Genetic pathways toward efficiency: adaptive laboratory evolution and gene editing strategies in the fermentation of lignocellulosic hydrolysate by Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Esta Tese explora as respostas adaptativas de cepas de Saccharomyces cerevisiae que foram submetidas a protocolos de Evolução Laboratorial Adaptativa (ALE) em hidrolisado lignocelulósico. Duas abordagens distintas, transferência serial (ALE1, ALE2, ALE3) e o choque/recuperação (ALE4), foram empregados, desenvolvendo tolerância significativa em cepas haplóides (ALE2 e ALE4) e diplóides de CEN.PK113-7D (ALE3), além de cepas diplóides de PE-2_H4 (ALE1). Pós-evolução, foram elaboradas competições de crescimento contra a cepa parental, que demonstrou quais cepas eram superiores. Além disso, as mutações genéticas foram identificadas através do sequenciamento do genoma completo (WGS) e demonstraram a importância do paralelismo das mutações. As cepas evoluídas e cepas de engenharia reversa foram analisadas sob condições de fermentação controlada, indicando as linhagens CHG, CHH (ALE2) e S_CHN (ALE4) com ótimo desempenho, indicando fases lag mais curtas, taxas de crescimento mais altas e maior produção de etanol/CO2. Nas linhagens de engenharia reversa, RET1SIZ1Δ e PMA1Δ mostraram melhor crescimento em hidrolisado. Além disso, essa Tese investiga o desenvolvimento e a caracterização da cepa PE2_H4_GN1, revelando as sobreposições genética com populações evoluídas que a originaram (ALE1). As análises de fermentação demonstraram taxas de crescimento aumentadas no hidrolisado, com a metabolômica enfatizando a produção de etanol, desintoxicação de inibidores, produção de glicerol, variações de produção de aminoácidos, poliaminas e metabolismo do carbono central. Dados proteômicos fecharam o estudo, identificando termos enriquecidos de Gene Ontology, sugerindo mudanças adaptativas na síntese de ATP, biossíntese de aminoácidos e organização do citoesqueleto. Essas descobertas elucidaram as estratégias e vias metabólicas das linhagens de ALE. E a pesquisa em geral contribui com informações valiosas para os campos da evolução laboratorial, etanol de segunda geração e biotecnologia.

This Thesis explores the adaptive responses of Saccharomyces cerevisiae strains that were subjected to Adaptive Laboratory Evolution (ALE) protocols in the lignocellulosic hydrolysate. Two distinct approaches, serial transfer (ALE1, ALE2, ALE3) and shock/recovery (ALE4), were employed, developing significant tolerance in haploid (ALE2 and ALE4) and diploid CEN.PK113-7D (ALE3) strains, in addition to diploid strains of PE-2_H4 (ALE1). Post-evolution, growth competitions versus the parental strain were designed and demonstrated which strains were superior. Furthermore, genetic mutations were identified through whole genome sequencing (WGS) and demonstrated the importance of mutation parallelism. The evolved strains and reverse-engineered strains were analyzed under controlled fermentation conditions, indicating strains CHG, CHH (ALE2), and S_CHN (ALE4) with excellent performance, indicating shorter lag phases, higher growth rates, and greater ethanol production /CO2. In the reverse-engineered lines, RET1SIZ1Δ and PMA1Δ showed better growth in hydrolysate. Furthermore, this Thesis investigates the development and characterization of the PE2_H4_GN1 strain, revealing the genetic overlaps with the evolved populations that originated it (ALE1). Fermentation analyses demonstrated increased growth rates in the hydrolysate, with metabolomics emphasizing ethanol production, inhibitor detoxification, glycerol production, variations in amino acid production, polyamines, and central carbon metabolism. Proteomic data ended the study, identifying enriched Gene Ontology terms, suggesting adaptive changes in ATP synthesis, amino acid biosynthesis, and cytoskeletal organization. These findings elucidated the metabolic strategies and pathways of ALE lineages, and the research in general contributes with valuable information to the fields of laboratory evolution, second-generation ethanol, and biotechnology.