Dissertações - Ciências Biológicas (Genética) - IBB

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  • ItemDissertação de mestrado
    Generation of T. cruzi strains knock-out for IP6K and evaluation of the resulting phenotypes
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-07-07) Abuchery, Bryan Etindi; Santos da Silva, Marcelo; Calderano, Simone Guedes; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A doença de Chagas é uma doença tropical negligenciada causada pelo parasita protozoário Trypanosoma cruzi. Não existem vacinas eficazes e as opções de tratamento disponíveis são eficazes apenas na fase aguda da doença, mas podem causar efeitos colaterais graves nos pacientes. Assim, a busca pela elucidação de vias moleculares que possam fornecer potenciais alvos para o desenvolvimento de fármacos é de suma importância. Pirofosfatos de inositol (PP-IPs) – principalmente IP7 e IP8 – estão envolvidos em uma ampla gama de processos em eucariotos. No entanto, o mecanismo de ação desses metabólitos ainda não é totalmente compreendido. IP7 e IP8 são sintetizados por vias envolvendo a participação de IP6K e PP-IP5K quinases, respectivamente. Os tripanossomatídeos possuem um gene ortólogo para IP6K, mas não possuem ortólogos para PP-IP5K, tornando-os excelentes modelos para estudar IP7. Aqui, usando a abordagem CRISPR/Cas9, interrompemos alelos simples e duplos de IP6K, gerando linhagens IP6K-/+ e IP6K-/-, respectivamente. A inativação do IP6K causa vários efeitos morfológicos, como arredondamento e enrugamento do corpo celular, aumento do número de glicossomos e aumento mitocondrial. Notavelmente, a linhagem IP6K-/- (duplo nulo) foi incapaz de proliferar por mais de 7 dias, sugerindo que esta quinase é essencial para este organismo. Curiosamente, a linhagem IP6K-/+ (single-null) mostrou uma leve parada do ciclo celular na fase G0/G1 sem nenhum dano ao DNA (células quiescentes). Além disso, a linhagem IP6K-/+ mostrou uma alta capacidade proliferativa dentro da célula hospedeira de mamífero, sugerindo que as células quiescentes observadas podem ser formas metacíclicas. Juntos, nossos resultados sugerem que a perda total de IP6K tem consequências prejudiciais para o T. cruzi. No entanto, paradoxalmente, o rompimento de um único alelo do IP6K faz com que o T. cruzi fique propenso a se multiplicar ainda mais dentro da célula hospedeira, gerando um enigma que ainda estamos tentando entender.
  • ItemDissertação de mestrado
    Análise do perfil transcricional do secretoma do lavado bronco alveolar em pacientes com risco de COVID-19 severa
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-09-30) Bonaldo, Ana Luiza Labbate; Carvalho, Robson Francisco; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A doença causada pelo novo coronavírus (COVID-19) se tornou uma pandemia e já atingiu mais de 595 milhões de pessoas em todo o mundo, ultrapassando os 6 milhões e 400 mil mortos após dois anos e meio. Pacientes com comorbidades, como diabetes e hipertensão, ou do sexo masculino e idosos são descritos como grupo de pior prognóstico. Já mulheres, jovens e pacientes com carga viral baixa são considerados grupo de melhor prognóstico. A produção excessiva de citocinas pró-inflamatórias, conhecida como tempestade de citocinas (cytokine storm), também está relacionada com a severidade e mortalidade da COVID-19. Portanto, a análise do conjunto de moléculas secretadas pelas células (secretoma) de tecidos alvos do SARS-CoV-2 é de extrema importância para o prognóstico e para a identificação de mediadores dessa doença. Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo analisar o perfil transcricional do secretoma de amostras de lavado bronco alveolar em pacientes com risco distintos de desenvolvimento de COVID-19 severa. A hipótese desse trabalho é que a análise do perfil do secretoma utilizando dados de transcriptoma, permitir predizer genes envolvidos com o prognóstico da infecção pelo SARS-CoV-2 e com a progressão da doença. Foi reanalisado um conjunto de dados de transcriptoma (RNA-Seq) com 430 pacientes positivos para COVID-19 e 54 pacientes negativos, disponível no repositório Gene Expression Omnibus (GEO; GSE152075), separados por gênero, idade (<60 anos, jovens; ≥60 anos, idosos) e carga viral (baixa e alta). Os genes diferencialmente expressos (DEGs) entre as condições foram utilizados para identificação de genes que codificam proteínas secretadas, utilizando os dados disponíveis na plataforma The Human Protein Atlas. Identificamos um conjunto de DEGs exclusivo do grupo de melhor prognóstico (mulheres, jovens e baixa carga viral). Desse conjunto de genes, caracterizamos quais codificam ligantes e receptores e, posteriormente, analisamos, através do método de análise de sequenciamento de células únicas (single-cell RNA-Seq), a expressão dos genes selecionados em células únicas do lavado bronco-alveolar de pacientes com COVID-19. Como método de validação dos nossos achados, utilizamos o conjunto de dados GSE145926 (GEO) para análise temporal (dias 1, 2, 4, 7, 10 e 12) do lavado bronco alveolar de macacos rhesus adultos infectados com SARS-CoV-2. Nossos dados demonstraram a relevância do receptor LRP11, como um potencial biomarcador de melhor prognóstico para COVID-19. Esse receptor faz parte da família de receptores de LDL, o qual altera sua expressão em infecções virais. Além disso, observamos que esse receptor tem sua expressão predominantemente em células epiteliais, que expressam o receptor ACE2 e, portanto, são mais susceptíveis às infecções pelo SARS-CoV-2. Esses resultados são relevantes pois os genes identificados podem determinar o prognóstico dos pacientes com COVID-19 e constituem potenciais alvos de drogas para redução da mortalidade pela doença.
  • ItemDissertação de mestrado
    Variabilidade genética em populações de jacaranda cuspidifolia (mart.): uso da seleção natural na recuperação de áreas degradadas
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-04-28) Pereira, Marilia Gabriela; Marino, Celso Luis [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Estudos genéticos com espécies nativas têm contribuído de forma significativa para a conservação genética ex situ e a restauração ecológica de ambientes perturbados. O presente estudo teve por objetivo avaliar a variabilidade genética de uma população base (POP-BAS) de Jacaranda cuspidifolia Mart. (Bignoniaceae), localizada em uma área degradada do Cerrado, em Selvíria-MS. Além disso, investigar o desenvolvimento de seus descendentes na forma de um teste de progênies (TP-JACA), em área próxima, porém em solo não degradado. Os indivíduos da POP-BAS foram instalados na Fazenda Experimental da UNESP de Ilha Solteira em 1998, na tentativa de minimizar os impactos ocasionados pela construção da Usina Hidrelétrica de Ilha Solteira, entre 1967 e 1978, pela Companhia Energética de São Paulo. O TP-JACA foi implementado em 19 de fevereiro de 2019, sob delineamento experimental de blocos casualizados, constituído de 31 progênies, 29 repetições, com uma planta por parcela, no espaçamento de 3,0 m × 2,0 m. As análises estatísticas foram geradas pelo programa R e as estimativas dos parâmetros genéticos foram obtidas com base nos modelos lineares mistos, utilizando o software Selegen. Os resultados desta pesquisa indicaram a existência de variabilidade genética entre os indivíduos da POP-BAS, aos 23 anos, o que permitiu a adaptação da população a esse ambiente degradado. O evento reprodutivo de 2020-2021, apresentou morfologia normal dos frutos e boa qualidade das sementes. A análise multivariada indicou correlação positiva para a maioria das variáveis entre os grupos, mostrando que árvores mais robustas originam maiores frutos, com sementes de boa qualidade. Em relação aos atributos químicos do solo, houve correlação positiva entre as características de crescimento com o pH. O presente estudo corroborou com maior entendimento do mecanismo adaptativo da espécie em solo degradado e permite concluir que, tanto a POP-BAS como o TP-JACA apresentam potencial para aplicação em programas de conservação genética ex situ e no reflorestamento de áreas degradadas, a partir do fornecimento de sementes com alta qualidade genética.
