo SOL apresentou uma diminuição na expressão gênica dos marcadores catabólicos Mafbx e Murf1 nos grupos RS (vs CS), e o grupo RT (vs RS) apresentou aumento no mRNA Mafbx e diminuição na expressão do marcador catabólico Igf1; a expressão gênica dos marcadores de metabolismo oxidativo Cs e glicolítico Ldha diminuiu nos animais dos grupos CT e RS (vs CS). Não foram observadas diferenças estatísticas nos genes analisados, no músculo PL. A análise de glicogênio muscular mostrou aumento nos níveis, nos animais do grupo RS, seguido de diminuição nos animais do grupo RT no músculo SOL, sem alterações no músculo PL. A análise do Proteoma apontou 57 e 33 proteínas diferencialmente expressas, no músculo SOL e PL, respectivamente, comuns entre as comparações CTxCS, RSxCS e RTxRS, as quais enriqueceram majoritariamente, o metabolismo energético muscular, com destaque para a via da glicólise e glicogênio. Concluímos que a RPM causou o efeito de crescimento acelerado corporal e muscular, levou à diminuição da oxidação da glicose com acúmulo de glicogênio no músculo SOL, e exacerbou a oxidação da glicose e o catabolismo do glicogênio no músculo PL. O EFA atenuou o efeito de crescimento acelerado e as alterações metabólicas glicolíticas no músculo SOL, intensificando esta via, no músculo PL.
Efeitos de dieta materna rica em carboidratos simples e gordura nas fases de pré e pós-concepção na mucosa colônica após administração da 1,2- dimetilhidrazina na geração de fêmeas f1: modulação pela carnosina
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-03-01) Nunes, Vania Vasti Alfieri; Barbisan, Luis Fernando [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Dietas maternas, entre elas aquelas ricas em carboidratos simples e gorduras, ingeridas durante o período pré, pós-concepção e início de vida de seus descendentes, podem gerar estresse oxidativo e inflamação em diversos órgãos, incluindo o cólon. A carnosina (CAR) é um dipeptídeo que apresenta potencial antioxidante e anti-inflamatório. Dessa forma, este estudo visa avaliar o papel protetor da CAR sobre as alterações colônicas induzidas pela administração da 1,2-dimetilhidrazina (DMH) sob influência do consumo de dieta hipercalórica ou dieta normocalórica na geração F1 de ratas Sprague-Dawley (SD). Fêmeas (F0) com 3 semanas de idade foram alocadas em 2 grupos, um grupo recebeu a dieta hipercalórica (DHC) ou dieta normocalórica (DNC) por 90 dias. Após esse período, as fêmeas foram submetidas ao cruzamento e acompanhadas quanto ao consumo de ração e peso durante a pré, pós-concepção e lactação. A prole foi mantida com a mesma dieta das mães depois do desmame e até o dia pós-natal 31 (DPN31). A geração F1 de fêmeas foi subdividida em 4 grupos distribuídos em: G1 e G2, sendo que ambos ingerirem DNC e receberam duas doses de DMH (20 mg/kg) (DPN28 e DPN31); o G2 recebeu ainda uma dose diária de CAR (250 mg/kg) por 10 dias (DPN21 ao DPN31). Os grupos G3 e G4 receberam a DHC e duas doses de DMH (20 mg/kg) (DPN28 e DPN31) e o G4 recebeu também a CAR (250 mg/kg), por 10 dias (DPN21 ao DPN31). Em seguida, os animais foram eutanasiados (DPN32) e a mucosa colônica foi coletada para análise de alturas de criptas, himunohistoquímica, atividades antioxidantes e de expressão gênica, além de amostras de sangue para avaliação de glicose, triglicerídeos e colesterol. Observou-se diminuição de consumo de DHC em animais durante o período de pré, pós e lactação. Animais que receberam CAR, que foram os grupos G2 e G4 tiveram os níveis de colesterol e triglicerídeos normalizados. Do ponto de vista morfológico foi observado uma redução nas alturas médias das criptas colônicas do grupo G2 e G3, comparadas ao G1 e recuperação das alturas das criptas do grupo tratado com CAR associado à DHC (G4). O G2 teve uma diminuição dos níveis de proliferação celular (Ki-67). Quando avaliada a dosagem de glutationa oxidada (GSSG) na mucosa colônica observou-se uma diminuição no grupo que recebeu DHC+CAR (G4) em comparação ao grupo DHC (G3). Com base nos resultados de análises gênicas identificamos o cluster de proteínas com vias fortemente enriquecidas nas comparações realizadas e a participação de genes na via de câncer colorretal. Conclui-se que a ingestão de DHC materna e no período juvenil causou alterações na altura das criptas intestinais, estresse oxidativo e perfil bioquímico e de expressão gênica da mucosa colônica após insulto agudo da DMH. O tratamento da prole de fêmeas com a carnosina contribuiu para redução de respostas da predisposição à obesidade e doenças metabólicas, através da resposta antioxidante e diminuição de vias inflamatórias, reduzindo os efeitos citotóxicos de DMH e efeitos de alterações causadas pela ingestão materna de DHC
Avaliação da eficácia e segurança do debridamento mecânico no tratamento da peri-implantite experimental em ratas tratadas com zoledronato
