Caracterização funcional e biofísica das proteínas RVB-1 e RVB-2 pertencentes a família AAA+ do fungo Neurospora crassa

Abstract

Trabalhos anteriores realizados pelo nosso grupo levaram à identificação da proteína RVB-1 de Neurospora crassa como capaz de se ligar a um fragmento de DNA contendo o motif STRE (Stress Responsive Element). Este elemento de DNA, em Saccharomyces cerevisiae, é descrito estar presente na região promotora de genes responsivos a estresse, incluindo o estresse térmico. Uma busca nos bancos de dados de proteínas mostrou que a RVB-1 apresenta homologia estrutural à proteína RuvBL1 de humanos. Além disso, esta proteína é descrita possuir uma proteína paráloga, RuvBL2 ou Rvb2 de humano e S. cerevisiae, respectivamente, cuja proteína ortóloga em N. crassa foi denominada RVB-2. As proteínas RuvBLs foram encontradas estarem associadas a vários processos celulares, muito provavelmente devido as suas capacidades de formar grandes complexos proteicos e possuírem atividade ATPásica. Neste trabalho, estas proteínas foram parcialmente caracterizadas do ponto de vista funcional, bioquímico e biofísico. Os resultados obtidos por microscopia de fluorescência mostraram que ambas apresentam localização nuclear quando o fungo foi exposto a estresse térmico. A análise da expressão da proteína RVB-V5 mostrou estar aumentada, nessa mesma condição ambiental, quando analisada por Western blot. As duas proteínas foram produzidas na forma recombinante em Escherichia coli, tanto isoladamente quanto juntas, e a análise da expressão mostrou alta estabilidade em solução quando ambas foram produzidas em uma mesma célula de bactéria. Ambas mostraram interagir in vitro por análise de pulldown e o complexo RVB-1/2 mostrou ser formado principalmente por α-hélices através de espectropolarimetria de dicroísmo circular. Análise em gel filtração analítica sugeriu que o complexo apresenta diferentes estruturas oligoméricas, quando analisado na ausência e na presença de ATP. O complexo apresentou atividade ATPásica in vitro, o que fortemente sugere que ambas pertencem à família AAA+. Resultados de retardamento em gel de agarose (EMSA), mostraram que tanto separadamente, como na forma de complexo, essas proteínas são capazes de se ligar a fragmentos de DNA dupla fita independentemente de ATP.

Previous work by our group identified the Neurospora crassa RVB - 1 protein as able of binding to a DNA fragment containing the Stress Responsive Element (STRE). In Saccharomyces cerevisiae, this element is present in the promoter region of genes responsive to stress, including heat stress. RVB - 1 shows structural homology to human RuvBL1 protein, and is described to have a paralog, the RuvBL2 or Rvb2 protein in human and S. cerevisiae , respect ively. The N. crassa orthologous protein was identified and named RVB - 2. The RuvBLs proteins have been found to be associated with diverse cellular processes, most likely due to their ability to form large protein complexes and to have ATPase activity. In this work, these proteins were functional, biochemical and biophysically characterized. The fluorescence microscopy results showed that both proteins present nuclear localization in the fungus exposed to heat stress. Analyses of protein expression by Weste rn blot showed an increased expression of the RVB - 1 - v5 protei n in this same condition . The two proteins were produced in Escherichia coli, and expression analyses showed higher stability in solution when both were produced together. Both proteins showed in vitro interaction by pulldown analysis. The RVB - 1/2 complex has the secondary structure mostly formed by α - helices as analysis by CD. The size - exclusion chromatography suggested that the complex present different oligomeric structures when analyzed in the absence and presence of ATP. They present in vitro ATPase activity, which strongly suggest that both belong to the AAA + family. Electrophoresis Mobility Shift Assay (EMSA) showed that both proteins are able to bind to dsDNA fragments, in an ATP - independently manner.