Hidrogel como sistema drug delivery de ranelato de estrôncio e raloxifeno, impresso em 3D, para reparo ósseo em ratas ovariectomizadas: estudo in vitro e in vivo

Este estudo investigou a influência de novos sistemas drug delivery utilizando hidrogéis incorporados com partículas de biovidro funcionalizadas com medicamentos na regeneração de defeitos ósseos críticos em fêmures de ratas ovariectomizadas. Os fármacos utilizados para funcionalizar as partículas do biovidro foram o raloxifeno e o ranelato de estrôncio. Inicialmente foi realizada a síntese e caracterização do biovidro, seguida da sua funcionalização com os fármacos, por meio da rota sonoquímica. Sequencialmente foi realizada a produção dos hidrogéis incorporados com biovidro funcionalizado, por meio da técnica de impressão 3D; e a seguir foi realizada sua caracterização. Para o teste in vitro de viabilidade celular inicialmente oito ratas Wistar foram divididas em 2 grupos: SHAM- submetidas à cirurgia fictícia de ovariectomia bilateral, OVX- submetidas à ovariectomia bilateral. Após 8 semanas as ratas foram eutanasiadas para o isolamento das células mesenquimais a partir da medula óssea dos fêmures, as quais foram diferenciadas em osteoblastos. Posteriormente, foi realizado o plaqueamento celular para a realização do teste de viabilidade nos diferentes hidrogéis. Finalmente, foi realizado o experimento in vivo, em que as ratas Wistar novamente foram divididas a partir das cirurgias SHAM e OVX realizadas e a seguir distribuídas para cada subgrupo. Após 8 semanas das cirurgias, todos os animais foram submetidos à confecção do defeito ósseo crítico na epífise distal dos fêmures direitos, os quais foram preenchidos com as amostras de hidrogéis 3D com tamanho de 3x3mm dos grupos: hidrogel puro, hidrogel incorporado com partículas de biovidro e hidrogel incorporado com partículas de biovidro funcionalizadas com os fármacos raloxifeno ou ranelato de estrôncio. No grupo controle os defeitos foram preenchidos apenas com coágulo. A eutanásia dos animais foi realizada 4 semanas após o procedimento cirúrgico e os fêmures foram coletados para a realização das análises de microtomografia computadorizada, além das avaliações histológica, histomorfométrica e imunoistoquímica, para avaliar a qualidade e a quantidade de tecido ósseo neoformado na área do defeito, bem como a presença de marcadores TRAP, osteocalcina e osteoprotegerina e Rank-L. Os dados quantitativos foram submetidos ao teste de normalidade e teste estatístico apropriado (paramétrico anova dois fatores e não paramétrico Kruskal Wallis), com nível de significância de 5%. Os resultados mostraram que a técnica foi eficiente para produzir os diferentes hidrogéis, que não foram citotóxicos (p>0,05) e que foi possível preencher os defeitos com os materiais confeccionados. Não houve diferença estatística significante (p>0,05) entre os grupos na neoformação óssea e os marcadores para remodelação óssea das reações de imunoistoquímica estiveram presentes em todos os grupos analisados. Apesar dos resultados promissores, novos estudos precisam ser realizados para comprovar a eficácia do hidrogel.

Resumo (inglês)

This study investigated the influence of drug delivery systems using hydrogels incorporated with bioactive glass particles functionalized with drugs on the regeneration of critical bone defects in the femurs of ovariectomized rats. The medications used to functionalize the bioactive glass particles were raloxifene and strontium ranelate. Initially, the synthesis and characterization of the bioactive glass were performed, followed by its functionalization with the drugs using the sonochemical route. Subsequently, hydrogels incorporated with the functionalized bioactive glass were produced using 3D printing techniques, and their characterization was conducted. For the in vitro cell viability test, eight Wistar rats were initially divided into two groups: SHAM—undergoing a sham surgery of bilateral ovariectomy, and OVX—undergoing bilateral ovariectomy. After 8 weeks, the rats were euthanized for the isolation of mesenchymal cells from the bone marrow of their femurs, which were then differentiated into osteoblasts. Cell plating was then performed to assess viability in the different hydrogels. Finally, an in vivo experiment was conducted in which young Wistar rats were again divided based on the SHAM and OVX surgeries and subsequently distributed into subgroups. Nine weeks after the surgeries, all animals underwent the creation of a critical bone defect in the distal epiphysis of the right femurs, which were filled with coagulum or 3D hydrogel samples measuring 3x3 mm from the following groups: pure hydrogel, hydrogel incorporated with bioactive glass particles, and hydrogel incorporated with bioactive glass particles functionalized with raloxifene or strontium ranelate. Euthanasia was performed four weeks after the surgical procedure, and the femurs were collected for micro-computed tomography analyses to evaluate the morphometry of the bone formed in the critical defect area, as well as histological, histomorphometric, and immunohistochemical evaluations to assess the quality and quantity of newly formed bone tissue in the defect area. Additionally, the presence of TRAP, osteocalcin, osteoprotegerin, and Rank-L markers was analyzed. Quantitative data were subjected to the Kolmogorov-Smirnov normality test to select the appropriate statistical test (two-way ANOVA for parametric data and Kruskal-Wallis for nonparametric data), with a significance level of 5%. The results showed that the technique was efficient in producing the different hydrogels, the hydrogels were not cytotoxic, and the defects could be filled with the manufactured hydrogels. No statistically significant difference was found in bone neoformation across the tested groups, and markers for bone remodeling from the immunohistochemical reactions were present in all analyzed groups. Despite the promising results, further studies are needed to confirm the material's efficacy

Palavras-chave

Drug delivery systems, Ovariectomia, Impressão tridimensional, Regeneração óssea, Sistemas de liberação de medicamentos, Ovariectomy, Printing, three-dimensional, Bone regeneration