Modo de ação das proteínas de Bacillus thuringiensis e de Pseudomonas spp. em Anthonomus grandis (Coleoptera: curculionidae)

Abstract

Os ataques de insetos-praga têm aumentado a preocupação com os impactos causados na produção agrícola, uma vez que, quando não controlados, acarretam enormes prejuízos econômicos. A produtividade da cultura do algodoeiro é afetada, em sua grande parte, pelo ataque de sua principal praga, o Anthonomus grandis. Estratégias biotecnológicas vêm sendo desenvolvidas para auxiliar no controle de insetos-praga das grandes culturas, com destaque para as proteínas inseticidas produzidas pela bactéria Bacillus thuringiensis (Bt). Porém, a evolução da resistência das pragas é a principal ameaça a longo prazo da tecnologia Bt, o que compromete a eficiência do controle biológico por estas bactérias. Dessa forma, é importante buscar novos genes, com diferentes modos de ação, os quais, sendo expressos simultaneamente por meio da engenharia genética, podem potencializar a atividade inseticida e retardar ou impedir o surgimento de populações de pragas-alvo resistentes à ação das proteínas quando utilizadas isoladamente. Neste contexto, o presente projeto teve como objetivo estudar o modo de ação das proteínas Cry1Ia10, Cry3Aa e Cry8B de B. thuringiensis e das proteínas IPD072Aa e PIP-47Aa isoladas de Pseudomonas spp., identificando prováveis receptores de A. grandis para essas toxinas, a fim de indicar as melhores combinações para a produção de plantas geneticamente modificadas com piramidação de genes visando o manejo da resistência do referido inseto-praga. Para tanto, as proteínas recombinantes foram expressas em Escherichia coli, purificadas e ativadas com tripsina (no caso das proteínas Cry). As vesículas de membrana da borda em escova (BBMVs) do epitélio intestinal de larvas de A. grandis foram extraídas e quantificadas, e as toxinas IPD072Aa, PIP-47Aa e Cry1Ia10 foram eficientemente marcadas com biotina para os ensaios de ligação. Os ensaios de competição homóloga confirmaram que as três proteínas biotiniladas interagem com sítios de ligação específicos e saturáveis nas BBMVs, uma vez que o excesso dos competidores não marcados suprimiu a marcação de maneira dose-dependente. Nos ensaios de competição heteróloga para a toxina Cry1Ia10, observou-se que a adição de excesso de IPD072Aa, PIP-47Aa ou Cry3Aa não interferiu na ligação da Cry1Ia10 às BBMVs, indicando que essas toxinas não compartilham os mesmos receptores. Em contraste, a incubação com excesso de Cry8B não marcada promoveu o completo desaparecimento da banda da Cry1Ia10 biotinilada, evidenciando uma forte competição heteróloga entre essas duas proteínas. Esses resultados podem ser aplicados para orientar programas de melhoramento genético e a produção de cultivares de algodão com maior durabilidade da tecnologia, contribuindo significativamente para o manejo sustentável de A. grandis na agropecuária brasileira.