Envolvimento do inflamassoma na imunidade inata e adaptativa em gestantes portadoras de pré-eclâmpsia

Introdução: A pré-eclampsia (PE) destaca-se como uma das principais causas de morbidade e mortalidade tanto materna como fetal, se caracteriza por ativação anormal do sistema imune inato e adaptativo. No plasma de gestantes portadoras de PE encontram-se níveis elevados de estruturas moleculares associadas ao estresse e morte celular, denominados padrões moleculares associados ao dano (DAMPs) como, proteína de choque térmico (Hsp70), HMGB1 (high mobility group box 1), Hialurona (HA) e Ácido Úrico, que parecem contribuir diretamente com a patogênese dessa doença. Essas DAMPs ligam-se a receptores presentes em células da imunidade inata, podendo ativar um complexo intracelular denominado inflamassoma, responsável pelo processamento e liberação de IL-1β e IL-18. Essas citocinas são potentes mediadores inflamatórios e importantes na ativação da resposta imune adaptativa, auxiliando a diferenciação de células T em Th17 e Th1, respectivamente. Na PE, a ocorrência de resposta inflamatória sistêmica parece decorrer da deficiência no controle de células T efetoras por células T reguladoras (Treg). Portanto, o balanço entre células Treg e Th17 pode ser crítico para a tolerância ao feto e para a prevenção da doença. Objetivos: O presente trabalho teve como objetivos: Avaliar o estado de ativação, endógena e induzida pelas DAMPs (urato monossódico (MSU), HA e Hsp70), em monócitos, pela identificação da presença do inflamassoma e associação com a produção de citocinas; Avaliar o envolvimento das subpopulações de células T (Th1, Th2, Treg e Th17) pela análise dos fatores de transcrição e pelo padrão de citocinas produzidas por essas células estimuladas com as DAMPs (MSU, HA e Hsp70). Métodos e Resultados: Foram estudadas 20 gestantes portadoras de PE, 20 gestantes normotensas (GN) e 20 mulheres saudáveis não grávidas (MNG). O plasma foi separado e armazenado à -80°C para dosagem das DAMPs (ácido úrico, HA, HMGB1 e Hsp70). Monócitos de sangue periférico foram incubados na presença ou ausência das DAMPs (MSU, HA e Hsp70). O sobrenadante obtido após 18h de cultivo foi aspirado e empregado para dosagem das citocinas TNF-α, IL-1β e IL-18 por ELISA. A presença de inflamassoma nessas células foi avaliada pela quantificação de RNAm de NLRP1, NLRP3, caspase-1, IL-1β, IL-18, TNF-α e HMGB1 por RT-qPCR após 4h de cultura. Os resultados mostraram concentração plasmática elevada de MSU, HA, Hsp70 e HMGB1 e expressão gênica endógena de NLRP1, NLRP3, caspase-1, IL-1β, TNF-α e HMGB1 significativamente maior em gestantes com PE em comparação aos grupos GN e MNG. Em relação à produção endógena de citocinas, IL-1β foi maior no grupo PE em relação aos grupos GN e MNG, enquanto IL-18 e TNF-α estão aumentadas apenas no grupo PE comparado ao grupo GN. O estímulo de monócitos de gestantes pré-eclâmpticas e de mulheres não grávidas com MSU induziu aumento na expressão gênica de NLRP3, caspase-1 e TNF-α em relação à expressão endógena nesses grupos, enquanto esse efeito não foi observado em gestantes normotensas. Quando os monócitos foram estimulados com HA observou-se aumento da expressão de RNAm de NLRP1, NLRP3, caspase-1, IL-1β, TNF-α e HMGB1, enquanto Hsp70 estimulou apenas a expressão de RNAm de TNF-α. A análise das citocinas por ELISA mostrou que monócitos de gestantes com PE produziram níveis endógenos e estimulados com MSU mais elevados de IL-1β, IL-18 e TNF-α em comparação ao grupo GN. Todos os grupos apresentaram aumento de IL-1β após estímulo com HA e aumento de IL-1β e TNF-α quando estimulados com Hsp70. Para estudo das subpopulações de células T as células mononucleares do sangue periférico foram avaliadas pela expressão endógena dos fatores de transcrição para células T-bet (Th1), GATA3 (Th2), RORc (Th17) e Foxp3 (Treg) por citometria de fluxo. Essas células foram cultivadas na ausência ou presença das DAMPs e o sobrenadante foi empregado para determinação das citocinas de perfil Th1 (IFN-γ e TNF-β), Th2 (IL-4), Treg (IL-10 e TGF-β1) e Th17 (IL-17 e IL-22) por ELISA. Os resultados mostraram polarização para perfis inflamatórios Th1/Th17 e diminuição de perfis anti-inflamatórios Th2/Treg em gestantes portadoras de PE associados a níveis endógenos elevados das citocinas inflamatórias TNF-α, IFN-γ, IL-17 e diminuídos de TGF-β e IL-10 quando comparadas com gestantes normotensas. O estímulo das células com MSU induziu aumento de IFN-γ, IL-22 em todos os grupos estudados, enquanto os estímulos com MSU e HA induziram aumento de IL-17 somente no grupo de normotensas. As DAMPs MSU e Hsp70 induziram aumento significativo da produção de TNF-α nos grupos de PE e MNG. Níveis elevados de TGF-β1 foram produzidos por células de gestantes portadoras de PE estimuladas com MSU, HA e Hsp70, enquanto HA e Hsp70 induziram diminuição da produção dessa citocina em gestantes normotensas. Conclusões: A maior expressão gênica endógena de NLRP1, NLRP3, caspase-1, IL-1β, HMGB1 e TNF-α em monócitos de gestantes pré-eclâmpticas confirma o estado de ativação dessas células na PE. Assim como a ativação endógena para perfil Th1/Th17 e expressão elevada de citocinas inflamatórias em gestantes pré-eclampticas demonstra o desbalanço inflamatório presente nessas gestantes. As DAMPs foram capazes de estimular tanto a resposta imune inata como a adaptativa em gestantes pré-eclâmpticas sugerindo que essas alarminas desempenham papel na ativação do sistema imune e na liberação de citocinas inflamatórias participando na patogênese dessa importante síndrome da gestação.

