Avaliação da segurança do biopolimero de fibrina como arcabouço para células tronco mesenquimais em lesões na dura-máter em ratos

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dc.contributor.advisorFerreira Júnior, Rui Seabra [UNESP]
dc.contributor.authorOchoa, Clara Cecilia Reyes
dc.contributor.institutionUniversidade Estadual Paulista (Unesp)
dc.date.accessioned2019-03-25T19:20:24Z
dc.date.available2019-03-25T19:20:24Z
dc.date.issued2019-02-25
dc.description.abstractTerapias efetivas de lesões na dura-máter representam um enorme desafio à medicina, devido à dificuldade de suturas com êxito e de vedação das meninges, aumentando os índices de mortalidade e morbidade destes pacientes. Biomateriais que possam favorecer a regeneração e impedir o extravasamento de líquido cefalorraquidiano sem produzir efeitos adversos são alvos da indústria farmacêutica. Este estudo avaliou a biocompatibilidade do Biopolimero de Fibrina (BPF) derivado de peçonha de serpente como arcabouço tridimensional para células-tronco mesenquimais (CTMs) em lesões na dura-máter de ratos wistar (Rattus norvegicus). As CTMs foram caracterizadas na quinta passagem por citometria de fluxo (ICAM, CD90, CD34, CD45, CD11b) e diferenciadas em linhagens osteogênica e adipogênica. Foram utilizados 4 grupos (n=20) de ratos Wistar machos adultos. O grupo C (controle) foi submetido à durotomia. Os grupos tratados foram submetidos à durotomia seguido de: Tratamento com Biopolimero de fibrina (BPF); células-tronco mesenquimais (CTMs); e BPF+CTMs, formado pela associação do Biopolimero de fibrina e células-tronco mesenquimais. As CTMs marcadas e associadas ao BPF foram avaliadas por imageamento da fluorescência in vivo. Os animais foram avaliados neurológica e clinicamente quanto à sensibilidade dolorosa, deiscência de pontos, infecção da ferida, consumo de alimento e água e habilidades motoras. Foram realizadas eutanásias dos animais aos 7 e 28 dias após cirurgia e coletado material para análise histológica, e proteômica. A extração de proteínas foi feita pela combinação com espectrometria de massa baseada no método de “shotgun”. O cultivo de CTMs mostrou na caracterização, células com morfologia congruente de CTMs, adesão em substrato plástico, expressão de marcadores positivos ICAM e CD90, e ausência a marcadores negativos CD34, CD45 e CD11b, autorrenovação e diferenciação em linhagens ostegênica e adipogênica. As CTMs foram visualizadas íntegras por imageamento in vivo da associação após 6 horas de implantação. Não houve diferença para os parâmetros deiscência, infecção da ferida, consumo de alimento e água e habilidades motoras entre os grupos. Os grupos BPF e BPF+CTMs apresentaram menor manifestação de sensibilidade dolorosa, em comparação aos grupos CTMs e C. Nas análises histológicas, o grupo C, se apresentou com uma lesão na dura mater ou lacuna no lugar da lesão, sem nem um tipo de atividade celular. No grupo BPF não foi observada bioactividade celular, nem manifestações de rejeição do implante no lugar da lesão. Nos grupos CTMs e BPF+CTMs foi observada atividade celular com presença de infiltrado inflamatório e interface. No entanto, no grupo BPF+CTMs a resposta inflamatória se apresentou exacerbada, levando a uma inflamação granulomatosa, indicando que a presença das CTMs foi responsável por este efeito. O perfil proteômico evidenciou principalmente moléculas envolvidas em processos celulares, desenvolvimento de sistema e resposta ao estímulo. A proteína PENK responsável pela modulação da expressão da dor foi expressa apenas naqueles grupos que não utilizaram BPF. Conclui-se portanto que o Biopolímero de Fibrina pode ser utilizado com segurança na reparação de lesões de dura mater, além de ser um excelente scaffold para células tronco.pt
