Desenvolvimento de biossensores para o diagnóstico do vírus sars-cov-2
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Data
2022-11-29
Autores
Brenner, Gabriel
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Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Resumo
O diagnóstico preciso de COVID-19 é feito hoje, principalmente, por técnica de RT-PCR, que demanda equipamentos laboratoriais e mão de obra especializada para a realização do teste, o que encarece o diagnóstico e, principalmente, torna o processo moroso. Além disso, essa dependência de estrutura laboratorial torna o diagnóstico inviável em regiões remotas do Brasil, outra opção é a utilização de testes de antígeno, que são mais rápidos e baratos, porém possuem uma menor eficácia pois eles não conseguem detectar os anticorpos antes do sétimo dia de infecção. Como contrapartida ao teste utilizando a reação de PCR, o desenvolvimento de um riboregulador do tipo toehold switch se torna uma alternativa interessante devido ao seu baixo custo, fácil manuseio e alta sensibilidade e especificidade. Este projeto propõe o desenvolvimento de biossensores do tipo para a identificação rápida de RNA viral de Sars-Cov-2. Para tanto, foi construído um dispositivo de RNA regulatório capaz de ativar a expressão de um gene repórter a partir da identificação do RNA viral. Os toehold switch construídos à partir das sequências de RNA viral do SARS-CoV-2 foram clonados em um plasmídeo contendo o gene repórter Epic Luciferase através da técnica de digestão e ligação e testados em reações de tradução e transcrição cell free, obtendo resultados promissores onde o switch 8a apresentou um aumento de expressão de 3 vezes quando comparado o trigger específico com os controles. Os resultados obtidos mostram que a utilização de riboreguladores do tipo toehold switch para detecção do vírus SARS-CoV-2 é promissora.
The precise diagnosis of COVID-19 is made today, mainly, by the RT-PCR technique, which requires laboratory equipment and specialized labor to carry out the test, which makes the diagnosis more expensive and, above all, makes the process time-consuming. In addition, this dependence on laboratory structure makes the diagnosis unfeasible in remote regions of Brazil, another option is the use of antigen tests like lateral flow immunotherapy tests, which are faster and cheaper, but are less effective because they cannot detect antibodies before the seventh day of infection.. As a counterpart to the test using the PCR reaction, the development of a toehold switch riboregulator becomes an interesting alternative due to its low cost, easy handling and high sensitivity and specificity. This project proposes the development of biosensors of this type for the rapid identification of Sars-Cov-2 viral RNA. To this end, a regulatory RNA device capable of activating the expression of a reporter gene was built from the identification of viral RNA. The toehold switches constructed from the SARS-CoV-2 viral RNA sequences were cloned into a plasmid containing the Epic Luciferase reporter gene through the digestion and ligation technique and tested in cell free translation and transcription reactions, obtaining promising results where switch 8a showed a 3-fold increase in expression when comparing the specific trigger with controls. The results obtained show that the use of toehold switch riboregulators for the detection of the SARS-CoV-2 virus is promising.
The precise diagnosis of COVID-19 is made today, mainly, by the RT-PCR technique, which requires laboratory equipment and specialized labor to carry out the test, which makes the diagnosis more expensive and, above all, makes the process time-consuming. In addition, this dependence on laboratory structure makes the diagnosis unfeasible in remote regions of Brazil, another option is the use of antigen tests like lateral flow immunotherapy tests, which are faster and cheaper, but are less effective because they cannot detect antibodies before the seventh day of infection.. As a counterpart to the test using the PCR reaction, the development of a toehold switch riboregulator becomes an interesting alternative due to its low cost, easy handling and high sensitivity and specificity. This project proposes the development of biosensors of this type for the rapid identification of Sars-Cov-2 viral RNA. To this end, a regulatory RNA device capable of activating the expression of a reporter gene was built from the identification of viral RNA. The toehold switches constructed from the SARS-CoV-2 viral RNA sequences were cloned into a plasmid containing the Epic Luciferase reporter gene through the digestion and ligation technique and tested in cell free translation and transcription reactions, obtaining promising results where switch 8a showed a 3-fold increase in expression when comparing the specific trigger with controls. The results obtained show that the use of toehold switch riboregulators for the detection of the SARS-CoV-2 virus is promising.
Descrição
Palavras-chave
Biologia sintética, Diagnóstico viral, Circuito genético, Riboreguladores tipo Toehold, Expressão gênica in vitro