  • ItemDissertação de mestrado
    Poderiam os pirofosfatos de inositol terem influenciado o desenvolvimento do parasitismo dentro dos cinetoplastídeos?
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-03-20) Passos, Arthur de Oliveira [UNESP]; Silva, Marcelo Santos da; Rezende, Antônio Mauro; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Em eucariotos modelo, pirofosfatos de inositol (PP-IPs) – principalmente os chamados IP7 e IP8 – estão envolvidos em uma ampla gama de processos celulares, como regulação do comprimento dos telômeros, morte celular programada, recombinação homóloga (HR), entre outros. No entanto, o mecanismo de ação e o envolvimento destes metabólitos em outras vias espécie-específicas ainda são questões abertas. IP7 e IP8 são sintetizados através de vias complementares que envolvem a participação das quinases IP6K e PP-IP5K. Tripanosomatídeos parasitas (e.g., Leishmania spp. e Trypanosoma spp.) possuem um gene ortólogo para IP6K, mas aparentemente não possuem ortólogos para PP-IP5K, i.e., não sintetizam IP8, o que os torna excelentes modelos para o estudo de IP7. Além disso, estudos preliminares apontam que IP8 está presente em organismos de vida livre da classe Kinetoplastea. Assim, esta dissertação consistiu inicialmente em investigar se a presença de IP8 é mutuamente exclusiva em relação ao parasitismo dentro dos cinetoplastídeos. Para isso, realizamos análises evolutivas para confirmar a suposta perda da PP-IP5K em tripanosomatídeos. Reconstruímos árvores filogenéticas e obtivemos evidências robustas que confirmam a ausência de PP-IP5K em todos os tripanosomatídeos, exceto Paratrypanosoma confusum. As previsões das estruturas terciárias apontam que o domínio catalítico da PP-IP5K de P. confusum é naturalmente desestruturado, o que coloca em xeque sua função. Além disso, realizamos ensaios de dinâmica molecular com a PP-IP5K de Bodo saltans (BsPP-IP5K) e IP7, que é utilizado como substrato (junto com cofator ATP) para síntese de IP8. Nossas simulações sugerem que o BsPP-IP5K é totalmente capaz de sintetizar IP8. Dessa forma, amplificamos o gene BsPP-IP5K e adicionamos a ele as regiões 3' e 5' UTR da Gliceraldeído 3-Fosfato Desidrogenase (GAPDH). Posteriormente, clonamos essa construção no vetor pSP72-αHYGα (Marc Ouellette lab), gerando um plasmídeo que fornece expressão constitutiva epissomal de BsPP-IP5K em Leishmania spp. (episomal knock-in). Paralelamente, realizamos mutagênese sítio-dirigida para confirmar os resíduos de aminoácidos essenciais de BsPP-IP5K. A construção contendo a BsPP-IP5K mutada foi usada como controle nos ensaios knock-in. Com a inserção das construções em Leishmania braziliensis, realizamos a caracterização fenotípica das linhagens geradas, no qual, aparentemente, a presença da BsPP-IP5K não altera a proliferação e o ciclo celular. Futuramente, essas linhagens knock-in para PP-IP5-K serão utilizadas em ensaios de infecção para verificação da virulência e patogenicidade. Nossos achados até o momento sugerem que a transição de um estilo de vida livre para um estilo de vida parasitário resultou na perda de PP-IP5K. Os resultados deste trabalho poderão contribuir para a elucidação de novas rotas para o desenvolvimento de terapias antiparasitárias.
  • ItemDissertação de mestrado
    Sexagem molecular em perdiz Rhynchotus rufescens (aves: Tinamiformes): ações para suporte à criação e conservação da espécie
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-04-29) Bordignon, Marielly de Campos; Wasko, Adriane Pinto [UNESP]; Silva, Josineudson Augusto II de Vasconcelos; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A perdiz (Rhynchotus rufescens), espécie da família Tinamidae, compõe a avifauna brasileira e representa atualmente uma das aves com grande potencial no mercado de corte avícola não convencional como fonte proteica alternativa. Adicionalmente, embora não seja considerada uma espécie em risco de extinção, suas populações naturais têm apresentado declínio no número de indivíduos devido, especialmente, à destruição de habitats e à caça predatória. Desta forma, sua criação em cativeiro pode beneficiar não somente o mercado consumidor e ampliar as opções da avicultura brasileira como também minimizar a pressão da caça de exemplares silvestres. Para melhor subsidiar programas de criação, são ainda necessários estudos genéticos, ainda extremamente escassos para a espécie. Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo gerar dados associados à correta identificação de machos e fêmeas de Rhynchotus rufescens, por meio de análises moleculares. Adicionalmente, visou-se também gerar um material de divulgação cientifica sobre a espécie. Amostragens não-destrutivas, associadas à coleta de sangue de exemplares mantidos no Setor de Melhoramento Genético de Perdizes da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP (Campus de Botucatu), mostraram-se eficientes para obtenção de DNA de qualidade e seu posterior uso em PCR (Reação em Cadeia da Polimerase). A amplificação de um segmento do gene chSPIN (spindlin) permitiu a identificação, por meio de eletroforese em gel de agarose, de fragmentos de cerca de 850 e 1.400 pares de bases em fêmeas, referente ao gene presente nos cromossomos sexuais W e Z, respectivamente. Em machos, foi observado um fragmento de aproximadamente 1.400 pares de bases, associado ao gene encontrado nos dois cromossomos Z. Das 202 amostras de DNA obtidas, foi possível determinar o sexo de 188 animais, o que corresponde a 93,06% de efetividade. Desta forma, estabeleceu-se, pela primeira vez na literatura, um protocolo de sexagem molecular para R. rufescens que poderá ser amplamente utilizado para geração de perfis sexo-específicos em exemplares da espécie. O material de divulgação científica gerado corresponde a uma cartilha, voltada especialmente a estudantes do ensino médio, e será utilizada para subsidiar ações de interface com a educação básica, associadas à inserção social, que já vêm sendo desenvolvidas junto a um programa de pós-graduação.