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-01-19) Toro, Luan Felipe; Ervolino, Edilson [UNESP]; Casatti, Cláudio Aparecido [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A osteonecrose dos maxilares associada à terapia medicamentosa (ONMM) é um efeito adverso desencadeado pelo uso de drogas com ação antirreabsortiva sobre o tecido ósseo, como é o caso dos bisfosfonatos (BFs). Nos últimos anos tem aumentado o número de casos de ONMM relacionada aos implantes odontológicos (ONMM-IO), durante ou após o uso destes fármacos. Estudos correlacionam tal terapia medicamentosa e a peri-implantite (PI) com o desencadeamento da ONMM-IO. Assim, um tratamento efetivo e seguro para a PI ao longo de uma terapia com BFs pode significar a manutenção do implante e evitar a ocorrência da ONMM-IO. O debridamento mecânico (DM) é o tratamento padrão e a primeira opção de escolha para a maioria dos casos de PI, porém, sua efetividade e segurança em pacientes sob terapia com drogas antirreabsortivas ainda não foram esclarecidas. Diante disso, o objetivo primário do presente estudo foi avaliar a efetividade e a segurança do emprego do DM no tratamento da peri-implantite experimental (PiE) em ratas com implantes osseointegrados e posteriormente tratadas com zoledronato. Ratas Wistar senescentes foram inicialmente submetidas à exodontia do incisivo superior direito e à instalação imediata de um implante de titânio no local. Após 8 semanas, nas ratas em que os implantes se encontravam osseointegrados (N=24), foi realizada a exposição da plataforma do implante e a instalação de um cicatrizador. Os animais foram divididos nos grupos: C (Controle), ZOL, ZOL-PiE e ZOL-PiE-DM. Na 9ª semana, foi iniciado o tratamento medicamentoso, o qual consistiu na administração de 0,45ml de solução de cloreto de sódio 0,9% (grupo C) ou 0,45ml da mesma solução acrescida de 100μg/Kg de zoledronato (grupos ZOL, ZOL-PiE e ZOL-PiE-DM), a cada 4 dias, durante 10 semanas. Decorridas 5 semanas do início do tratamento medicamentoso, foi instalada uma ligadura de algodão ao redor dos implantes para indução da PiE nos grupos ZOL-PiE e ZOL-PiE-DM, a qual foi mantida em posição por 5 semanas (grupo ZOL-PiE) ou por 2 semanas (grupo ZOL-PiE-DM), quando foi removida e executado o tratamento local pelo DM. A eutanásia foi efetuada na 19ª semana. As maxilas contendo os implantes foram dissecadas, submetidas ao processamento laboratorial, e as secções histológicas foram coradas pela hematoxilina-eosina para análise histopatológica, análise histométrica da porcentagem de tecido ósseo total (PTO-T) e da porcentagem de tecido ósseo não vital (PTO-NV) na região peri-implantar, ou destinadas à reação imunoistoquímica para detecção e quantificação do fator de necrose tumoral alfa (TNFα), da interleucina 1 beta (IL-1β), do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF), da osteocalcina (OCN), e da fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP). Os dados foram analisados estatisticamente com nível de significância de 5%. No grupo C, os tecidos situados ao redor do implante exibiram aspectos de normalidade. No tecido conjuntivo peri-implantar em ZOL, ZOL-PiE e ZOL-PiE-DM foi observada a presença de infiltrado inflamatório de grau leve, intenso e moderado, respectivamente. Da mesma forma, a imunomarcação para TNFα e IL-1β acompanhou os achados histopatológicos. ZOL e ZOL-PiE-DM apresentaram menor imunomarcação para VEGF em relação ao grupo C. Houve menor quantidade de células TRAP-positivas, bem como menor imunomarcação para OCN nos grupos tratados com zoledronato em relação ao grupo C, sendo que ZOL-PiE-DM apresentou ainda menor imunomarcação para OCN em relação ao ZOL. A PTO-T não diferiu entre os grupos, porém, ZOL, ZOL-PiE e ZOL-PiE-DM apresentaram maior PTO-NV em relação ao grupo C, sendo que ZOL-PiE-DM apresentou ainda maior PTO-NV em relação ao ZOL e ao ZOL-PiE. Conclui-se que o DM, empregado de forma convencional e como monoterapia, não se mostrou uma proposta efetiva e, tampouco, segura para o tratamento da PiE em ratas tratadas com dose oncológica de zoledronato, podendo se constituir em um fator de risco agravante e/ou desencadeador da ONMM-IO.
Atividade antibacteriana e mecanismos de ação da melitina e sua associação com oxacilina frente ao Staphylococcus aureus meticilina resistente (MRSA)
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-08-25) Pereira, Ana Flávia Marques [UNESP]; Fernandes Júnior, Ary [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A resistência bacteriana é um problema de saúde pública mundial e isolados resistentes como o Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA), frequentemente causam infecções graves e de difícil tratamento. A pesquisa por novos agentes antimicrobianos é necessária e produtos naturais como os peptídeos antimicrobianos têm sido evidenciados, como é o caso da melitina, uma fração do veneno da abelha Apis mellifera, que já possui ação antimicrobiana reportada. A melitina pode apresentar atividade hemolítica, sendo ideais novas estratégias como um sinergismo com antibióticos ou associada a sistemas nanocarreados, como nanopartículas ou nanoemulsões. Os objetivos desse trabalho foram sintetizar uma nanopartícula de ouro conjugada com melitina (AuNPs melitina) e duas formulações diferentes de nanoemulsões contendo melitina, avaliar a atividade antibacteriana da melitina, da sua associação com oxacilina, dos antibióticos oxacilina e cefalotina, da AuNPs melitina e das nanoemulsões sobre MRSA ATCC 33591 e um MRSA isolado clínico, avaliar atividade antibiofilme dos produtos que apresentaram atividade antibacterina e investigar os seus mecanismos de ação sobre MRSA. As nanopartículas de ouro (AuNPs) foram funcionalizadas com citrato de sódio e ativadas com 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) e N-hidroxisuccinimida (NHS) e posterior conjugação da melitina; também foi realizada