Análise da atividade antibacteriana da hemolinfa de Galleria mellonella a  partir da imunização com Staphylococcus aureus e Candida albicans

A resistência antimicrobiana, intensificada pelo uso indiscriminado de antibióticos e agravada durante a pandemia de COVID-19, tem favorecido a emergência de patógenos resistentes, como Staphylococcus aureus, uma bactéria coco Gram positiva associada a infecções nosocomiais e comunitárias e com elevada capacidade de adquirir mecanismos de resistência, tornando urgente o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Neste contexto, produtos naturais têm ganhado relevância como fontes de biomoléculas com atividade antimicrobiana, e o invertebrado Galleria mellonella destaca-se como uma fonte promissora de compostos naturais. Diante disso, este estudo investigou atividade antimicrobiana da hemolinfa de larvas de G. mellonella, sob diferentes imunizações, tempo pós-imunização (24, 48 e 72h) e processamento, sobre a formação de biofilmes de S. aureus. Para isso, foram avaliados quatro grupos experimentais 1) Controle de crescimento (CC); 2) IM Sa (imunizado com S. aureus); 3) IM Ca (imunizado com C albicans) e 4) Controle da hemolinfa (sem imunização). De cada grupo experimental, foram obtidas hemolinfas que passaram por três diferentes processamentos: a) Hemolinfa completa (HC); b) Hemolinfa livre de hemócitos (HL); c) Hemócitos isolados (HI). Sua atividade sobre a formação do biofilme foi avaliada pela contagem de unidades formadoras de colônias (UFC/mL); quantificação de biomassa total (cristal violeta); atividade metabólica (XTT) e quantificação de espécies reativas de oxigênio (ROS). Em todos os testes foi utilizado o programa GraphPad Prism 8.0, com nível de significância de 5%. A atividade antimicrobiana da hemolinfa e suas frações, foi independente do microrganismo imunizante, sendo seu efeito mais influenciado pelo tempo de pós imunização e processamento. No ensaio de UFC/mL, a fração HL de 48h de imunização apresentou a maior inibição, reduzindo 3,95 Log10. Já a HI exibiu efeitos expressivos em todos os tempos com reduções superiores a 6 Log10. A HC com 24h de imunização apresentou até 4,94 Log10. A análise por cristal violeta demonstrou redução significativa da biomassa do biofilme, em destaque as frações HL e HI, quando comparadas com o CC. A HC apresentou comportamento distinto em relação as demais frações, apresentando uma redução de menor magnitude. No ensaio de XTT, redução ambas as frações demonstraram atividade metabólica indetectável em todas as densidades avaliadas. Na quantificação de ROS, a HC e a fração HL apresentaram aumento progressivo na produção de ROS nos tempos de 18h e 24h. Diante do exposto, conclui-se que a imunização com diferentes microrganismos é capaz de induzir respostas imunes especificas e/ou cruzadas, e que a extensão da atividade antimicrobiana e antibiofilme da hemolinfa está diretamente associada ao pico e ao tipo da resposta imune larval. Desse modo, esses resultados reforçam o potencial desse modelo como fonte de biomoléculas naturais para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas frente à resistência antimicrobiana

Resumo (inglês)

Antimicrobial resistance, intensified by the indiscriminate use of antibiotics and aggravated during the COVID-19 pandemic, has favored the emergence of resistant pathogens, such as Staphylococcus aureus, a Gram-positive coccus bacterium associated with nosocomial and community infections and with a high capacity to acquire resistance mechanisms, making the development of new therapeutic strategies urgent. In this context, natural products have gained relevance as sources of biomolecules with antimicrobial activity, and the invertebrate Galleria mellonella stands out as a promising source of natural compounds. Therefore, this study investigated the antimicrobial activity of the hemolymph of G. mellonella larvae, under different immunizations, post-immunization time (24, 48 and 72h) and processing, on the formation of S. aureus biofilms. For this, four experimental groups were evaluated: 1) Growth control (CC); 2) IM Sa (immunized with S. aureus); 3) IM Ca (immunized with C albicans) and 4) Hemolymph control (no immunization). From each experimental group, hemolymphs were obtained and underwent three different processing: a) Complete hemolymph (CH); b) Hemocyte-free hemolymph (HF); c) Isolated hemocytes (IH). Its activity on biofilm formation was evaluated by counting colony-forming units (CFU/mL); quantification of total biomass (violet crystal); metabolic activity (XTT) and quantification of reactive oxygen species (ROS). In all tests, the GraphPad Prism 8.0 program was used, with a significance level of 5%. The antimicrobial activity of hemolymph and fractions was independent of the immunizing microorganism, and its effect was more influenced by the post-immunization time and processing. In the CFU/mL assay, the 48-hour HF immunization fraction showed the highest inhibition, reducing 3.95 Log10. IH, on the other hand, exhibited significant effects at all times with reductions greater than 6 Log10. The HC with 24 hours of immunization showed up to 4.94 Log10. The violet crystal analysis showed a significant reduction in the biomass of the biofilm, especially the HF and IH fractions, when compared to the CC. The CH showed a different behavior in relation to the other fractions, showing a reduction of lower magnitude. In the XTT assay, both fractions showed undetectable metabolic activity at all densities evaluated. In the quantification of ROS, the CH and the HF fraction showed a progressive increase in ROS production at 18h and 24h. In view of the above, it is concluded that immunization with different microorganisms is capable of inducing specific and/or cross-immune responses, and that the extent of antimicrobial and antibiofilm activity of hemolymph is directly associated with the peak and type of larval immune response. Thus, these results reinforce the potential of this model as a source of natural biomolecules for the development of new therapeutic approaches against antimicrobial resistance