Teses - Microbiologia Agropecuária - FCAV

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Tratamento anaeróbio e aeróbio de águas residuárias da bovinocultura leiteira em reatores de alta taxa
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-07-21) Sampaio, Renata Rodrigues; Oliveira, Roberto Alves de; Rodrigues, Luciano dos Santos; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Os dejetos da bovinocultura leiteira em confinamento são um desafio para os produtores, devido ao seu alto conteúdo orgânico. O tratamento desse resíduo pode gerar subprodutos benéficos ambientalmente e financeiramente. Entretanto, a heterogeneidade do dejeto pode ser um obstáculo para o seu aproveitamento e destinação adequada. Neste trabalho, avaliou-se o desempenho do tratamento de águas residuárias da bovinocultura leiteira, em reator anaeróbio de manta de lodo (UASB) seguido de filtro anaeróbio e o pós-tratamento aeróbio em reator operado em batelada sequencial (RBS) e filtro biológico percolador seguido de decantador (FBP), operados com altas cargas orgânicas volumétricas (COV) e diferentes tempos de detenção hidráulica (TDH). Os valores de TDH aplicados no reator UASB (R1) foram 60, 48, 36, 36, 30 e 30 h (fases 1 a 6). As COV aplicadas no R1 variaram de 4,8 a 12,6 g de DQO total (L d) -1 . Análises quantitativas de PCR em tempo real e sequenciamento de nova geração MiSeq (Illumina) foram realizadas para a identificação da comunidade microbiana. Os valores de pH permaneceram próximos a neutralidade, a alcalinidade foi crescente e os ácidos voláteis foram decrescentes do afluente para os efluentes dos reatores anaeróbios durante as fases 1 a 6, resultados que indicaram estabilidade do sistema de tratamento. Com o pós-tratamento no RBS, as eficiências médias de remoção de DQO e NK foram de 94 e 80% e no FBP, com taxas de aplicação superficial de 2,11 e 2,53 m 3 (m2 d)-1 , as eficiências médias de remoção de P-total e coliformes aumentaram para 81 e 99,94%, respectivamente. Os macro e micronutrientes disponíveis no efluente do RBS e FBP podem ser investigados para futura utilização na fertirrigação. A máxima produção volumétrica de metano observada no R1 foi de 0,27 m3 CH4 (m3 reator d)-1 , com TDH de 36 h e com eficiências de remoção de DQO de até 95%. Proteobacteria, Baceroidota e Firmicutes como os filos mais abundantes no R1 e R2 respectivamente. Em menor proporção, foram encontrados os filos Bacteroidetes, Cloacimonetes, Spirochaetes, Chloroflexi, Aminicenantes e Candidates hydrogenedentes. O gênero Acinetobacter foi o mais expressivo dentro do filo Proteobacteria e pode estar relacionado com a alta remoção de fósforo no reator UASB. As análises quantitativas de PCR em tempo real demonstraram equilíbrio e sintrofia da comunidade microbiana durante a digestão anaeróbia e retratou a ocorrência da metanogênese pelas vias hidrogenotrófica e acetotróficas.