dc.description.abstractEffective therapies to treat dura mater injuries represents a major challenge to medicine due to its lack of sutures with high seal properties upon meninges, increasing the rate of mortality and morbidity among these patients. Biomaterials that promotes regeneration and prevent extravasation of cerebrospinal fluid, without producing adverse effects, are targets of the pharmaceutical industry. The present study aimed to evaluate the biocompatibility of the use on Fibrin Biopolymer (FBP) derived from snake venom as tridimensional scaffold to mesenchymal stem cells (MSC) on rat’s dura mater injury. Mesenchymal stem cells characterization was performed at fifth passage by flow cytometry (ICAM, CD90, CD34, CD45, CD11b) and differentiated into osteogenic and adipogenic lineages. Four groups (n=20) os male Wistar rats were used. Group C (control) animals were submitted to durotomy only. Treatment groups were submitted to durotomy followed by: Fibrin Biopolymer (FBP); mesenchymal stem cells (MSC); and FBP+MSCs, consisting on the association between fibrin biopolymer and mesenchymal stem cells. Marked MSCs associated to FBP were evaluated through in vivo fluorescence imaging. Animals were evaluated neurologically and clinically regarding pain sensitivity, dehiscence of suture, wound infection, feeding e motor capacity parameters. Animals were euthanized at seven and 28 days after surgical procedure, and biological material was collected to histological and proteomic analysis. Protein extraction was performed by mass spectrometry based on “shotgun” method. Cultivated MSC presented on characterization congruent morphology to this lineage, adhesion on plastic substrate, positive expression to markers ICAM and CD 90, negative expression to markers CD34, CD45 e CD11b, self-renewal and differentiation into osteogenic and adipogenic lineages. MSC showed integrate visualization on in vivo imaging of this association six hours after implantation. No difference occurred between for dehiscence, wound infection feeding and motor capacity parameters. FBP and FBM+MSC groups showed lower pain sensitivity manifestations, compared to groups MSC and C. Histological analysis showed that control group presented a dura mater lesion or gapon the surgery site, without any type of cell activity. Cell activity or rejection indicators at lesion site was not observed in FBP group. Groups MSC and FBP+MSC showed cell activity with presence of inflammatory infiltrate and interface, however, in group FBP+MSC the inflammatory response was exacerbated, leading to a granulomatous inflammation caused by the presence of MSCs. The proteomic profile showed mainly molecules involved on cellular processes, system developing and answer to stimulus. PENK protein, responsible for modulation of pain expression, was expressed only on those groups without FBP. Therefore, we conclude that the fibrin biopolymer is suitable for safe applying on repair of a lesion in dura mater, in addition to being an excellent scaffold to mesenchymal stem cellen
dc.description.sponsorshipCoordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
dc.identifier.aleph000914152
dc.identifier.capes33004064065P4
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11449/181183
dc.language.isopor
dc.publisherUniversidade Estadual Paulista (Unesp)
dc.rights.accessRightsAcesso aberto
dc.subjectlesão duralpt
dc.subjectBiopolimero de Fibrinapt
dc.subjectbiocompatibilidadept
dc.subjectcélulas tronco mesenquimaispt
dc.subjectregeneraçãopt
dc.subjectregenerationen
dc.subjectbiocompatibilityen
dc.subjectbioactivityen
dc.subjectfibrin biopolymeren
dc.subjectmesenchymal stem cellsen
dc.subjectdural injuryen
dc.titleAvaliação da segurança do biopolimero de fibrina como arcabouço para células tronco mesenquimais em lesões na dura-máter em ratospt
dc.title.alternativeEvaluation of the safety of fibrin biopolymer as a scaffold to mesenchymal stem cells in dura-mater lesion of ratsen
dc.typeTese de doutorado
unesp.campusUniversidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Medicina, Botucatupt
unesp.embargoOnlinept
unesp.graduateProgramDoenças Tropicais - FMBpt
unesp.knowledgeAreaBiomateriaispt
unesp.researchAreanão constapt

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