a síntese de duas formulações diferentes de nanoemulsões contendo melitina. A atividade antibacteriana sobre os isolados foi realizada de acordo com a metodologia Resazurin Microtiter Assay (REMA), para determinar a concentração inibitória mínima (CIM) da melitina, antibióticos, AuNPs melitina e nanoemulsões com melitina. O sinergismo da melitina com antibióticos (oxacilina e cefalotina) foi testado por meio da curva de sobrevivência (time kill curve). A ação antibiofilme de melitina, oxacilina e da associação de melitina com oxacilina (mel+oxa) e a ação desses produtos sobre a membrana celular dos isolados foram verificadas. Ensaios de atividade hemolítica e de citometria de fluxo, citotoxicidade em células HaCaT, foram realizados. Os mecanismos de ação dos produtos testados com atividade antibacteriana foram investigados por meio da análise proteômica, sendo que a cepa MRSA ATCC foi tratada com concentrações subinibitórias dos tratamentos. As AuNPs melitina e as duas nanoemulsões diferentes contendo melitina foram sintetizadas, obtendo uma concentração final de 250 μg/mL de melitina em cada nanoestruturado, sendo que nenhum nanoestruturado apresentou ação antibacteriana frente à MRSA. A melitina apresentou uma CIM de 5,3 µg/mL sobre MRSA ATCC e de 4,0 µg/mL para MRSA isolado clínico; já a oxacilina apresentou CIM de 16 µg/mL para MRSA ATCC e de 8 µg/mL para MRSA isolado. A associação mel+oxa mostrou ser sinérgica e bactericida para ambos MRSA. Concentrações subinibitórias da mel+oxa foram capazes de reduzir a formação de biofilme de MRSA ATCC e concentrações suprainibitórias foram capazes de erradicar biofilmes estabelecidos. A melitina e mel+oxa mostraram ter ação sobre a permeabilidade da membrana celular pelo aumento na condutividade elétrica relativa, extravasamento de proteínas, liberação de ácidos nucleicos e efluxo de íons potássio e fosfato. A taxa de hemólise da melitina em sua CIM foi de 0,2%, já a combinação de mel+oxa, em sua CIM não apresentou hemólise em eritrócitos humanos. A melitina e mel+oxa não causaram apoptose ou morte tardia em células de queratinócitos HaCaT. A análise proteômica sobre MRSA ATCC mostrou que a melitina, oxacilina e mel+oxa causaram uma expressão diferencial de proteínas em relação ao controle, indicando ação sobre a síntese proteica e metabolismo energético. Os nanoestruturados contendo a melitina não apresentaram atividade antibacteriana nas concentrações e formulações testadas sobre MRSA. O tratamento mel+oxa mostrou atividade antibacteriana e antibiofilme sobre MRSA, não apresentou hemólise no valor da CIM e nem citotoxicidade em células HaCaT e mostrou ação sobre a membrana celular de MRSA e sobre diferentes alvos intracelulares, afetando principalmente o metabolismo energético e a síntese proteica de MRSA. A associação de melitina e oxacilina apresenta considerável potencial para o desenvolvimento de agentes antibacterianos ou de novos tratamentos contra MRSA.
Análise de textura: uma potencial ferramenta para diferenciar tumores cerebrais primários e metástase cerebral solitária
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-09-08) Souza, Sérgio Augusto Santana de [UNESP]; Pina, Diana Rodrigues de [UNESP]; Reis, Fabiano; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tumores cerebrais são considerados um grave problema de saúde pública e sua diferenciação constitui um grande desafio diagnóstico. Geralmente, o diagnóstico definitivo só pode ser alcançado a partir de uma biópsia estereotáxica do cérebro, o que acarreta certo risco de mortalidade. Assim, é necessário o desenvolvimento de estratégias alternativas para a diminuição de procedimentos invasivos. Nesse aspecto, o aprendizado de máquinas (AM) aplicado a imagens biomédicas por meio de análise de texturas (AT) tem sido amplamente utilizado na medicina diagnóstica para classificação ou diferenciação de lesões. Essa pesquisa teve como objetivo a criação de um método de extração de texturas e aprendizado de máquina aplicado a neuroimagens para diferenciação de tumores cerebrais. O banco de dados foi constituído a partir de exames de Ressonância Magnética (RM) de encéfalo de pacientes do Hospital das Clínicas de Botucatu. O bando de dados foi dividido em dois grupos, tumores primários (n = 38) e metástase cerebral solitária (n = 58). As sequências utilizadas foram: imagem ponderada em difusão (DWI), sequência de recuperação de inversão atenuada por fluido (FLAIR), imagem ponderada em T1 com e sem contraste endovenoso, imagem ponderada em T2. Radiologistas com mais de 15 anos de experiência realizaram na região tumoral, segmentações manuais nas regiões de interesse (ROI) de 10 x 10 pixels. Para cada ROI, 40 parâmetros de textura foram extraídos através do software Matlab® (v 2017) e aplicados a cinco métodos de AM diferentes: naive bayes, support vector machine (SVM), stochastic gradient descente (SGD), random forest, e tree. Os métodos de AM classificaram os grupos com boa diferenciação de até 97,5% da área sob as características do operador receptor (ROC) usando o SVM na sequência DWI e 94,9% de precisão usando o gradiente descendente estocástico na sequência ponderada em T1. O método proposto apresentou uma classificação confiável para a investigação de lesões tumorais e trouxe contribuições originais à comunidade cientifica com grande potencial de suporte ao diagnóstico clínico diferencial.