  • ItemDissertação de mestrado
    Ação regulatória de microRNAs durante a regeneração epimórfica em nadadeira caudal de zebrafish (Danio rerio)
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-02-19) Pereira, Beatriz Jacinto Alves; Pinhal, Danillo [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Regeneração é a capacidade de reconstruir partes do corpo e formar uma nova estrutura, idêntica morfológica e funcionalmente àquela perdida. De modo geral, a habilidade de regenerar tecidos, órgãos e membros é evolutivamente conservada nos vertebrados, ainda que envolva a ativação de processos celulares distintos, como desdiferenciação, reorganização e rediferenciação das células adjacentes ao tecido injuriado ou amputado. A regeneração denominada "epimórfica", comum em diversos teleósteos, anfíbios e répteis, caracteriza-se pela formação de um agregado de células desdiferenciadas (blastema) que posteriormente se rediferenciam, proliferam e migram para recompor a estrutura originalmente perdida. Durante a regeneração epimórfica, típica na nadadeira caudal do teleósteo zebrafish (Danio rerio), ocorre extensa desdiferenciação celular de células ósseas (osteoblastos) ativada por mecanismos genéticos ainda não completamente elucidados. Do mesmo modo, pouco se conhece acerca dos mecanismos epigenéticos mediados por microRNAs (miRNAs, pequenos RNAs regulatórios) atuantes no controle da desdiferenciação celular durante a regeneração. Neste contexto, o presente estudo teve por objetivo caracterizar a atividade de microRNAs na regulação de genes alvo importantes nos processos celulares relacionados à regeneração epimórfica da nadadeira caudal no modelo zebrafish. Para isso, realizamos a amputação da nadadeira caudal e coletamos tecidos de 80 zebrafish, subdivididos em 8 grupos experimentais: 0, 12, 24, 36, 48, 72, 96 e 120 horas pós-amputação (hpa). Essas amostras foram subdividas e utilizadas para o sequenciamento em larga escala de microRNAs (miRNA-seq) dos períodos 0, 24 , 48 e 72 hpa e para PCR quantitativo em Tempo Real (qPCR), após etapa prévia de predição in silico para seleção de miRNAs (miR-20a-3p, miR-203a-3p, miR-203a-3p, miR-19a-5p e let-7c-3p) e genes alvo candidatos expressos em células ósseas (sp7, runx2, bglap e spp1) potencialmente atuantes nas vias de interesse do estudo. Também realizamos análises in silico explorando bancos de dados públicos para avaliar se existe conservação evolutiva, nos diferentes grupos de vertebrados, das interações miRNA-alvo preditas. Os dados gerados por miRNA-seq revelaram mais de 600 microRNAs maduros expressos na região da amputação, sendo 37 miRNAs diferencialmente expressos nos 4 períodos pós-amputação analisados, e 14 miRNAs reconhecidos como relevantes nos processos de formação e reparo do tecido ósseo, com base na literatura. Além disso três miRNAs novos, ainda não reportados previamente no zebrafish, tiveram expressão detectada em nosso estudo. Com a análise do perfil de expressão por qPCR, identificamos o pico de expressão dos genes alvo próximo a 12hpa, sugerindo que este se constitui em um período crítico para a ocorrência de desdiferenciação de osteoblastos. A comparação temporal dos perfis de expressão pós-amputação também mostrou expressão negativamente correlacionada entre o gene sp7 e os quatro miRNAs selecionados, indicando uma potencial atividade coordenada na regulação deste e dos demais genes avaliados. As análises evolutivas revelaram que os sítios de interação do gene sp7 (na região 3'UTR do gene) aos miRNAs possuem mutações específicas em suas sequências de DNA nas diferentes espécies estudadas, mostrando que os processos moleculares de regeneração epimórfica não são conservados entre os grupos de vertebrados. Interessantemente, nas espécies de mamíferos, cujas sequências 3'UTR de sp7 são menores e variáveis, não foram detectados sítios de interação para os miRNAs estudados, o que está de acordo com a ausência de ativação da resposta de regeneração epimórfica mediada por blastema observada nesses animais. Juntos, esses resultados evidenciam que a regulação gênica mediada por microRNAs é um mecanismo importante para que haja regeneração epimórfica, particularmente durante a desdiferenciação de osteoblastos induzida pela modulação da atividade de sp7 que culmina na formação do blastema e restauração da estrutura danificada.
  • ItemDissertação de mestrado
    Diversidade genética e análise de parentesco em tubarões da espécie Squalus acanthias (Chondrichthyes: Squalidae) no oceano Atlântico, por meio de SNPs
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-02-10) Boza, Beatriz Rochitti; Oliveira, Claudio [UNESP]; Cruz, Vanessa Paes; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A pesca excessiva influencia em mudanças na estratégia de vida das populações dos organismos aquáticos, especialmente dos elasmobrânquios (tubarões e raias). O conhecimento e identificação de estoques das populações representam um ponto fundamental para o manejo e conservação das espécies. A espécie Squalus acanthias é um tubarão de pequeno porte, pertencente ao gênero Squalus, popularmente conhecido como cação-bagre-espinhoso, amplamente distribuído, migrador e susceptível à sobrepesca. Na Argentina, há uma alta ocorrência de pesca sobre S. acanthias, que atualmente recebe a classificação Vulnerável (VU) na lista vermelha da IUCN (União Internacional para Conservação da Natureza). Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivos estudar amostras de S. acanthias, procurando rastrear marcadores SNPs para estudos populacionais e parentesco, estudar a composição genética de uma população e a ocorrência de paternidade múltipla. A biblioteca ddRADSeq foi realizada com fêmeas e seis ninhadas, variando de três a 12 filhotes/mãe, totalizando 40 amostras de Mar del Plata (n=17) e Puerto de Santa Cruz (n=23), Argentina. Após o sequenciamento, foi realizado o rastreio de marcadores, resultando em 4.157 SNPs. Os índices de diversidade genética foram moderados (para heterosigozidade observada e heterozigosidade esperada), além disso, o coeficiente de endogamia (FIS) foi negativo para ambas as localidades analisadas, indicando um excesso de heterozigotos e ausência de endogamia. O FST pairwise foi de 0.042 entre as regiões de Mar del Plata e Puerto de Santa Cruz, demonstrando ausência de estruturação populacional. As análises com os programas STRUCTURE e DAPC indicaram que os indivíduos analisados estão distribuídos em três clusters genéticos, além disso, foi encontrado um alto fluxo gênico entre os indivíduos das diferentes localidades, porém apresentando baixo tamanho efetivo populacional (Ne). As análises de parentesco revelaram indivíduos bem relacionados geneticamente. No programa COLONY foram identificadas 35 relações de irmãos completos, distribuídos em oito grupos que variaram em tamanho de dois a cinco indivíduos, e 45 relações de meio-irmãos, e a paternidade múltipla foi detectada em três das seis ninhadas analisadas. Este é o primeiro estudo que avaliou a diversidade genética, estruturação populacional e paternidade múltipla na espécie S. acanthias na costa da Argentina com marcadores SNPs. Os resultados obtidos apresentam evidências da ocorrência de uma única unidade panmítica na costa da Argentina e ocorrência de paternidade múltipla na espécie, que pode estar auxiliando na manutenção da variabilidade genética.