Avaliação do potencial de inibição do desenvolvimento vegetal causado pela auxina produzida por consórcios bacterianos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-03-13) Lobo, Laiana Lana Bentes [UNESP]; Rigobelo, Everlon Cid [UNESP]; Carvalho, Rogério Falleiros [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
RESUMO - As bactérias promotoras de crescimento de plantas (BPCP) possuem diversas habilidades diretas e indiretas para garantir o desenvolvimento e crescimento vegetal. Sendo a síntese de auxinas, principalmente o ácido 3-indol-acético (AIA), uma das habilidades diretas mais importantes. Bacillus spp. e Azospirillum brasilense são BPCP amplamente utilizadas na agricultura como bioinoculantes e relatadas como sintetizadoras de AIA. Entretanto, pouco se sabe se a inoculação consorciada (co-inoculação) destas bactérias pode reduzir o desenvolvimento vegetal devido ao excesso de AIA sintetizado. Sabendo-se que altas doses de AIA na planta pode ser limitante para o seu crescimento. Por outro lado, diante da necessidade de um sistema agrícola mais sustentável é inegável a importância da utilização de bioinoculades a base de BPCP. Sendo assim, estudos com o intuito de elucidar a interação dessas bactérias com a planta, baseados nas suas características e formas de uso, são muito importantes. No caso de hormônios vegetais, plantas modelos tem sido utilizadas em estudos que avaliam a resposta vegetal nesse sentido. No presente estudo, o tomateiro Micro-Tom (MT) e seus mutantes diageotropica (dgt) e entire, com alterações de baixa e alta sensibilidade para auxina respectivamente, foram utilizados para verificar se a co-inoculação de bactérias sintetizadoras de AIA pode ou não prejucar o desenvolvimento vegetal. Para isso, foram realizados dois experimentos, capítulos dois e três, nesta tese. No primeiro foram utilizados tratamentos com inoculações indivuais e conjuntas de B. velezensis (BV), B. pumillus (BP) e A. brasilense (AZ) em cada genótipo de tomateiro. Houve aumento para massa seca de raiz com o tratamento BV+BP+AZ em MT, para massa seca de parte aérea em dgt com BV. Não houve aumento para nenhum parâmetro avaliado em entire. A co-inoculação de BP+AZ diminuíram os valores para os parâmetros massa seca de parte aérea, massa seca de raiz e área foliar para dgt e entire. A co-inoculação de BP+AZ prejudicou os parâmetros analisados em dgt e entire ambos divergentes quanto a sensibilidade ao AIA. A co-inoculação de BV+BP+AZ que teoricamente proporcionou a maior concentração de AIA promoveu um aumento de MSR em MT. No segundo experimento foram utilizados tratamentos com inoculações indivuais e conjuntas de B. subtilis (BS), A. brasilense selvagem (Azw) e A. brazilense mutante (Azm). Os resultados mostram que o parâmetro vegetal mais sensível à inoculação microbiana é o número de raízes. Nenhum tratamento aumentou os parâmetros massa seca de parte aérea para MT e dgt, massa seca de raiz para o MT, altura da planta em MT e entire, área e volume radicular em dgt. O tratamento Azm reduziu a altura da planta para dgt, os tratamentos BS+Azw e BS+Azm reduziram no genótipo MT e o tratamento Azw+Azm reduziu em dgt o diâmetro da planta, os tratamentos BS e BS+Azw reduziram o número de raízes no MT. Conclui-se que a co-inoculação de Bacillus e A. brasilense pode reduzir alguns parâmetros de desenvolvimento vegetal, entretanto, esse efeito não está relacionado a quantidade de AIA sintetizado pelas bactérias.
Caracterização morfológica, bioquímica, molecular e fenotípica de isolados de BARTONELLA spp. de Roedores e marsupiais no pantanal brasileiro, com descrição de BARTONELLA MARCHADOAE sp. nov e BARTONELLA HARRUSI sp. nov.