Caracterização do perfil de cicatrização das úlceras gástricas em animais com obesidade induzida por dieta hiperlipídica e a ação do citral
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-08-24) Ohara, Rie; Hiruma-Lima, Clélia Akiko [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A obesidade causa um quadro inflamatório de baixo grau que pode resultar em agravamentos de distúrbios do trato gastrointestinal e maior dificuldade no processo de cicatrização em úlceras gástricas. Apesar de alguns estudos terem investigado a relação entre obesidade e as úlceras gástricas, ainda não existe uma relação clara estabelecida entre essas duas doenças. Diante desse cenário, este trabalho tem dois objetivos principais: Caracterizar o perfil de cicatrização de lesões gástricas em animais eutróficos e obesos e avaliar os efeitos farmacológicos do citral sobre a cicatrização. Para caracterização do perfil de cicatrização foram usados camundongos Swiss machos e para avaliação da ação do citral foram usados camundongos C57Bl-J6. Em ambos experimentos, os animais foram divididos em 2 grupos: Dieta padrão (SD) e dieta hiperlipídica (HFD) e após 12 semanas de ingestão das dietas, os animais passaram por cirurgia de indução de úlcera gástrica por ácido acético. Para comparação do perfil de cicatrização entre animais SD e HFD, os estômagos dos animais foram coletados em cinco períodos pós-indução: 1, 3, 7, 10 ou 14 dias. Também avaliamos a ação do citral em três doses: 25, 100 ou 300 mg/kg durante a fase inicial e tardia da cicatrização, 3 e 10 dias subsequentes de tratamento, respectivamente. Para esse experimento foram incluídos os grupos: controle negativo tratados com veículo (Tween 80 a 1%, 10 mL/kg) e controle positivo tratados com Lansoprazol (30 mg/kg). Todos os estômagos foram coletados para análise morfológica macroscópica, zimografia para quantificação de metaloproteinases de matriz 2 e 9 (MMP-2 e 9) e quantificação por imunoensaio multiplex de IL-1b, TNF-a, VEGF-A, C e D, EGF, HGF e FGF-2. Como resultado, observamos que houve desaceleração da fase inicial da cicatrização em animais que receberam HFD em relação aos animais alimentados com SD. Essa alteração foi seguida de redução da atividade de MMP-9 no mesmo grupo após sete dias de indução da lesão. Os perfis de fatores de crescimento também se mostraram diferentes entre animais que receberam diferentes dietas, principalmente o VEGF-D e EGF. Ao avaliar a ação do citral, verificamos que entre os animais alimentados com HFD, apenas os grupos que receberam citral nas doses de 100 e 300 mg/kg apresentaram redução significativa da área da base da úlcera entre 3 e 10 dias após a indução da lesão. No grupo tratado com citral na dose de 100 mg/kg, a progressão da cicatrização foi acompanhada por redução da atividade de MMP-9. As diferenças observadas no progresso de cicatrização e nas atividades de MMP-2 e 9 podem ser explicadas pelas diferentes respostas em animais alimentados com SD e HFD sobre as concentrações de IL-1b e TNF-a, citocinas que promovem resposta aguda no processo inflamatório. Consequentemente, os fatores de crescimento VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D, EGF e HGF responderam de diferentes formas aos tratamentos administrados nos grupos SD e HFD. Desta forma, podemos concluir que a ingestão de diferentes dietas interfere no processo de cicatrização de úlceras gástricas e altera as respostas farmacológicas no tratamento das úlceras. O citral promoveu maior taxa de cicatrização apenas em camundongos obesos, quando comparado com os outros tratamentos. Essa mudança foi acompanhada por uma diminuição na MMP-9 tecidual e por modulação da ativação da MMP-2.
Avaliação do emprego da curcumina associada ao diodo emissor de luz durante o reparo alveolar em ratas com alto risco para a osteonecrose dos maxilares
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-02-25) Guiati, Isabella Zacarin [UNESP]; Ervolino, Edilson [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A osteonecrose dos maxilares associada à terapia medicamentosa (ONMM) é um grave efeito adverso que pode ser ocasionado pelo uso de medicamentos com ação antirreabsortiva. Essa é uma condição patológica de difícil tratamento, em sendo assim, a prevenção seria a estratégia ideal. Estudos mostram que a curcumina (CUR) apresenta ação anti-inflamatória, efeito antimicrobiano e alta capacidade para estimular a reparação tecidual, além disso, pode ser usada como fotossensibilizador na terapia fotodinâmica antimicrobiana (aPDT), o que a coloca como uma potencial estratégia terapêutica preventiva para a ONMM. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da aPDT, empregando CUR e diodo emissor de luz (LED) azul, no sítio de extração dental de ratas que apresentavam alto risco para a ONMM. Cinquenta e seis ratas senescentes foram distribuídas em oito grupos experimentais: VEI; VEI-LED; VEICUR; VEI-aPDT; ZOL; ZOL-LED; ZOL-CUR; ZOL-aPDT. O plano de tratamento medicamentoso teve duração de 7 semanas. As ratas dos grupos VEI; VEI-LED; VEI-CUR; VEI-aPDT receberam 0,45 ml de veículo (cloreto de sódio 0,9%). As ratas dos grupos ZOL; ZOL-LED; ZOL-CUR; ZOL-aPDT receberam o veículo acrescido de 100 μg/Kg de zoledronato. O veículo e o zoledronato foram administrados a cada 72 horas pela via intraperitoneal. Decorridas 3 semanas de tratamento todas as ratas foram submetidas à exodontia do primeiro molar inferior. Nos grupos VEI-LED e ZOL-LED foram efetuadas 4 sessões de irradiação com LED. Nos grupos VEI-CUR e ZOL-CUR foram efetuadas 4 sessões de deposição de CUR. Nos grupos VEI-aPDT e ZOL-aPDT foram efetuadas 4 sessões de aPDT empregando a CUR e o LED. Os tratamentos locais foram efetuados aos 0, 2, 4 e 6 dias pós-operatórios. Decorridos 28 dias pós-operatórios foi realizada a eutanásia. As hemimandíbulas foram devidamente processadas para que se pudesse ser efetuado no sítio de extração dental: 1) análise clínica; 2) análise histológica da reparação tecidual; 3) análise histométrica da porcentagem de Tecido Ósseo Neoformado (TONF) e Tecido Ósseo Não Vital (TONV) e; 4) análise imunoistoquímica para os marcadores VEGF, TGFβ1, BMP2/4 e OCN. Os grupos ZOL e ZOL-LED apresentaram severo comprometimento do processo de reparo alveolar, menor porcentagem de TONF, maior porcentagem de TONV e baixo padrão de imunomarcação para VEGF, TGFβ1, BMP2/4 e OCN. Quando comparados com esses grupos, os grupos ZOL-CUR e ZOL-aPDT apresentaram um curso do processo de reparação tecidual favorável, maior porcentagem de TONF, menor porcentagem de TONV e padrão de imunomarcação de moderado a alto para VEGF, TGFβ1, BMP2/4 e OCN. Os grupos ZOL-CUR e ZOL-aPDT mostraram muita similaridade com o grupo VEI na maioria dos parâmetros avaliados neste estudo. Quando ZOL-CUR e ZOL-aPDT são comparados entre si, este último se mostrou superior em alguns dos parâmetros. Conclui-se que a curcumina exerce efeitos positivos sobre o processo de reparo alveolar em ratas senescentes tratadas com altas doses de zoledronato. Os efeitos benéficos sobre a reparação tecidual são potencializados quando a curcumina é associada à irradiação com LED azul, ou seja, na aPDT. O uso da curcumina, irradiada ou não com LED azul, evitou a ocorrência ONMM.
