Efeitos da melatonina sobre o metabolismo energético e estresse oxidativo em duas linhagens de células de câncer de ovário (SKOV-3 e CAISMOV-24)

Abstract

O câncer de ovário (CO) é a segunda neoplasia ginecológica que mais afeta as mulheres e, por possuir sintomas genéricos, tem altas taxas de recorrência e rápida progressão. A proliferação celular descontrolada representa uma das principais características da doença neoplásica e, para tal, as células tumorais ajustam o seu metabolismo energético para promover o rápido crescimento e divisão celular; esse padrão metabólico é muito diferente daquele encontrado nas células saudáveis. A melatonina (Mel), é um hormônio produzido e secretado pela glândula pineal no período do escuro e, mais recentemente sua produção tem sido evidenciada nas mitocôndrias das células. No CO a concentração de Mel está bastante reduzida. Experimentos envolvendo modelos animais e cultura celular de CO já documentaram as propriedades antitumorais da Mel. Portanto, o objetivo do presente estudo foi avaliar a ação da terapia com Mel sobre o metabolismo energético e estresse oxidativo em células de carcinoma ovariano humano, linhagem SKOV-3 e CAISMOV-24. Os experimentos envolveram grupos controle, tratamento com Mel nas concentrações de 3,4 µM para SKOV-3 e 7 µM para CAIMOV-24 com base no cálculo da IC50, tratamento com Luzindole na concentração de 10-6 M para ambas as linhagens e Mel. Foram realizados os ensaios de citotoxicidade celular por MTT, e de migração e invasão com insertos. Para verificação dos efeitos sobre o metabolismo energético celular foram quantificadas as atividades de glicose-6 fosfato desidrogenase (G6PDH), fosfofrutoquinase 1 (PFK-1), complexo piruvato desidrogenase (PDH), citrato sintase (CS) e lactato desidrogenase (LDH). Também foram quantificados os níveis das proteínas HIF-1α, G6PDH, GAPDH e PDH por Western blot. A concentração de lactato foi analisada, por espectrofotometria, bem como a da glutamina. Em uma segunda abordagem, as enzimas ligadas ao estresse oxidativo como superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GSH-Px), bem como as concentrações de glutationa reduzida (GSH) e oxidada (GSSG), foram investigadas por espectrofotometria. Também foram avaliados os perfis de moléculas de sinalização celular envolvidas com agressividade tumoral através de ensaio multiplex e os níveis de Mel através de ensaio ELISA. Houve uma diminuição significativa nos níveis de HIF-1α, G6PDH, GAPDH e PDH após o tratamento com Mel, mesmo na presença de luzindole em ambas as células de CO. O tratamento com Mel também reduziu a atividade das enzimas metabolicamente relevantes como PFK-1, G6PDH, LDH e citrato sintase, enquanto a atividade de PDH aumentou em ambas as células. Os níveis de lactato e glutamina foram significativamente reduzidos após o tratamento com Mel. A Mel promoveu ainda a redução nas concentrações de CREB, JNK, NF-kB, p-38, ERK1/2, AKT, p70S6K e STAT em ambas as linhagens celulares. Houve também uma redução nos potenciais de migração e invasão celular em ambas as linhagens. O tratamento com Mel atenuou a capacidade migratória e invasiva das células CO de maneira independente do receptor, ao mesmo tempo que estimulou sua síntese intracelular. Além disso, as defesas enzimáticas antioxidantes foram atenuadas pela Mel, especialmente nas células CAISMOV-24. Coletivamente, a Mel regula os processos relacionados ao metabolismo energético que são alterados nas células de CO, revertendo o metabolismo do tipo Warburg e, potencialmente, reduzindo a glutaminólise. Essa regulação contribui para atenuar várias moléculas oncogênicas associadas à progressão e invasão do CO.

Ovarian cancer (OC) is the second gynecological neoplasm that most affects women and, as it has generic symptoms, it has high recurrence rates and rapid progression. Uncontrolled cell proliferation represents one of the main characteristics of neoplastic disease and, to this end, tumor cells adjust their energy metabolism to promote rapid cell growth and division; This metabolic pattern is very different from that found in healthy cells. Melatonin (Mel) is a hormone produced and secreted by the pineal gland during the dark period and, more recently, its production has been demonstrated in the mitochondria of cells. In CO the concentration of Mel is greatly reduced. Experiments involving animal models and CO cell culture have already documented the antitumor properties of Mel. Therefore, the objective of the present study was to evaluate the action of Mel therapy on energy metabolism and oxidative stress in human ovarian carcinoma cells, lineage SKOV-3 and CAISMOV-24. The experiments involved control groups, treatment with Mel at concentrations of 3.4 µM for SKOV-3 and 7 µM for CAIMOV-24 based on IC50 calculation, and treatment with Luzindole at a concentration of 10-6 M for both strains and Mel. Cellular cytotoxicity assays using MTT, and migration and invasion assays with inserts were carried out. To verify the effects on cellular energy metabolism, the activities of glucose-6 phosphate dehydrogenase (G6PDH), phosphofructokinase 1 (PFK-1), pyruvate dehydrogenase complex (PDH), citrate synthase (CS), and lactate dehydrogenase (LDH) were quantified. The levels of HIF-1α, G6PDH, GAPDH, and PDH proteins were also quantified by Western blot. The concentration of lactate was analyzed by spectrophotometry, as well as that of glutamine. In a second approach, enzymes linked to oxidative stress such as superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), and glutathione peroxidase (GSH-Px), as well as the concentrations of reduced (GSH) and oxidized glutathione (GSSG), were investigated by spectrophotometry. The profiles of cell signaling molecules involved in tumor aggressiveness were also evaluated using a multiplex assay and Mel levels using an ELISA assay. There was a significant decrease in the levels of HIF-1α, G6PDH, GAPDH, and PDH after Mel treatment, even in the presence of luzindole in both CO cells. Mel treatment also reduced the activity of metabolically relevant enzymes such as PFK-1, G6PDH, LDH, and citrate synthase, while PDH activity increased in both cells. Lactate and glutamine levels were significantly reduced after Mel treatment. Mel also promoted a reduction in the concentrations of CREB, JNK, NF-kB, p-38, ERK1/2, AKT, p70S6K, and STAT in both cell lines. There was also a reduction in cell migration and invasion potentials in both lineages. Mel treatment attenuated the migratory and invasive capacity of OC cells in a receptor-independent manner, while also stimulating their intracellular synthesis. Furthermore, antioxidant enzymatic defenses were attenuated by Mel, especially in CAISMOV-24 cells. Collectively, Mel regulates processes related to energy metabolism that are altered in CO cells, reversing Warburg-type metabolism and potentially reducing glutaminolysis. This regulation contributes to attenuating several oncogenic molecules associated with OC progression and invasion.