Estudos funcionais e estruturais da proteína ortóloga a PinX1 e sua influência nos telômeros de Leishmania spp.

As leishmanioses são doenças negligenciadas causadas por parasitos do gênero Leishmania, que afetam milhões de pessoas em todo o mundo. A alta toxicidade e resistência aos tratamentos atuais tornam urgente a identificação de novos alvos terapêuticos. Os telômeros, estruturas nucleoproteicas essenciais para a estabilidade genômica, surgem como promissores candidatos. Em eucariotos superiores, a proteína PinX1 é um regulador negativo clássico da telomerase, inibindo sua atividade ao interagir com a subunidade catalítica TERT. No entanto, seu papel em tripanossomatídeos permanecia desconhecido. Nesta tese, realizamos a primeira caracterização funcional e estrutural do ortólogo de PinX1 em Leishmania spp. (LmPinX1). Utilizando uma abordagem multifacetada que combinou a superexpressão epissomal da proteína marcada com myc, a obtenção da proteína na forma recombinante, a análise de interatoma, a edição gênica por CRISPR-Cas9 em L. major, o sequenciamento de DNA de longa leitura (ONT), a análise da expressão relativa, os ensaios de proliferação e de ciclo celular, além da caracterização biofísica e bioquímica da proteína, demonstramos que a LmPinX1 é essencial e multifuncional. Semelhante a outros eucariotos, a LmPinX1 interage com proteínas envolvidas com maturação de RNA ribossomal e pequenos RNAs nucleolares, além de se associar a proteínas de ciclo celular e com os telômeros via a proteína TRF e o componente TERT da telomerase. A análise funcional demonstrou a impossibilidade de gerar um nocaute em ambos os alelos do gene, sugerindo que LmPinX1 é vital para o parasito. Linhagens heterozigóticas (LmPinX1⁺/⁻) exibiram fenótipos pleiotrópicos progressivos, incluindo crescimento e divisão celular comprometidos, acúmulo de células na fase S, diminuição da expressão de LSU rRNAS e encurtamento telomérico. O encurtamento progressivo dos telômeros em LmPinX1+/- ao longo das passagens sugere um papel semelhante ao de células tumorais com expressão diminuída de PinX1 e nucleofosmina (proteína envolvida com a biogênese de ribossomos), mas contrasta com leveduras, onde a ausência de PinX1 induz o alongamento dos telômeros. Quanto à diminuição da expressão dos fragmentos rRNA LSU-β e LSU-ε, este fenótipo conecta a LmPinX1 à biogênese de ribossomos, o que foi posteriormente confirmado pela presença de muitos componentes da maquinaria de montagem de ribossomos nos dados de interatoma. Estudos estruturais também revelaram particularidades sobre a LmPinX1. Sua estrutura tridimensional mostra que ela é intrinsecamente desordenada, apresenta tamanho menor do que seus ortólogos e substituições de resíduos de aminoácidos específicos do gênero. LmPinX1 é capaz de formar monômeros e dímeros, imunoprecipita com a proteína telomérica TRF e interage fisicamente com o domínio N-terminal do componente TERT da telomerase, conforme demonstrado por ensaios de pull-down, espectroscopia de fluorescência e docking molecular. Coletivamente, nossos resultados revelam que a PinX1 em Leishmania pode desempenhar um papel importante na homeostase celular, integrando a manutenção telomérica, o processamento de rRNA e a progressão do ciclo celular. Esta convergência funcional em relação a outros eucariotos destaca a PinX1 como um alvo promissor para o desenvolvimento de novas estratégias quimioterápicas contra as leishmanioses, embora ainda haja muito a ser descoberto sobre esta proteína, especialmente quanto ao seu papel na manutenção dos telômeros.

Resumo (inglês)

Leishmaniasis is a neglected disease caused by parasites of the genus Leishmania, affecting millions of people worldwide. The high toxicity and resistance to current treatments make the identification of new therapeutic targets urgent. Telomeres, nucleoprotein structures essential for genomic stability, emerge as promising candidates. In higher eukaryotes, the PinX1 protein is a classic negative regulator of telomerase, inhibiting its activity by interacting with the catalytic subunit TERT. However, its role in trypanosomatids remained unknown. In this thesis, we performed the first functional and structural characterization of the PinX1 ortholog in Leishmania spp. (LmPinX1). Using a multifaceted approach that combined episomal overexpression of the myc-tagged protein, recombinant protein production, interactome analysis, CRISPR-Cas9 gene editing in L. major, long-reading DNA sequencing (ONT) relative expression analysis, proliferation and cell cycle assays, and biophysical and biochemical characterization of the protein, we demonstrated that LmPinX1 is essential and multifunctional. Similar to other eukaryotes, LmPinX1 interacts with proteins involved in ribosomal RNA maturation and small nucleolar RNAs, in addition to associating with cell cycle proteins and telomeres via the TRF and the telomerase TERT component. Functional analysis demonstrated the impossibility of generating a knockout in both alleles of the gene, suggesting that LmPinX1 is vital for the parasite. Heterozygous lineages (LmPinX1+/-) exhibited progressive pleiotropic phenotypes, including impaired cell growth and division, cell accumulation in the S phase, decreased LSU rRNA expression, and telomere shortening. The progressive telomere shortening in LmPinX1+/- across passages suggests a role similar to that of tumor cells with decreased expression of both PinX1 and nucleophosmin (protein involved in ribosome biogenesis), but contrasts with yeast, where the absence of PinX1 induces telomere elongation. Regarding the decreased expression of LSU-β and LSUε rRNA fragments, this phenotype connects LmPinX1 to ribosome biogenesis, which was confirmed by the presence of many components of the ribosome assembly machinery in interactome data. Structural studies also revealed particularities about LmPinX1. Its three-dimensional structure shows that it is intrinsically disordered, smaller in size than its orthologs, and exhibits genus-specific amino acid residue substitutions. LmPinX1 is capable of forming monomers and dimers, immunoprecipitates with the telomeric protein TRF, and physically interacts with the N-terminal domain of the telomerase TERT component, as demonstrated by pull-down assays, fluorescence spectroscopy, and molecular docking. Collectively, our results reveal that PinX1 in Leishmania may play an important role in cellular homeostasis, integrating telomeric maintenance, rRNA processing, and cell cycle progression. This functional convergence with respect to other eukaryotes highlights PinX1 as a promising target for the development of new chemotherapeutic strategies against leishmaniasis, although much remains to be discovered about this protein, particularly regarding its role in telomere maintenance.

Palavras-chave

Leishmania , Telomerase , PinX1 , Telômero

Idioma

Português

Citação

PAIVA, Stephany Cacete de. Estudos funcionais e estruturais da proteína ortóloga a PinX1 e sua influência nos telômeros de Leishmania spp.. 2026. Tese (Doutorado em Genética) - Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Botucatu, 2026.