Influência da cápsula e de outros fatores de virulência de staphylococcus aureus na mastite subclínica e nos diferentes níveis de gravidade na mastite clínica contagiosa.
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-08-27) Rossi, Bruna Fernanda; Rall, Vera Lúcia Mores [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Importante por causar sérios prejuízos às fazendas leiteiras, a mastite bovina por Staphylococcus aureus pode desencadear casos subclínicos e clínicos, com severidade leve, moderada ou grave, dependendo da resposta imunológica do hospedeiro e dos fatores de virulência da bactéria, sendo alguns deles, controlados por genes como o gene acessório regulador (agr), além do envolvimento de possíveis linhagens específicas. Com isso, o objetivo do estudo foi avaliar as diferenças e relações genéticas entre os fatores de virulência mais importantes, como o biofilme (bap, icaA e icaD), enterotoxinas (sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sei e sej), a Toxina da Síndrome do Choque Tóxico (tsst-1), a Leucocidina Panton-Valentin (pvl), as proteínas envolvidas no processo de adesão e invasão celular (MSCRAMMs) e os tipos capsulares e de agr com os graus de severidade da mastite clínica e com a mastite subclínica, além de observar os pulsotipos envolvidos em cada tipo da doença, pelo Pulsed field gel electrophoresis (PFGE). Foram usados 50 isolados de S. aureus, obtidos de casos de mastite bovina subclínica, 73 de casos de clínica leve e 28 de clínica moderada. Os isolados subclínicos apresentaram relação estatística com os genes sea, sec, see, tsst-1 e pvl. Já os clínicos, com os genes seg, seh, sei, bap e icaA. A maioria dos genes das MSCRAMMs (fnbA, fib, clfA, clfB, cna, ebpS) também estiveram associados aos isolados clínicos. Todos os isolados foram capazes de produzir biofilme, não havendo diferença entre os tipos de mastite. Isolados contendo o gene agrI e sem o locus agr (agr-) foram mais os prevalentes entre os casos de mastite subclínica, enquanto os contendo os genes agrII e agrIII foram mais prevalentes nos casos clínicos. Os tipos capsulares 5 (cap5) e 8 (cap8) foram encontrados em 42% e 44% dos isolados subclínicos e em 38,6% e 58,4% dos clínicos, respectivamente. Foram encontrados 72 pulsotipos e não foram observados isolados clínicos e subclínicos num mesmo cluster. Os resultados obtidos mostraram que existem diferenças genômicas, considerando-se o potencial de virulência dos isolados de S. aureus, obtidos de casos de mastite clínica e subclínica. Porém, o tipo de locus agr parece exercer um papel fundamental na expressão e repressão desses genes, impactando diretamente na progressão da doença. Além disso, o PFGE diferenciou de maneira clara, pulsotipos encontrados em casos de mastite de mastite clínica e subclínica.
Análise comparativa dos efeitos do biopesticida azadiractina e do inseticida sintético piriproxifem nos testículos de Ceraeochrysa claveri (Navás, 1911) (Neuroptera: Chrysopidae). Uma abordagem morfológica, ultraestrutural e molecular
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-06-29) Garcia, Ana Silvia Gimenes; Santos, Daniela Carvalho dos [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Insetos da família Chrysopidae são inimigos naturais utilizados no controle biológico, sendo uma importante ferramenta na agricultura orgânica e no manejo integrado de pragas. Além do controle biológico utilizando esses insetos, o uso de inseticidas naturais vem ganhando grande destaque, pois são menos prejudiciais ao homem e ao ambiente. Entretanto, o uso de inseticidas sintéticos ainda é muito alto e acaba interferindo no ciclo de vida dos inimigos naturais, e consequentemente, no controle biológico de pragas. Com o propósito de avaliar o efeito da azadiractina e piriproxifem sobre os testículos do crisopídeo Ceraeochrysa claveri, insetos foram expostos a esses compostos nas concentrações 12 e 36mg i.a./L para a azadiractina (formulação comercial Azamax®), e 50 e 100mg i.a./L para o piriproxifem (formulação comercial Tiger 100 EC®). Os testículos de adultos foram avaliados através de técnicas morfológicas e análise do transcriptoma, além da avaliação do ciclo de vida dos insetos, fecundidade e fertilidade. Os resultados mostraram que os dois inseticidas causaram poucas alterações morfológicas nos testículos, como espaçamento entre os cistos, e alterações na túnica que o recobre. Os grupos tratados não apresentaram alterações nas marcações dos filamentos de actina e microtúbulos, bem como nas análises estatísticas, onde houve apenas redução da fecundidade, mas mantendo a viabilidade dos indivíduos gerados. Já a análise do transcriptoma apontou diferença na expressão dos genes de nucleoporinas, proteínas ribossomais e dedo de zinco, podendo estar relacionadas ao processo de espermatogênese e fecundidade dos insetos. Esses resultados nos mostram que os dois inseticidas podem ser adequados para uso em programas de manejo que visam conservar e aumentar a população de inimigos naturais, entretanto a compatibilidade em campo desses inseticidas com C. claveri deve ser avaliada.