  • ItemDissertação de mestrado
    Ácidos graxos derivados de geleia real como fonte de inibidores de desacetilases de histonas humanas: perspectivas para a terapia epigenética do câncer de mama
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-12-20) France, Fernanda Aparecida dos Santos; Rainho, Cláudia Aparecida [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    O câncer consiste em um conjunto de doenças heterogêneas, responsáveis for notória mortalidade e morbidade no mundo, sendo a segunda maior causa de morte antes dos 70 anos de idade no Brasil. Particularmente, o câncer de mama é o segundo tipo mais incidente e o mais prevalente entre as mulheres (excluindo-se o câncer de pele do tipo não melanoma). O câncer de mama é uma doença complexa que envolve diversas alterações genéticas e epigenéticas. A desregulação epigenética tem um papel essencial no desenvolvimento e progressão tumoral, bem como na aquisição de resistência à quimioterapia. A terapia epigenética é uma ferramenta promissora para o tratamento ou sensibilização de tumores aos protocolos clássicos, melhorando sua eficiência. Dentre as diferentes estratégias para a terapia epigenética, as desacetilases de histonas (HDACs) são os alvos mais estudados em ensaios clínicos, geralmente em combinação com radioterapia ou quimioterapia citotóxica/genotóxica, imunoterapia, hormonioterapia ou direcionadas a alvos específicos. Dados prévios do nosso grupo de pesquisa indicam o potencial de que o ácido 10-hidróxi-2-decenóico (10-HDA), derivado da geleia real, seja um possível inibidor de desacetilases de histonas (HDACi). Neste contexto, o presente estudo foi delineado com o objetivo de identificar novos HDACi dentre os ácidos graxos derivados da geleia realO estudo será apresentado em duas partes (capítulos). O primeiro capítulo apresenta as bases teóricas da terapia epigenética, seu potencial uso no câncer de mana e a evidências sobre o 10-HDA como um potencial HDACi. O segundo capítulo corresponde à versão premilinar do manuscrito contendo: a análise de expressão diferencial determinada por RNA-Seq dos genes codificadores de HDACs recuperados do projeto The Cancer Genome Atlas (TCGA Research Network: https://www.cancer.gov/tcga); a descrição dos ácidos graxos derivados da geleia real quanto suas características estruturais, físico-químicas e principais componentes compartilhados entre as moléculas (chamados de cores); in silico screening com os ácidos graxos derivados da geleia real por meio do método docking molecular para determinar as possíveis interações com a proteína humana modelo HDAC2, comparada com o inibidor conhecido, ácido hidroxâmico suberoilanilida (SAHA). Globalmente, os resultados indicam que os ácidos graxos da derivados da geleia real podem ocupar o domínio catalítico da HDACs de modo semelhante ao inibidor conhecido (SAHA) e indicam as melhores moléculas candidatas para os estudos futuros baseados em ensaios bioquímicos de inibição de HDACs, bem como ensaios funcionais in vitro para investigar o potencial efeito de ácidos graxos na sensibilização de linhagens celulares resistentes à quimioterápicos comumente utilizados na prática oncológica.
  • ItemDissertação de mestrado
    Avaliação da variante alélica (L162V) do gene PPARA humano na modulação de genes chave relacionados a interação parasito-hospedeiro em células THP-1.
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2011-03-26) Paiva, Isabela Gaseta Ferraz; Ribolla, Paulo Eduardo Martins [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Os receptores ativados da proliferação de peroxissomos (PPARs) compõem uma subfamília de receptores nucleares. Três isoformas, codificadas por genes separados, foram identificadas até então: PPARA (Alfa, α), PPARB (beta, β/δ) e PPARG (gama, γ). Esses receptores, que agem como fatores de transcrição, exibem diferentes funções e distribuições nos tecidos. Até o presente momento, sabe-se que os genes regulados pelos PPARs participam principalmente da regulação de proteínas chave, envolvidas no metabolismo intra e extracelular de lipídeos, oxidação de ácidos graxos e processos inflamatórios. O PPARA, em especial, é expresso em vários tecidos metabolicamente ativos, incluindo fígado, rim, coração, músculo esquelético, tecido adiposo e nos macrófagos que além de fazerem parte do sistema imunológico, possuem um papel importante no metabolismo lipídico. Pela sua influência na regulação lipídica e pelo fato da sua atividade ser facilmente modulada por drogas sintéticas, o PPARα é considerado um alvo muito importante para o tratamento eficaz das dislipidemias. Desordens lipídicas têm sido relatadas em pacientes humanos e até mesmo em cães domésticos com Leishmaniose Visceral (LV) ativa. A LV no Brasil é uma doença parasitária causada pela infecção de macrófagos do hospedeiro pelo protozoário Leishmania infantum e transmitida pelo flebotomíneo Lutzomyia longipalpis, tendo como principais reservatórios os canídeos selvagens e cães domésticos. Nesse contexto, o PPARα pode-se mostrar como um possível gene candidato a contribuir com o risco geneticamente determinado da LV. Em um estudo caso-controle realizado pelo nosso grupo na área endêmica de Teresina-PI genótipos contendo o alelo mutado 162V foram significativamente mais freqüentes entre indivíduos com LV do que entre todos os indivíduos não infectados (p= 0.007). Além disso indivíduos sadios possuindo pelo menos um alelo mutado 162V, apresentam quase quatro vezes mais chances de contrair a doença do que indivíduos que não possuem a mutação (razão de chances 3,91 e intervalo de confiança 1,38-11,07). O presente projeto tem por objetivo utilizar a tecnologia CRISPR-Cas9 para a geração de macrófagos geneticamente modificados para conter a mutação L162V do gene PPARA humano, com o intuito de avaliar o papel da variante alélica L162V do gene PPARα no estabelecimento e desenvolvimento da Leishmaniose Visceral.
  • ItemDissertação de mestrado
    Aprimoramento do protocolo de DNA metabarcoding para aplicação na identificação de áreas prioritárias à conservação da ictiofauna do rio Mogi-Guaçu
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-05-21) Costa, Gabriela Omura da; Oliveira, Cláudio de [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Apesar do Brasil possuir a maior riqueza de peixes do mundo, esta diversidade encontra-se ameaçada por diversos impactos antrópicos, sendo o barramento de rios um dos mais contundentes. Barramentos podem reduzir a diversidade local de peixes por meio de alterações físico-químicas da água, facilitação de introdução e proliferação de espécies não nativas, reestruturação de comunidades, afetando principalmente espécies migradoras de longa distância e favorecendo as sedentárias por consistir numa barreira física, muitas vezes intransponível, prejudicando o recrutamento de novos indivíduos. O conhecimento de períodos reprodutivos, áreas de desova e crescimento são extremamente importantes para a conservação de peixes, visto que tais informações podem subsidiar a delimitação de áreas prioritárias à conservação, auxiliando ações de manejo executadas por entidades federais ou estaduais. Contudo, a taxonomia tradicional apresenta limitações na identificação do ictioplâncton, visto que ovos e larvas apresentam poucos caracteres diagnósticos formados, dependendo do estágio de desenvolvimento. Num primeiro momento, para sanar esse problema, o uso de análises moleculares, baseada no sequenciamento de Sanger, utilizando o gene mitocondrial citocromo c oxidase subunidade I (COI), se mostrou uma ferramenta altamente resolutiva para essa identificação. Entretanto, essa técnica apresenta alto custo e demanda muito tempo de laboratório, quando necessária aplicação em estudos extensivos. Num segundo momento, com o avanço das técnicas de sequenciamento, o sequenciamento de nova geração, utilizando a plataforma Illumina Miseq apresentou potencial para estudos do ictioplâncton, reduzindo tempo e custo, além de aumentar a capacidade a ser analisado e mantendo a resolutividade, porém ainda carecendo de aprimoramentos. Os principais objetivos deste estudo foram i) estabelecer um protocolo de DNA metabarcoding aplicado a peixes, efetivo e de baixo custo (capítulo 1); ii) identificação resolutiva de todos os indivíduos coletados (capítulo 2); iii) identificar áreas de desova e crescimento de peixes na bacia do rio Mogi-Guaçu, buscando melhor entendimento da dinâmica reprodutiva (capítulo 2). Diante deste cenário, foram conduzidas coletas em seis pontos de um trecho do rio Mogi-Guaçu, em dois ciclos reprodutivos dos anos de 2017 a 2019 (novembro a fevereiro). O material coletado foi submetido a um sequenciamento massivo, utilizando nova metodologia com 4 dois conjuntos de primers, para obtenção do fragmento completo do gene COI (653pb). Com os resultados obtidos pudemos constatar que i) o protocolo aplicado foi capaz de gerar fragmentos com mais de 600 pb que possibilitaram a identificação a nível de espécie, diminuindo expressivamente os custos (capítulo 1); ii) a técnica de DNA metabarcoding possibilitou a identificação de 28 táxons a nível de espécie, com grande resolutividade, permitindo a identificação de três espécies que não estavam presentes em estudos de revisão anteriores para a bacia (Astyanax biotae, Pinirampus pirinampu e Sorubim lima) (capítulo 2); iii) há uma distribuição do ictioplâncton condizente com rios neotropicais, com prevalência de ovos nos trechos superiores e larvas nos trechos inferiores, com preferência de espécies de grandes migradores pelo ponto 2 (capítulo 2). Concluímos que os resultados se mostraram promissores na ampliação do conhecimento sobre a ictiofauna em geral, podendo fundamentar ações de manejo mais eficazes para conservação e também para modelo em estudos futuros nessa área de pesquisa.