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-05-27) Amaral, Renan Bressianini do [UNESP]; André, Marcos Rogério [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O gênero Bartonella compreende alphaproteobactérias Gram-negativas intracelulares facultativas e fastidiosas capazes de infectar uma grande variedade de mamíferos e transmitidas por artrópodes vetores. Embora roedores representem importantes reservatórios de Bartonella ao redor do mundo, poucos são os estudos acerca da caracterização genômica de espécies de Bartonella comumente encontradas neste táxon. Por outro lado, Bartonella spp. foi detectada em marsupiais e/ou ectoparasitas associados somente na Austrália e Estados Unidos. O presente estudo teve como objetivo caracterizar molecular, morfológica, bioquímica e fenotipicamente espécies de Bartonella isoladas de amostras de sangue de roedores e marsupiais de vida livre amostrados no Pantanal brasileiro, a maior área úmida da América do Sul. Para tanto, foram capturados 61 animais (59 roedores e 2 marsupiais) em dezembro de 2018 e 76 (70 roedores e 6 marsupiais) em fevereiro de 2019, totalizando 137 pequenos mamíferos amostrados, dos quais 129 (94,4 %) roedores e oito (5,6%) marsupiais. Dentre os 129 roedores amostrados, 79 (61,2%) animais pertenciam à espécie Thrichomys fosteri, quatro (3,1%) à espécie Clyomys laticeps, e 46 (35,7%) à espécie Oecomys mamorae. Dentre os oito marsupiais capturados, 5 (62,5%) pertenciam à espécie Thylamys macrurus e 3 (37,5%) à espécie Monodelphis domestica. Todas as amostras biológicas foram submetidas à qPCR para Bartonella spp. baseada no gene nuoG, cultura líquida de pré-enriquecimento e cultura sólida em ágar chocolate. Bartonella spp. foi detectada em 24% dos roedores amostrados e em quatro dos oito marsupiais amostrados. Uma cepa isolada de amostra de sangue de T. fosteri e uma cepa isolada de amostra de sangue de T. macrurus que se mostraram intimamente relacionadas ao complexo Bartonella vinsonii por meio de análises filogenéticas (Máxima Verossimilhança) e de distância (SplitsTree) baseadas em diversos marcadores moleculares, foram selecionadas para sequenciamento do genoma completo, utilizando para tal abordagem híbrida em plataformas de sequenciamento Illumina NovaSeq e Nanopore. As cepas isoladas de T. fosteri (strain 56A) e T. macrurus (117A) exibiram um genoma circular de 2,7 Mbp e 2,35 Mbp, com um conteúdo C + G médio de 39% e 38,8%, e codificação de 2.239 e 2.013 genes, respectivamente. Além disso, exibiram uma identidade nucleotídica média (ANI) de 85% com espécies de Bartonella do grupo vinsonii e de 91% entre si. Análise filogenômica baseada em 291 genes codificantes para proteínas e compartilhados entre genomas de 53 espécies de Bartonella, posicionou ambas as cepas em um clado intimamente relacionado a Bartonella vinsonii subsp. vinsonii, B. vinsonii subsp. berkhoffii e B. vinsonii subsp. arupensis, com alto valor de suporte de clado, apoiando a separação destas cepas em duas espécies diferentes, agora formalmente denominadas Bartonella machadoae nov. sp. (isolada de T. fosteri) e Bartonella harrusi nov. sp. (isolada de T. macrurus). Bartonella machadoae sp. nov. e Bartonella harrusi sp. nov. foram caracterizadas como pequenos bastonetes capnofílicos, microaerofílicos e aeróbios com ausência de pili e flagelos. Em conclusão, descrevemos as características bioquímicas, morfológicas, fenotípicas e genômicas de Bartonella machadoae, uma nova espécie isolada de amostras de sangue de roedor da espécie T. fosteri, e de Bartonella harrusi, uma nova espécie isolada de amostras de sangue de marsupiais da espécie T. macrurus, no Pantanal brasileiro.
Codigestão anaeróbia de vinhaça e lodo de decantador de ETA aumenta a estabilidade de reatores UASB e a produção de metano.
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-07-07) Lima, Vívian de Oliveira; Oliveira, Roberto Alves de; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O Brasil é o a maior produtor de etanol de cana-de-açúcar do mundo, e está entre os maiores geradores de vinhaça. Apesar de comumente utilizada em processos de fertirrigação, a aplicação da vinhaça na digestão anaeróbia é capaz de fornecer bioenergia com a utilização do biogás. Entretanto, ainda são necessários estudos buscando o aumento da estabilidade e da eficiência de produção de metano. Para isso, estratégias de operação, como a codigestão e a adição de micronutrientes, especialmente o ferro, tornam-se interessantes. Neste trabalho foi avaliado o desempenho de dois sistemas de tratamento, compostos por reatores UASB em dois estágios, operados em condições de temperatura mesofílica (R1M e R2M) e termofílica (R1T e R2T), na digestão anaeróbia da vinhaça. Os reatores foram operados com cargas orgânicas