Perfil global de expressão de MicroRNAs na próstata ventral de ratos submetidos à restrição proteica materna: Efeitos perinatais e reflexos no envelhecimento
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-05-21) Constantino, Flávia Bessi [UNESP]; Justulin, Luis Antonio [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Nas últimas décadas, foi observado aumento na incidência de câncer na população. Estudos mostram que o câncer pode se originar de insultos sofridos por indivíduos durante a vida intrauterina, visto que que este período é caracterizado pela capacidade do embrião/feto em se adaptar às mudanças ambientais, alterando a expressão gênica por mecanismos pós-transcricionais. Já foi demonstrado que a restrição proteica materna promove a carcinogênese da próstata em ratos idosos; No entanto, há falta de informações sobre o mecanismo molecular envolvido nesse processo. Assim, objetivamos identificar os possíveis microRNAs desregulados em ratos jovens programados e localizar seus possíveis alvos associados à carcinogênese da próstata. Para isso, ratos machos Sprague Dawley nascidos de mães alimentadas com dieta padrão (17% de proteína), grupo controle (CTR), ou dieta pobre em proteínas (6% de proteína), grupo gestational and lactational low protein diet (GLLP), durante a gestação e lactação foram sacrificados no dia pós-natal 21. O sangue foi coletado para analises hormonais e a próstata ventral foi processada para morfologia e por sequenciamento, HigSeq -2500 Illumina, para determinar o perfil do microRNoma. Dados de sequenciamento de miRNAs de pacientes com câncer de próstata, oriundos do the cancer genome atlas (TCGA), foram reanalisados para comparação com os resultados de ratos. Além disso, foi realizada a transfecção do miR-33 em células PNT-2 para avaliar a expressão de seus alvos e a viabilidade celular após tratamento através da técnica de MTT. Assim, foi observado atraso no desenvolvimento da próstata ventral e aumento dos níveis de testosterona e expressão de estrogênio em ratos GLLP. Além disso, 20 miRNAs foram identificados como diferencialmente expressos, 6 down regulados e 14 up regulados. Os resultados de enriquecimento para miRNAs down regulados estão relacionados às vias do câncer e da angiogênese, enquanto os miRNAs up regulados estão enriquecendo vias de retículo endoplasmático e de carcinoma. A reanálise do sequenciamento de miRNA de TCGA revelou 7 em comum com o grupo GLLP. Um deles é o miR-33 que, além de ser down regulado na próstata, também é desregulado no testículo, na glândula adrenal e no fígado, dados gerados através do RTq-PCR. Sua supra expressão nas células transfectadas causou uma diminuição na viabilidade celular e seu alvo, CYP1B1, é uma enzima importante no metabolismo do estrogênio, que pode levar à carcinogênese mediada por mudanças nos níveis hormonais e transformação do estradiol. Concluímos que o miR-33 é um alvo importante para explicar as alterações causadas pela LPD materna podendo, ser considerado um considerável biomarcador por ser desregulado em vários órgãos analisados.
Análise integrativa do transcriptoma e proteoma da próstata ventral da prole de ratos submetidos à restrição proteica materna
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-04-28) Camargo, Ana Carolina Lima; Justulin, Luis Antonio Justulin [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A exposição materna a dieta deficiente em proteína durante a gestação, característica de países subdesenvolvidos e de países cuja dieta contém alimentos hipercalóricos, pobres em fibras e nutrientes, está associada ao desenvolvimento de doenças na prole, em especial cardiovasculares, renais, diabetes e até mesmo câncer na prole. Além disso, estudos do nosso grupo de pesquisa demonstram que a restrição proteica materna impacta o desenvolvimento e aumenta a incidência de lesões prostáticas na prole de ratos velhos. Apesar disto, os mecanismos moleculares que desencadeiam estas alterações ainda são pouco conhecidos. Neste contexto, o avanço das metodologias de estudo de expressão gênica e proteica em larga-escala, associado à possibilidade de integração destes dados utilizando ferramentas de bioinformática, tem possibilitado uma visão integrativa global dos mecanismos moleculares em condições normais e patológicas. Assim, o objetivo deste trabalho foi identificar o perfil de expressão global de RNAs mensageiros (transcriptoma) e de proteinas (proteômica) em amostras de próstatas de ratos que sofreram restrição proteica perinatal e integrar o perfil global de expressão de mRNAs e proteínas para identificar redes de regulação e vias moleculares envolvidas no desenvolvimento prostático em animais normais e restritos. Foram analisados ratos machos da linhagem Sprague Dawley com 21 dias de idade pós-natal nascidos de mães alimentadas com ração padrão (17% de proteína) ou de mães alimentadas com ração hipoproteica (6% proteína) durante a gestação e lactação. Após este período, os animais foram eutanasiados com overdose de anestésico, pesados e a próstata ventral foi coletada. Foram analisados o transcriptoma por sequenciamento de última geração (HigSeq-2500, Illumina) e do proteoma, por espectrometria de massas (LC-Ms/Ms). Foram selecionados alguns alvos de interesse para serem validados por RT-qPCR, assim como por imunohistoquímica e western blotting. Estes resultados foram comparados aos dados de transcriptoma e do proteoma para adenocarcinoma prostático, disponíveis na literatura, como o objetivo de investigar se a restrição proteica perinatal é responsável por alterar a expressão gênica e proteica de alvos relacionados ao desenvolvimento de lesões prostáticas. Outros animais forma eutanasiados com 540 dias de idade com o objetivo de se identificar possíveis alvos alterados tanto pela restrição proteica em ratos jovens como no câncer prostático. Este projeto de doutorado faz parte de um projeto maior (auxílio regular à pesquisa), onde também foi analisado o microRNoma e o perfil de metilação global na próstata de ratos submetidos à restrição proteica perinatal. Com isso espera-se obter uma visão global dos efeitos da restrição proteica perinatal sobre a biologia prostática.