  • ItemDissertação de mestrado
    Desacetilases de histonas no câncer colorretal: expressão gênica, indicadores prognósticos e perspectivas para a terapia epigenética
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-04-08) Callegari, Diogo Pessuto; Rainho, Cláudia Aparecida [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    O termo câncer colorretal (CRC) inclui os tumores localizados no intestino grosso separado em cólon e reto. Globalmente, o CRC apresenta alta incidência e taxa de mortalidade. A doença é heterogênea, possui etiologia complexa, desenvolvendo-se em múltiplas etapas em decorrência do acúmulo de alterações genéticas e epigenéticas. Estudos recentes identificaram perfis moleculares específicos caracterizados por alterações genéticas e epigenéticas: i) instabilidade cromossômica (CIN), ii) instabilidade de microssatélites (MSI), iii) fenótipo metilador de ilha CpG (CIMP) e iv) hipometilação global do DNA. Alterações epigenéticas, incluindo mudanças no perfil de metilação do DNA e de modificações pós-traducionais das histonas, são detectadas em todas as etapas do processo de carcinogênese. Neste contexto, a perda da acetilação da cromatina mediada pelas enzimas denominadas desacetilases de histonas (HDACs) têm sido implicadas na progressão do CRC e na resistência à quimioterapia. Este estudo teve como objetivo principal avaliar o padrão de expressão de genes codificadores de desacetilases de histonas em CRC e sua correlação com parâmetros clínico-patológicos. O trabalho encontra-se apresentado em duas partes: o primeiro capítulo apresenta os principais fatores epidemiológicos do câncer colorretal, sua classificação, fatores epigenéticos que acompanham seu desenvolvimento e sua relação com as HDACs, assim como o efeito das modificações de histonas na resposta à terapia. O segundo capítulo apresenta a análise do padrão de expressão dos 18 genes codificadores de desacetilases de histonas em CRC comparado a amostras de intestino normal a partir de dados de RNA-Seq disponíveis nos bancos de dados públicos The Cancer Genome Atlas (TCGA) e Genotype-Tissue Expression (GTEx) bem como possíveis correlações entre os genes diferencialmente expressos com parâmetros prognósticos. Dentre os dados disponíveis, foram selecionados aqueles obtidos a partir de amostras de tumores com alto nível de pureza de acordo com o valor de CPE (Consensus Purity Estimate). As análises foram conduzidas com o pacote DESeq2 para linguagem R (R Bioconductor v 3.8). Foram detectados seis genes diferencialmente expressos (log2FoldChange >+1 ou < –1 e p-value <0,0001; student t-test): os genes HDAC1, 2 e 8 apresentaram altos níveis de expressão enquanto osgenes HDAC 4, 9 e 10 apresentaram níveis menores nos tumores quando comparados tecido normal. Em conjunto, os genes diferencialmente expressos mostraram padrão heterogêneo entre as amostras tumorais e foram associados com a ocorrência de mutações no oncogene BRAF (genes HDAC1 e HDAC10), instabilidade de microssatélites (gene HDAC2) e o fenótipo CIMP (gene HDAC10). Considerando-se as interações entre os diferentes membros da família das HDACs e a participação dessas proteínas em complexos repressores da transcrição, novos estudos são necessários para se investigar o impacto das alterações descritas na biologia tumoral e suas implicações para as estratégias de terapia epigenética.
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    Investigação de mecanismos genéticos associados às vias de formação de ossos intermusculares no Tambaqui (Colossoma macropomum)
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-11-27) Bronze, Emily; Pinhal, Danillo {UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Diversas espécies de peixes de importância na aquicultura mundial possuem ossos intermusculares (IBs) ou espinhas, como são popularmente conhecidos. Esses IBs são uma característica comercialmente indesejável por reduzir a palatabilidade dos peixes, sendo necessária sua remoção para a produção do filé, o que resulta em impactos econômicos e de frescor do produto. O tambaqui, Colossoma macropomum, é uma espécie dulcícola neotropical da ordem Characiformes que apresenta grande potencial para a aquicultura, mas que, no entanto, possui a desvantagem de gerar os IBs. Recentemente, numa população cultivada de tambaqui, foram reportados indivíduos com ausência de IBs, sugerindo que variantes genéticas e/ou epigenéticas estejam associadas à geração do fenótipo mutante. O objetivo deste trabalho foi investigar os mecanismos moleculares associados à formação dos ossos intermusculares, de modo a contribuir para a geração de animais com maior valor econômico agregado. Para isso foi analisada a expressão de genes codificadores e genes não codificadores associados às vias de formação dos IBs, além da caracterização temporal de formação dos IBs durante o desenvolvimento. Com base na literatura, foram inicialmente selecionados para estudo três genes candidatos à atuação nas vias de ossificação intramembranosa: bmp4, runx2 e mstn. Estes foram avaliados na F1 quanto à expressão no intervalo de crescimento que compreende desde o início até a completa formação dos IBs, nos comprimentos 18, 20, 23 e 26mm. Inicialmente foi realizada a desova com as matrizes que apresentaram o fenótipo mutante desejado (sem IBs) e um grupo controle (com IBs), seguido do cultivo dos alevinos e monitoramento dos mesmos para determinação do momento de início da ossificação dos IBs ou verificação de ausência destes. Posteriormente foi realizada a coleta de tecidos da região próxima ao pedúnculo caudal seguida da extração de RNA e síntese de cDNA desses indivíduos para subsequente análise de perfis de expressão gênica por qPCR. Concomitantemente, foi realizada a fixação e diafanização de alevinos em diferentes fases do desenvolvimento para a caracterização morfológica dos IBs. O RNA total foi isolado das matrizes mutante e controle para sequenciamento em larga escala de miRNAs (miRNA-Seq). Como resultados verificou-se que os IBs no tambaqui são formados a partir de 15 mm de comprimento total, anterior ao previamente reportado para outros teleósteos. A análise comparativa de expressão do bmp4 revelou diferença significativa entre mutantes e controle, havendo uma diminuição na expressão na F1 dos grupos mutantes, principalmente nos comprimentos considerados de ativa mineralização óssea (i.e., 20 e 23mm). O runx2b também apresentou diferença significativa entre mutantes e controle, porém o pico de diminuição de expressão ocorreu nos animais com 20mm de comprimento. Por outro lado, a mstn apresentou, um aumento significativo de expressão nos mutantes sem IBs na comparação aos animais controle, sugerindo possível envolvimento desses genes nas vias associadas a formação dos IBs. O miRNA-seq revelou a expressão de miRNAs importantes para a regulação de vias de formação óssea, incluindo os atuantes na regulação dos três genes codificantes alvo analisados, além da detecção de novos miRNAs exclusivamente expressos apenas nos tambaquis mutantes sem IBs. Este é um dos primeiros estudos onde avaliou-se a expressão de genes envolvidos na formação óssea em espécie de peixe neotropical, cujos espécimes foram obtidos pelo acasalamento de matrizes mutantes sem IBs. Adicionalmente trata-se da primeira análise do microRNAoma completo para investigação do fenótipo mutante sem ossos intermusculares. Esses dados inéditos gerados fornecem subsídios para trabalhos futuros visando a produção de linhagens de tambaqui sem IBs, com grande potencial para melhoria de produtividade na aquicultura.