volumétricas (COV) crescentes de até 23,0 g DQOtotal L-1 d-1 (R1M) e 22,0 g DQOtotal L-1 d-1 (R1T), e aplicação da recirculação do efluente para aproveitamento de alcalinidade e nutrientes. Em seguida, foi realizada a codigestão de lodo de ETA e vinhaça nas proporções de 25:75, 35:65 e 50:50 (v/v) em ambos os sistemas. A digestão anaeróbia da vinhaça com aplicação de 20,0 g DQOtotal L-1 d-1 promoveu desestabilização dos reatores mesofílicos e termofílicos. A codigestão da vinhaça com 35 % e 50% de lodo de ETA, com COV próxima a 20,0 g DQOtotal L-1 d-1, observou-se a recuperação dos reatores UASB mesofílico e termofílico com redução significativa dos ácidos voláteis totais (AVT), aumento da alcalinidade e da produção de biogás. A maior produção volumétrica de metano (PVM) foi obtida na codigestão de vinhaça e lodo de ETA na proporção 50:50 (v/v), com concentrações médias de Fe de 424,0 mg L-1 e 211,0 mg L-1 nos afluentes do R1M e R1T, respectivamente. Após a codigestão, o R1M aumentou de 0,57 para 3,23 m3 CH4 m-3d-1 com COV média de 22 g DQOtotal L-1 d-1, e o R1T aumentou de 1,10 m3 CH4 m-3d-1 com COV de 16,4 g DQOtotal L-1 d-1 para 3,0 m3 CH4 m-3d-1 com COV de 20,0 g DQOtotal L-1 d-1. Na digestão anaeróbia da vinhaça, o sistema termofílico apresentou maior PVM em relação ao mesofílico, para COV de até 15,0 g DQOtotal L-1d-1. Para a aplicação de cargas orgânicas mais elevadas, o sistema mesofilico demonstra maior capacidade de suporte e estabilidade. A codigestão com lodo de ETA de 35% e 50% promove benefícios similares nos dois sistemas, não havendo diferenças significativas na eficiência de remoção de DQOtotal no R1M e R1T e na PVM total (R1 + R2). Portanto, a adição de ferro por meio do lodo de ETA em codigestão anaeróbia com a vinhaça melhora a estabilidade dos reatores UASB em condições mesofílica e termofílica e aumenta a produção de metano.
Digestão anaeróbia da vinhaça em reatores horizontais de alta taxa: desempenho do processo e composição da microbiota
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-01-27) Sousa, Stella Rubim de; Oliveira, Roberto Alves de; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A recuperação de recursos tem sido extremamente abordada nos tempos atuais, trazendo uma nova consciência coletiva dos aspectos ambientais, sociais e governamentais (ESG). A produção de biogás a partir da vinhaça de cana-de-açúcar possui um grande potencial para as questões supracitadas para o setor sucroenergético. O emprego de reatores anaeróbios horizontais de leito fixo (RAHLF) para a digestão anaeróbia e produção de biogás a partir de resíduos apresenta grandes vantagens em virtude a sua robustez, facilidade construtiva, operacional e econômica. No entanto, esta conformação de sistema para a biodigestão da vinhaça ainda foi pouco estudada. Neste estudo foi avaliado o efeito do aumento progressivo da carga orgânica volumétrica (COV) sobre o desempenho do sistema RAHLF e sobre a microbiota presente no lodo, durante três períodos de safra da cana consecutivos (810 dias). O experimento foi dividido em fase de partida e fases de 1 a 9, sendo a última fase distinguida pela combinação da digestão anaeróbia com o processo Fenton. Foram aplicadas COV de até 27,9 g de DQO L.d-¹ nos RAHLF apresentando estabilidade durante todo período experimental, e remoções de DQO total acima de 60%, sendo as melhores remoções atingidas na fase 9 (85%), sem suplementação nutricional. Na fase 9 promoveram-se a redução de sulfato, sulfeto e fenóis no afluente, o que favoreceu a produção volumétrica de metano (0,28 L CH4 (L d)-1) em relação à fase anterior para condições de COVs similares. No entanto as médias de produção específica de metano, para ambas as fases, apresentaram-se semelhantes. O sequenciamento de nova geração (Illumina) realizado no lodo dos reatores em diferentes fases do experimento demonstrou uma comunidade microbiana diversa, com elevada abundância de bactérias dos filos Firmicutes, Proteobacteria, Cloacimonetes e Bacteroidetes, que contribuíram para a eficácia do sistema. A qPCR realizada apresentou alterações na composição microbiana, indicando que houve tendência dos microrganismos a realizarem a metanização pelas vias hidrogenotróficas.