Desfechos nos desenvolvimentos cognitivo, somático e reprodutivo da exposição pré-natal e neonatal de ratos à betametasona”
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-04-09) Figueiredo, Thamiris Moreira [UNESP]; Kempinas, Wilma De Grava [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A betametasona (BM) é o fármaco de escolha para a corticoterapia antenatal em casos de risco de parto prematuro por induzir a maturação pulmonar e garantir a sobrevivência fetal pós-natal. No entanto, estudos deste grupo de pesquisa com exposição de ratos à BM no período gestacional crítico para o desenvolvimento do sistema genital evidenciam programação fetal e alterações na função e desenvolvimento reprodutivos em F1. Nosso objetivo foi investigar os efeitos da BM sobre o desenvolvimento sexual em período que corresponde à janela de exposição em humanos, além de avaliar os efeitos da exposição pré-natal à BM com ênfase nos desenvolvimentos sexual, cognitivo e somático de machos e fêmeas F1 e F2. Para o experimento neonatal, ratos machos e fêmeas (n=10/grupo) foram expostos por via subcutânea à solução NaCl 0,9 % (Controle) ou 0,1 mg/Kg de BM nos dias pós-natal (DPN) 1, 2 e 3. Além disso, para a exposição pré-natal, ratas prenhes (n=10/grupo) foram expostas à solução NaCl 0,9% (Controle) ou 0,1 mg/Kg de BM por via intramuscular nos dias gestacionais 12, 13, 18 e 19. No DPN 90, os ratos machos e fêmeas (F1) expostos in utero foram acasalados com animais não tratados para obtenção de F2 (prole de ratos machos) e F2’ (prole de ratos fêmeas). A exposição neonatal de ratos à BM reduziu o ganho de peso corpóreo em machos e fêmeas durante o tratamento e a qualidade espermática em machos, além de ter causado desregulação do ciclo estral e redução na concentração de LH em fêmeas na maturidade sexual. Nos ratos expostos in utero, houve redução do ganho de peso em F0 e do peso da prole F1. Além disso, a instalação da puberdade estava atrasada e o ciclo estral desregulado em fêmeas F1, assim como a qualidade espermática e o peso testicular em machos F1 estavam reduzidos. Houve atraso dos desenvolvimentos cognitivo e somático em F1, F2 e F2’. Nas proles F2 e F2’, houve redução do peso no dia do desmame e aumento da distância ano-genital em fêmeas F2’ no DPN 01. Conclui-se que a exposição pré-natal à BM causou disfunções nos desenvolvimentos cognitivo e somático em F1, F2 e F2’ e ambos os períodos de exposição alteraram a qualidade espermática, desregularam o ciclo estral e causaram programação do desenvolvimento reprodutivo e restrição do crescimento em machos e fêmeas F1. Portanto a exposição de ratos à BM no período neonatal, embora tenha efeitos menos evidentes sobre o sistema genital masculino e feminino, confirma resultados observados anteriormente após exposição pré-natal. Apesar da reconhecida importância da corticoterapia antenatal humana, os achados do presente estudo sinalizam e estimulam novos estudos a fim de minimizar possíveis efeitos adversos colaterais pós-natais.