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    Diversidade do gene KIR3DL3 em populações mundiais e aspectos evolutivos
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-04-27) Andrade, Heloísa de Souza; Castelli, Erick da Cruz [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Os receptores killer semelhantes à imunoglobulina (KIRs) são moléculas receptoras transmembranares expressas em células natural killer e T citotóxicas. Esses receptores reconhecem moléculas do sistema imunológico, principalmente moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (HLA) de classe I na superfície de células somáticas. Os genes KIR são altamente polimórficos tanto do ponto de vista de número de cópias de cada gene quanto do conteúdo de sequência. KIR3DL3 é um gene KIR considerado framework, pois está presente em todos os indivíduos em duas cópias. Aqui, abordamos a diversidade genética e os aspectos evolutivos do gene KIR3DL3 em populações humanas de todo o mundo, usando uma abordagem de bioinformática desenvolvida para este estudo e que minimiza viés de mapeamento e erros de genotipagem. O conjunto de amostras compreende 2504 indivíduos de 26 populações distintas, provenientes do consórcio 1000 Genomes Project, além de 216 amostras brasileiras do estado de São Paulo que foram sequenciadas utilizando sequenciamento de segunda geração. Marcadores informativos de ancestralidade foram utilizados na população brasileira para determinar o perfil de ancestralidade genômica de cada indivíduo e para se obter uma média da população total. A variabilidade genética do KIR3DL3 é muito maior do que conhecemos atualmente, especialmente quando consideramos íntrons e sequências regulatórias. A diversidade de proteínas de KIR3DL3 é fortemente influenciada pelo perfil de ancestralidade do indivíduo, com proteínas completas e resíduos de aminoácidos apresentando diferentes frequências entre africanos, europeus e outras populações. Nesse caso, as populações do leste da Ásia apresentam um padrão diferente das demais considerando frequências de alelos, proteínas, sequências regulatórias e perfil de seleção natural. Por esse motivo, qualquer estudo de associação com doenças envolvendo KIR3DL3 deve ser realizado considerando a estratificação populacional. Alguns segmentos de KIR3DL3 são altamente conservados, como os éxons que codificam o peptídeo líder e o domínio extracelular D2, importantes para a interação com HLA, enquanto outros segmentos, como a região promotora e o éxon 6 (domínio transmembranar) são bastante variáveis. Encontramos evidências de seleção balanceadora na região promotora, provavelmente mantendo sequências com diferentes ações regulatórias. Essa evidência é mais forte entre europeus e no leste asiático. Também encontramos evidências de seleção balanceadora em íntrons, que devem ser considerados como possíveis portadores de elementos regulatórios.
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    Perfil de expressão gênica de fêmeas de Aedes aegypti durante o cortejo e acasalamento.
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-04-30) Troca, Heitor Madalena da Silva; Ribolla, Paulo Eduardo Martins [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    O Aedes aegypti é o mosquito mais sinantrópico e antropofílico da família Culicidae. Esta espécie sempre coabita com os seres humanos e é extremamente oportunista. A dispersão vetorial está diretamente relacionada à capacidade das fêmeas de encontrar um parceiro com sucesso em um cenário urbano geralmente irregular. No presente trabalho, investigamos alterações transcricionais em fêmeas de Ae. aegypti durante o processo de cortejo e após o acasalamento. Observamos uma alteração substancial na expressão gênica desencadeada logo após o contato com machos de Ae. aegypti, que por sua vez não estavam totalmente correlacionados com as alterações desencadeadas pelo contato. Após analisar genes compartilhados significativamente e diferencialmente regulados entre contato específico e inseminação, a maior parte da mudança transcriptômica observada desencadeada por contato é revertida após o acasalamento, indicando uma situação intermediária entre as condições virgens e de cortejo que supomos ser crucial para o sucesso do acasalamento. Após o contato, vários genes quimiossensoriais relacionados são reprimidos, especialmente proteínas de ligação a odorante. A maioria desses genes retorna a taxas de expressão mais altas após o acasalamento. Nenhum desses genes é significativamente regulado pelo encontro de uma espécie diferente, em nosso estudo, Aedes albopictus. Os resultados apresentados aqui podem ser aplicados a uma abordagem inovadora de controle, focada nos sistemas semioquímicos de mosquitos, em um esforço para interromper a interação indesejável entre inseto-hospedeiro para reduzir o risco de transmissão de patógenos aos seres humanos.
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    Análise de dados por imputação de sequenciamento de baixa cobertura: Seleção de marcadores e genética populacional.
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-04-27) Alvarez, Marcus Vinicius Niz; Ribolla, Paulo Eduardo Martins [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Introdução: O desenvolvimento de estratégias para redução no custo do sequenciamento de genoma completo (WGS) é importante para projetos que demandam por grandes quantidades de amostras. Uma estratégia de baixo custo é o sequenciamento de baixa cobertura aliado a técnicas de imputação para genotipagem eficiente e de confiabilidade adequada. A malária é uma das principais doenças transmitidas por artrópodes no mundo e o Brasil é considerado um país com alta incidência de malária, principalmente na região Amazônica, sendo principal vetor o mosquito Anopheles darlingi. Objetivo: O objetivo do presente estudo foi desenvolver estratégia para analisar dados de WGS de baixa cobertura de mosquitos Anopheles darlingi coletados no município de Mâncio Lima no Acre e verificar associação entre dados genéticos e dados de importância epidemiológica, tais como comportamento de picada, horário de atividade e distanciamento em escala microgeográfica. Materiais e métodos: Amostras de mosquitos Anopheles darlingi foram coletadas no município de Mâncio Lima - AC, entre 2016 e 2017. As bibliotecas foram preparadas com Nextera™ XT e sequenciadas no NextSeq500 da Illumina. Foi realizado genotipagem por sequenciamento e aplicado imputação. Estudos de associação ampla do genoma foram realizados com comportamento de picada e horário de atividade. Sinais de estratificação na população foram investigados por FST amplo no genoma e teste de permutação para significância. Resultados: Sinais fracos porém significativos para estratificação foram encontrados considerando distâncias de 2 a 3 km entre os grupos. Associações significativas foram observadas entre comportamento de picada e polimorfismos de nucleotídeo único (SNP), principalmente SNPs adjacentes ao gene Cyp450. Associações significativas foram observadas entre horário de atividade e SNPs adjacente aos genes timeless-2 e rdgC. Conclusões: A utilização de dados de WGS de baixa cobertura aliado à imputação de dados é uma estratégia viável para redução do custo em projetos de sequenciamento genômico com grandes quantidades de amostras. Os resultados das análises de estratificação sustentam a hipótese de que a população de Anopheles darlingi está em processo de estratificação genética em escala microgeográfica no município de Mâncio Lima. Os resultados dos estudos de associação ampla genômica sugerem que SNPs significativos para comportamento de picada podem estar associados a genes de resistência de inseticidas e SNPs significativos para horário de atividade sugerem associação com genes relacionados a regulação do ciclo circadiano.
