Peptídeos antimicrobianos salivares endógenos: ação antifúngica contra Candida albicans e Candida auris

Abstract

Peptídeos antimicrobianos (AMPs) são sequências de aminoácidos que fazem parte da imunidade inata de organismos eucariontes, tendo ação contra diversos patógenos. Nesse contexto, os AMPs salivares endógenos humanos constituem uma fonte potencial para o desenvolvimento de antifúngicos. O objetivo desse trabalho foi analisar o efeito dos AMPs salivares histatina-5 (HST-5), catelicidina LL-37 (LL-37) e fragmento N-terminal da lactoferrina (hLF 1-11) contra Candida albicans e Candida auris (recentemente reclassificada como Candidozyma auris). Inicialmente, foram realizados estudos em culturas planctônicas de susceptibilidade antimicrobiana por testes de microdiluição em caldo para determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e concentração fungicida mínima (CFM) de cada AMP. Além disso, foi determinada a curva de morte das células fúngicas em função do tempo de tratamento (2 h, 8 h e 24 h), por meio da quantificação de unidades formadoras de colônia (UFC). Os efeitos dos AMPs também foram avaliados sobre a filamentação de Candida por ensaios de indução em soro fetal bovino e análises microscópicas. Por fim, foi realizado um estudo em biofilmes de C. albicans e C. auris, analisando-se o número de contagem de UFC, biomassa por coloração com cristal violeta e viabilidade celular em microscopia de fluorescência. Os dados foram submetidos a análise estatística utilizando o software GraphPad Prism 6, considerando nível de significância p < 0,05. Os resultados obtidos demonstraram que, entre os 3 AMPs testados, hLF 1-11 foi o que apresentou maior atividade antifúngica, com valores de CIM de 250 e 500 μM para C. albicans e C. auris, respectivamente, e valores de CFM de 500 e 1000 μM. O peptídeo hLF 1-11, também, levou a reduções significativas de UFC nos tempos de tratamento de 2, 8 e 24 h para a cepa de C. auris tratada com a CFM. Todos os peptídeos analisados demonstraram capacidade de inibir a formação de hifas por C. albicans, com destaque para LL-37 e hLF 1-11, que alcançaram completa inibição da filamentação. Baseado nesses resultados, hLF 1-11 foi selecionada para o estudo em biofilmes. O tratamento dos biofilmes em fase inicial com hLF 1-11 levou à inibição de C. albicans e C. auris, com redução da biomassa total e de células viáveis. Concluiu-se que entre os peptídeos testados, hLF 1-11 apresentou maior atividade antifúngica, sendo capaz de inibir culturas planctônicas, filamentação e biofilmes de C. albicans e C. auris.

Antimicrobial peptides (AMPs) are amino acid sequences that constitute part of the innate immunity of eukaryotic organisms, exhibiting activity against various pathogens. In this context, human endogenous salivary AMPs constitute a potential source for the development of antifungal agents. The objective of this study was to analyze the effect of the salivary AMPs histatin-5 (HST-5), cathelicidin LL-37 (LL-37), and the N-terminal lactoferrin fragment (hLF 1-11) against Candida albicans and Candida auris (recently reclassified as Candidozyma auris). Initially, studies were carried out in planktonic cultures of antimicrobial susceptibility by broth microdilution tests to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum fungicidal concentration (CFM) of each AMP. In addition, the death curve of fungal cells was determined as a function of treatment time (2 h, 8 h and 24 h), through the quantification of colony-forming units (CFU). The effects of AMPs were also evaluated on Candida filamentation by induction assays in fetal bovine serum and microscopic analyses. Finally, a study was carried out on biofilms of C. albicans and C. auris, analyzing the number of CFU count, biomass by violet crystal staining and cell viability under fluorescence microscopy. The data were submitted to statistical analysis using GraphPad Prism 6 software, considering a significance level of p < 0.05. The results obtained showed that, among the 3 AMPs tested, hLF 1-11 was the one that presented the highest antifungal activity, with MIC values of 250 and 500 μM for C. albicans and C. auris, respectively, and CFM values of 500 and 1000 μM. The hLF 1-11 peptide also led to significant CFU reduction at the 2, 8 and 24 h treatment times for the C. auris strain treated with CFM. All the peptides analyzed demonstrated the ability to inhibit the formation of hyphae by C. albicans, especially hLF 1-11 and LL-37, which achieved complete inhibition of filamentation. Based on these results, hLF 1-11 was selected for the biofilm study. The treatment of biofilms in the initial phase with hLF 1-11 led to the inhibition of C. albicans and C. auris, with a reduction in total biomass and viable cells. It was concluded that among the peptides tested, hLF 1-11 showed the highest antifungal activity, being able to inhibit planktonic cultures, filamentation and biofilms of C. albicans and C. auris.