Efeitos da restrição proteica materna associados ao consumo do açúcar sobre o metabolismo, parâmetros reprodutivos e morfofisiologia prostática na prole de ratos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-03-25) Colombelli, Ketlin Thassiani [UNESP]; Justulin, Luis Antonio [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O aumento da incidência de síndromes metabólicas na população tem sido associado à fatores nutricionais maternos e da prole, como a restrição proteica materna (RPM) e o alto consumo de produtos com açúcares de adição da infância até a vida adulta. Estudos epidemiológicos e experimentais demonstram que ambos os tipos de fatores têm efeitos negativos sobre o sistema genital masculino. Além de efeitos negativos durante a fase adulta, também ocorrem alterações no envelhecimento, como a ocorrência de carcinoma in situ. Portanto, torna-se relevante investigar se a RPM modula parâmetros funcionais nos órgãos reprodutivos (próstata, testículo e epidídimo) da prole após ao consumo de açúcar pós-natal na idade adulta e no envelhecimento. O objetivo deste trabalho foi avaliar se a RPM e consumo pós-natal do açúcar afetam os órgãos reprodutivos (próstata ventral, testículo e epidídimo) e se o consumo de açúcar pós-natal afeta a morfofisiologia prostática nos animais adultos repercutindo em possíveis patologias no envelhecimento. Foram utilizados ratos Sprague Dawley machos nascidos de mães que receberam ração normoproteica (Controle- CTR, 17% proteína) ou hipoproteica (Restrição Proteica Gestacional e Lactacional- RPGL, 6% proteína) durante a gestação e a lactação, no dia pós-natal 21 (DPN- desmame) os machos foram divididos em 4 grupos e todos passaram a receber a ração normoproteica: Controle (CTR): nascidos de mães CTR que consumiram água normal ad libitum; Controle+açúcar (CTR+AÇÚ): consumiram solução de açúcar a 10% diluída em água do DPN 21 ao DPN 90; RPGL: nascidos de mães RPGL que consumiram água normal ad libitum; RPGL+AÇÚ: Nascidos de mães RPGL, que consumiram solução de açúcar do DPN 21 ao DPN 90. Após o DPN 90 todos os animais consumiram água normal. Os animais foram eutanasiados no DPN 90, onde foram coletadas as próstatas ventrais, testículos e epidídimos para análises morfofisiólogas e de contagens espermáticas; além disso para a próstata ventral de ambas as idades (DPN 90 e 540) foi analisado o perfil proteômico. Adicionalmente, foram realizados os testes de tolerância a glicose oral (TTGO) e análise do perfil metabólico e sérico dos animais no DPN 90 e 540. Nos testículos e nos epidídimos foram feitas as análises de contagem espermática e morfofisiológicas no DPN 90. As proteínas totais, triglicerídeos, glicose e colesterol total não mudaram em ambas as idades. No TTGO, o grupo CTR+AÇÚ apresentou glicemia maior no tempo de 120 minutos e na área sob a curva (ASC), um aumento significativo em relação ao grupo CTR, o que caracteriza intolerância à glicose. Para os parâmetros de peso corpóreo e distância ano-genital em ambas as idades foram reduzidas nos grupos RPGL, sendo que a PV não apresentou diferença no peso. Nas análises de componente principal do perfil proteômico, no DPN 90 os grupos não tiveram distribuição distinta, já no DPN 540 tiveram distribuição mais distinta entre os grupos, em especial para o grupo RPGL+AÇÚ. Os grupos que consumiram o açúcar enriqueceram vias relacionadas à autofagia, metabolismo de glicose desde o DPN 90, persistindo até o envelhecimento, enquanto a RPM alterou vias relacionadas à proliferação celular, ciclo celular e vias de estrógenos. Os termos enriquecidos em cada idade pelas proteínas diferencialmente expressas podem ter refletido nas alterações morfofisiológicas visualizadas nos grupos tratados (CTR+AÇÚ, RPGL e RPGL+AÇÚ) nos DPNs 90 e 540. Além disso, no DPN 540 observou-se diferentes lesões como atrofia inflamatória, atrofia epitelial, displasia, além do carcinoma in situ nos animais dos grupos CTR+AÇÚ e RPGL. Para as análises dos parâmetros reprodutivos os animais dos grupos RPGL e RPGL+AÇÚ tiveram uma diminuição da contagem espermática além da diminuição do tempo de trânsito no epidídimo. Portanto, estas análises nos mostram que a RPM associada ao consumo de açúcar pós-natal pode potencializar os efeitos na função reprodutiva e que em especial na próstata ventral estes podem contribuir para o desenvolvimento de lesões prostáticas.
Ação da própolis associada ao docetaxel sobre células de câncer de mama e sobre monócitos humanos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-04-01) Cardoso, Eliza de Oliveira; Sforcin, José Maurício [UNESP]; Santiago, Karina Basso; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Câncer é um grupo de doenças que atingem pessoas em todo o mundo, causando milhões de morte anualmente. Docetaxel (DTX) é uma das abordagens terapêuticas mais utilizadas contra cânceres de mama. Todavia, quimioterápicos podem apresentar efeitos colaterais, tais como toxicidade e imunossupressão, podendo levar ao aparecimento de infecções. Para minimizar os efeitos colaterais causados pela quimioterapia, tem-se investigado a associação entre quimioterápicos e produtos naturais. Própolis é um produto apícola que apresenta muitas atividades farmacológicas. Neste trabalho, investigamos a ação citotóxica e imunomoduladora de uma associação entre extrato etanólico de própolis (EEP) e docetaxel (DTX) sobre a linhagem celular MCF-7 de câncer de mama e sobre monócitos obtidos de mulheres saudáveis. O potencial citotóxico da combinação EEP+DTX sobre a linhagem MCF-7 e monócitos foi verificado por ensaio de viabilidade celular (MTT); e o tipo de morte celular (apoptose/necrose) foi avaliado por citometria de fluxo. Os efeitos de EEP, DTX e EEP+DTX sobre a migração e invasão das células MCF-7 também foram investigados. A produção das citocinas IL-1β, TNF-α, IL-6 e IL-10 por monócitos foi verificada por ELISA; a expressão dos marcadores celulares HLA-DR, CD80, TLR-2 e TLR-4 foi avaliada por citometria de fluxo. Também foi avaliada a atividade fungicida de monócitos contra Candida albicans e a produção de espécies reativas do oxigênio (EROs). O impacto do sobrenadante de monócitos tratados sobre a viabilidade, migração e invasão das células tumorais também foi investigado. A associação EEP (25 μg/mL) + DTX (10 nM) potencializou a ação citotóxica do quimioterápico contra a linhagem MCF-7, induzindo morte celular por necrose e impedindo a migração dessas células. EEP+DTX não afetou a viabilidade de monócitos humanos, estimulou a expressão de HLA-DR, a produção de TNF-α e IL-6, restaurou a atividade candidacida e reduziu o estresse oxidativo dos monócitos. Tais resultados indicam que EEP em combinação com baixas concentrações de DTX afetou a viabilidade e migração de células MCF-7 in vitro, e favoreceu alguns parâmetros imunológicos relacionados às funções dos monócitos. Estes são achados novos e relevantes que merecem mais investigações devido às suas implicações práticas, a fim de propor uma nova abordagem terapêutica na Medicina Alternativa e Complementar para pacientes oncológicos.

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