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    Potencial toxicogenômico do contaminante ambiental 2-fenilbenzotriazol-9 não clorado (non-Cl PBTA-9) in vivo
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-03-02) Tanamachi, Amanda Rodrigues A. R. [UNESP]; Salvadori, Daisy Maria Fávero [UNESP]; Fernandes, Fábio Henrique; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    O setor industrial, em constante expansão, gera, diariamente, resíduos com elevado potencial tóxico ao ambiente. Nesse contexto, a indústria têxtil apresenta grande impacto poluidor para a hidrosfera, devido aos compostos e processos químicos utilizados na coloração de tecidos. A literatura mostra que não há eficiência na remoção desses compostos, tanto por parte das fábricas, como em Estações de Tratamento de Água (ETAs) para o abastecimento humano. Pelo contrário, o processo de descontaminação pode tornar corantes do grupo azo, por exemplo, ainda mais tóxicos. Portanto, a poluição ambiental por essa classe de corantes vem sendo alvo de inúmeros estudos para a caracterização química e toxicológica, sobretudo dos subprodutos e intermediários gerados, dentre os quais os 2-fenilbenzotraizóis não clorados (non-Cl PBTA). Dentre eles, o non-Cl PBTA-9 tem recebido especial atenção por ser derivado do corante Disperse Violet 93, que tem sido detectado em maior quantidade nos corpos fluviais sob influência de atividades têxteis. Com base nesse cenário, o presente estudo objetivou investigar o potencial toxicogenômico do non-Cl PBTA-9 em camundongos. Foram testadas três concentrações do composto, 5, 50 e 500 μg/kg p.c., administradas aos animais por via gástrica (gavage) em dose única. Foram analisadas as frequências de micronúcleo em células de medula óssea, o nível de danos primários no DNA em células do sangue, fígado e cólon, além do padrão de expressão dos genes TP53, CYP1A1, NAT2 e CDKN1A e histologia do fígado. Os resultados mostraram que o non-Cl PBTA-9 apresentou efeito genotóxico em células do sangue periférico e do fígado na dose de 500 μg/kg p.c, além de ser genotóxico nas doses de 5, 50 e 500 μg/kg em células do cólon. O efeito mutagênico em células da medula óssea foi observado apenas nas doses de 5 e 50 μg/kg p.c e não foi encontrada nenhuma alteração histológica e na expressão gênica no fígado. Diantes desses achados pode-se concluir que o non-Cl-PBTA-9, subproduto do corante azo DV93, mesmo em baixas concentrações, foi genotóxico e mutagênico, sugerindo que a contaminação da água por esse composto pode ser prejudicial ao meio ambiente e à saúde humana.
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    Efeito dos sesquiterpenos α-humuleno e β-cariofileno sobre linhagens celulares derivadas de carcinomas mamários
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2019-09-30) Barbosa, Barbara Mitsuyasu [UNESP]; Rainho, Claudia Aparecida [UNESP]; Viveiros, Magda Massae Hata; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    O carcinoma mamário é o tipo de câncer mais frequente entre as mulheres, com estimativas de aumento de sua incidência mundial nas próximas décadas. O câncer de mama triplo negativo (CMTN) é um subtipo definido pela falta de receptores para os hormônios estrógeno e progesterona e sem superexpressão de HER-2. Ocorre geralmente em mulheres com menos de 50 anos e está relacionado a uma alta taxa de recorrência e mortalidade. As terapias convencionais são hormônio-dependentes ou possuem a proteína HER2 como alvo, logo o CMTN não é responsivo a essas modalidades terapêuticas. Devido a biologia deste tumor, novas abordagens são necessárias para o seu tratamento. Plantas são importantes fontes de compostos antitumorais. Os sesquiterpenos α-humuleno (HUM) e β-cariofileno (CAR) geralmente estão presentes em conjunto no óleo essencial de diversas plantas. Um número limitado de estudos foi realizado sobre os seus efeitos em células derivadas de carcinomas mamários, porém um efeito imunomodulador foi descrito para diferentes sesquiterpenos em células derivadas de cânceres humano. A hipótese desse estudo é que os efeitos in vitro dos sesquiterpenos HUM e CAR nas linhas celulares derivadas de CMTP são mediados por alterações nos níveis de expressão de citocinas produzidas pelas células tumorais. Foram selecionadas quatro linhagens celulares triplo-negativas (BT-20, BT-549, MDA-MB-231 e MDA-MB-436). Inicialmente, os efeitos isolados ou combinados do HUM e CAR foram avaliados pelo ensaio de viabilidade celular pelo teste de MTT em diferentes concentrações (6,25; 12,5; 25; 50 e 100 µM), após 24, 48, 72 e 96 horas de exposição. Com base nos resultados, a linhagem celular BT-20 foi selecionada para os experimentos subsequentes. A proliferação e migração celular foi avaliada pelo scratch assay e os níveis relativos de expressão do gene CXCL8 foram determinados por RT-PCR quantitativa em tempo real. Os sesquiterpenos HUM e CAR têm baixo potencial citotóxico nas linhagens derivadas de CMTNs e nenhum efeito na migração das células BT-20. Além disso, o α-humuleno foi capaz de aumentar os níveis de transcrição do gene CXCL8, que codifica IL-8, nessa linhagem celular. Como essa quimiocina foi associada a atividades de promoção de tumores, nossos resultados sugerem que esses sesquiterpenos não são úteis para as novas estratégias terapêuticas do câncer.
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    Avaliação de perdas e ganhos de DNA na região 7q11.23 em indivíduos com diagnóstico clínico de síndrome de Williams-Beuren e FISH negativo.
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2019-09-24) Batista, Letícia Cassimiro; Ferreira, Danilo Moretti [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A síndrome de Williams-Beuren (SWB) é uma doença genética caracterizada por dismorfismos faciais, anomalias cardiovasculares, deficiência intelectual e perfil cognitivo típico. A SWB é causada por uma microdeleção hemizigótica da região cromossômica 7q11.23, de ~1,5Mb a 1,8Mb de genes de copias únicas e deleções maiores ou menores que esses limites são considerados deleções atípicas. O objetivo do trabalho foi detectar perdas ou ganhos de DNA por meio da técnica de MLPA na região crítica da SWB em pacientes com diagnóstico clínico estabelecido pela pontuação de escore da AAP, (2001) e com exame de FISH (-) realizado anteriormente pelo nosso grupo de pesquisa, e assim correlacionar os achados de perdas ou ganhos de DNA com os já descritos na literatura e correlaciona-los aos fenótipos/genótipo descritos em bancos de dados público como DVG, DECIPHER, UCSC Genome Browser dentre outros. Foram selecionados 30 indivíduos com hipótese diagnóstica de SWB e análise citogenética negativa para SWB estabelecida pela técnica da FISH. O diagnóstico clínico de SWB “clássica” foi estabelecido pelo escore da Academia Americana de Pediatria (2001). Foi realizada a extração de DNA das amostras e foi aplicada a técnica de MLPA com o kit SALSA P029 (MRC-Holland, Amsterdam, The Netherlands) com sondas específicas para os principais genes encontrados na região crítica da SWB. Nesta amostra predominou o sexo masculino (2M:1F) e a idade do 1° atendimento foi tardia (mediana 9,5 anos). A casuística apresentou as características faciais que determinam a face considerada como típica na SWB. Apenas 11/30 pacientes apresentavam cardiopatia, e desses apenas 2/11 apresentavam a estenose aórtica supravalvar. Das alterações gastrointestinais as mais frequentes foram as dificuldades alimentares e constipação. As características que compõem o perfil cognitivo típico da SWB as mais frequentes foram: hiperatividade, loquacidade, sociabilidade excessiva e deficiência intelectual. Apesar da casuística apresentar características típicas da SWB a análise molecular pela técnica de MLPA não detectou nenhuma perda ou ganho de DNA na região crítica da SWB. A técnica pode não ter detectado nenhuma perda ou ganho de DNA, porque as alterações podem estar presentes em regiões que não são cobertas pelas sondas presentes no kit comercial P029-C1. Assim, para os casos com diagnóstico clínico de SWB e FISH (-), sugerimos o uso de outras técnicas como o array-CGH ou NGS. Foi realizado o Aconselhamento genético dos familiares, informando esses resultados e comunicando-lhes que o estudo prosseguirá com aplicações de outras metodologias laboratoriais subsidiárias ao diagnóstico clínico do paciente.