Palavras-chave

DAMPs Pré-eclâmpsia Citocinas Monócitos Subpopulações de células T

Idioma

Português

URI

http://hdl.handle.net/11449/149777

Financiadores

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Coleções

Botucatu - IBB - Instituto de Biociências

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Efeito da vitamina D sobre diferenciação de linfócitos T reguladores induzida por interação entre receptor TNFR2 e TNF de membrana presente em monócitos M2 de gestantes portadoras de pré-eclâmpsia

(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2025-08-26)

Veiga, Mariana Romão

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Peracoli, Maria Terezinha Serrao

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Universidade Estadual Paulista (Unesp)

Introdução: A pré-eclâmpsia (PE) é uma síndrome específica da gravidez caracterizada por ativação de monócitos com perfil inflamatório (M1) em detrimento do perfil anti-inflamatório M2, resultando em níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias, como o fator de necrose tumoral (TNF-α). O TNF-α é produzido como uma proteína de transmembrana (mTNF-α) que pode ser proteoliticamente clivada pela enzima conversora de TNF (TACE) dando origem ao TNF solúvel (TNF-α). A ligação de TNF-α com os receptores TNFR1 e TNFR2 na superfície celular ativa diferentes vias de sinalização. TNFR1 pode ser ativado por ligação com ambos mTNF-α e TNF-α, enquanto TNFR2 é principalmente ativado por mTNF-α. O TNFR2 é predominantemente expresso por células T reguladoras CD4+/FoxP3+ e, a co-expressão de CD25 com TNFR2 identifica células com maior capacidade supressora. Em vista disso, o uso de moduladores da resposta inflamatória como a vitamina D, no tratamento de células de gestantes com PE pode ser importante para melhorar a resposta inflamatória através da ativação de células com perfil M2 e Treg, capazes de modular e suprimir a inflamação presente nessa síndrome da gestação. Objetivo: O presente projeto tem como objetivo avaliar se o tratamento com vitamina D aumenta a expressão de monócitos M2 em gestantes portadoras de PE e, consequentemente, induz aumento de linfócitos Treg por essas gestantes. Sujeitos e Métodos: O sangue periférico de 10 gestantes portadoras de PE e 10 mulheres saudáveis, não-grávidas (NP) foi obtido e as células mononucleares (PBMCs) foram cultivadas na presença ou ausência de vitamina D por 24h, sendo a expressão por monócitos dos receptores CD14, CD163, CD206, TNFR2 e de mTNF-α e a expressão de linfócitos T reguladores CD4, CD25, TNFR2 e FoxP3 determinada por citometria de fluxo. Os resultados foram analisados por testes não paramétricos com nível de significância de 5%. Resultados: Monócitos e linfócitos cultivados juntos na presença ou ausência de VD apresentaram diferença significativa em relação a mulheres NP para os parâmetros, mTNF-α, CD163, FoxP3 e FoxP3+TNFR2. Além disso, o tratamento com VD aumentou a percentagem de linfócitos expressando FoxP3 e FoxP3+TNFR2. Conclusão: Os resultados preliminares indicam que a VD tem potencial de melhorar a resposta inflamatória em gestantes pré-eclâmpticas através do aumento da expressão de células com perfil anti-inflamatório, sendo elas, tanto monócitos M2 como linfócitos Treg. Sendo assim, o uso da vitamina D, poderá induzir a modulação da resposta inflamatória observada na PE, e possivelmente, poderá, futuramente, ser associada ao tratamento dessa importante síndrome da gestação.