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    Variabilidade genotípica e estrutura populacional de Astronium fraxinifolium Schott (Anacardiaceae) em área degradada de Cerrado
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2019-04-29) Alcantara, Marcelo Augusto Mendes; Marino, Celso Luis [UNESP]; Moraes, Mario Luiz Teixeira de [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    O Brasil possui vasta diversidade biológica tanto em sua fauna quanto em sua flora. Muito dessa diversidade ainda se encontra pouco ou inexplorada pela ciência. Dentre tantas espécies ainda pouco estudadas, encontra-se Astronium fraxinifolium Schott, popularmente conhecido como Gonçalo-Alves, tipicamente de cerrado e com aparições em outros biomas circundantes. A partir de uma população natural de A. fraxinifolium localizada em área degradada de Cerrado, o presente trabalho objetivou estimar a variação genotípica com base em seus caracteres silviculturais, propor um índice de seleção individual com base no valor genotípico (BLUP), determinar a proporção sexual dentro da população, o tamanho efetivo populacional, a diversidade, a estrutura genética, os níveis de endogamia, a coancestria e o tamanho efetivo populacional a partir da amplificação e identificação de locos microssatélites. A medição da altura foi realizada com equipamento hipsômetro baseado em sistema ultrassom e a estimativa do caráter diâmetro a altura do peito (DAP) a partir da conversão da circunferência à altura do peito. Para a extração do material genético e posterior genotipagem, coletou-se tecidos foliares de 384 árvores. As estimativas de componentes de variância e parâmetros genéticos dos caracteres silviculturais foram obtidos com base no procedimento - REML/BLUP empregando-se o software SELEGEN-REML/BLUP. A proporção sexual entre os indivíduos masculinos e femininos dentro da população foi estimada segundo o teste estatístico do qui-quadrado. A diversidade genética foi estimada utilizando o software FSTAT. Os coeficientes de coancestria e o erro padrão foram estimados utilizando o software SPAGeDi. A média geral para os caracteres altura e DAP foram de 11,31 m e 26,15 cm, respectivamente. A média desses caracteres para os indivíduos femininos e masculinos da população de regenerantes foram 11,67m e 23,92 cm e 10,91m e 25,72cm, respectivamente. Os valores para variância genotípica para o caráter DAP foram de 56,28 para a população, árvores femininas e masculinas de 57,89 e 48,10 respectivamente. A variância fenotípica por sua vez, indicou valores de 167,72 para a população e 99,59 e 173,18 para as subpopulações femininas e masculinas, respectivamente. O índice de seleção proposto para a população revelou ganhos de 17,36% para o caráter altura e 23,94% para o caráter DAP. A proporção sexual da população revelou ser de 1,13:1 (F:M) e encontra-se em equilíbrio de 1:1 de acordo com o teste do qui-quadrado (X2=0,21). Nos 386 genótipos de A. fraxinifolium observou-se 101 alelos. A média do número de alelos por loco foi de 5,08±1,2 e a estimativa média da riqueza alélica média (R) de 12,5±3,3. A heterozigosidade observada (Hˆo) foi significativamente menor do que a heterozigosidade esperada (He) em todos os locos. O nível médio de endogamia observada na população (F = 0,111) o que pode representar cruzamento entre meios-irmãos ( ) nos parentais. O coeficiente médio de coancestria entre as fêmeas ( f), machos e fêmeas ( fm), e machos ( m) foram de 0,000032; 0,000365 e 0,001776, respectivamente. A coancestria média do grupo de árvores dentro da população foi baixa e positiva ( = 0,002174). A partir destes dados, é possível inferir que a população de A. fraxinifolium presente na área degradada, antiga área de empréstimo da UHE Ilha Solteira apresenta diversidade genética significativa com alto potencial evolutivo e de manutenção da diversidade genética ao longo das gerações, selecionável para compor populações base de melhoramento genético, bem como banco ativo de germoplasma e outras coleções de germoplasma (sementes).
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    Aprendizado de Máquina e Biologia de Sistemas aplicada ao estudo da Síndrome de Microdeleção 22q11
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2019-04-30) Alves, Camila Cristina de Oliveira; Bicudo, Lucilene Arilho Ribeiro [UNESP]; Valente, Guilherme Targino [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A Síndrome de Microdeleção 22q11 (SD22q11), causada por uma deleção de aproximadamente 3Mb na região 22q11, apresenta uma frequencia média de 1 em 4000 a 9800 nascidos vivos sendo considera a síndrome de microdeleção mais frequente e a segunda causa mais comum de atraso no desenvolvimento e de doença congênita grave, após a síndrome de Down. De acordo com o tamanho e a localização da deleção, diferentes genes podem ser afetados e o principal gene considerado como responsável pelos sinais clássicos da síndrome é o TBX1. A SD22q11 caracteriza-se por um espectro fenotípico bastante amplo, com efeitos pleiotrópicos que resultam no acometimento de praticamente todos os órgãos e/ou sistemas, altamente variáveis com mais de 180 sinais clínicos já descritos, tanto físicos como comportamentais. Nesse trabalho aplicamos ferramentas de bioinformática com o intuito de descobrir padrões clínicos e sistêmicos da deleção 22q11, classificando casos sindrômicos em típicos e atípicos e estudando o impacto da deleção em redes de interação proteína-proteína (PPI). Para avaliação dos sinais clínicos que pudessem diferenciar pacientes sindrômicos foi aplicado uma metodologia baseada em aprendizado de máquina para classificar os casos em típico e atípico de acordo com os sinais clínicos através do algoritmo J48 (um algoritmo de árvore de decisão). As árvores de decisão selecionadas foram altamente precisas. Sinais clínicos como fissura oral, insuficiência velofaríngea, atraso no desenvolvimento de fala e linguagem, incapacidade de aprendizagem específica, anormalidade comportamental e atraso de crescimento foram indicativos para classificação dos casos. Já a avaliação do impacto da deleção da região 22q11 foi realizada através de estudos envolvendo redes biológicas. Assim, os genes codificadores de proteínas envolvidos na deleção foram removidos da rede PPI humana para simular a deleção. Diferentes análises topológicas foram utilizadas para comparar a rede global (GN) com a rede paciente (PN). Além disso foi verificado as comunidades de ambas as redes e realizou-se uma análise de enriquecimento de ontologia. Os resultados mostraram que não há diferença significativa ao comparar GN e PN, porém observamos que há diferença entre as comunidades dessas redes. Além disso, foi possível analisar diferentes genes que estavam presentes em regiões enriquecidas com termos ontológicos semelhantes. Dessa forma, podemos concluir que estudos envolvendo Aprendizado de Máquina e Redes Biológicas podem apontar novas hipoteses no estudo da SD22q11 além de ter potencial para esclarecer diversos aspectos de diferentes patologias que não são prontamente acessíveis pela biologia molecular convencional ou abordagens genéticas.