Efeito da aplicação de ácido húmico sobre o crescimento de soja e sobre o microbioma edofítico em condições de restrição hídrica
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-04-25) da Silva, Maura Santos Reis de Andrade [UNESP]; Rigobelo, Everlon Cid [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Bactérias promotoras de crescimento vegetal (BPCV) e ácidos húmicos (AH) são opções promissoras para reduzir o uso de fertilizantes minerais, bem como, melhorar a resposta de plantas a estresses. E embora muitos estudos tenham demonstrado os efeitos de BPCV e AH separadamente, poucas informações estão disponíveis sobre as respostas das plantas à aplicação combinada desses bioestimulantes em leguminosas, como a soja. Ademais, são praticamente inexistentes estudos que abordem os efeitos que AH exerce sobre a comunidade microbiana endofítica de plantas, e como esta relação afeta o crescimento, desenvolvimento e proteção vegetal a estresses. Neste contexto, esta tese teve o objetivo de avaliar o efeito de K-humato [KH](AH comercial) sobre a soja e seu simbionte. Para isso, diferentes doses de KH foram testadas em semente de soja inoculada com Bradyrhizobium, com intuito de observar se este composto aumenta a sobrevivência do inoculante em semente e se favorece o desenvolvimento radicular e por conseguinte, a nodulação e incremento de N na planta. A concentração de 50 mg KH L-1 foi a mais promissora e foi capaz de proporcionar maiores incrementos sobre a nodulação (número e massa de nódulos), biomassa, teor de N na parte aérea e sobrevivência do inoculante na semente, em relação ao controle. Adicionalmente, foi avaliado o papel de AH de diferentes compostos orgânicos, a saber: vermicomposto e gongocomposto, sobre o crescimento da soja e a modulação de sua microbiota sob déficit hídrico. O material vegetal foi processado para a obtenção de comunidades microbianas endofíticas. Os marcadores filogenéticos de bactérias (16S rRNA) e fungos (ITS) foram amplificados e sequenciados por tecnologia Illumina. Foi observado que em ambas as condições ambientais, os AH estimularam mais o crescimento da soja que o controle. A composição bacteriana em folhas se distinguiu com aplicação de AH, dando origem a dois grupos distintos: um formado pelo tratamento controle e outro, pelos tratamentos com os AH. Na presença de estresse, a composição bacteriana se diferiu entre os três tratamentos. Não foi observado diferenças sobre a composição da comunidade fúngica perante a utilização de AH. Táxons microbianos foram diferentemente abundantes (DA) nas plantas. Sendo a fração fúngica, mais afetada por AH em raízes estressadas. As comunidades microbianas estimuladas na presença de AH parecem estar relacionadas com a promoção direta e indireta do crescimento vegetal.
XAC4296: A multidomain and exclusive Xanthomonadaceae protein related to chromosome segregation, cell division, and bacterial fitness
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-05-13) Oliveira, Amanda Carolina Paulino de [UNESP]; Varani, Alessandro de Mello [UNESP]; Ferreira, Rafael Marini; Ferreira, Henrique [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Os micro-organismos apresentam um repertório limitado e extremamente adaptável de genes. Muitos destes genes codificam para proteínas contendo um único domínio ou multidomínios proteicos variáveis, sendo que em ambos os casos, esses domínios proteicos podem ser combinados de diferentes maneiras, e assim formar o repertório enzimático total de um genoma. A bactéria fitopatogênica Xanthomonas citri subsp. citri 306 (X. citri), agente etiológico do cancro cítrico tipo A (CC) e considerada uma das doenças mais devastadoras da citricultura, apresenta um repertório de proteínas multidomínios ainda pouco explorado. Neste sentido, estudos recentes demonstraram que as proteínas multidomínios pertencentes a superfamília das Transglicosilases Líticas (LTs), apresentam um papel importante para a biologia de X. citri. As LTs, estão relacionadas com o metabolismo do peptidoglicano, portanto, apresentando uma função importante relacionada com a síntese, remodelagem e degradação da parede celular bacteriana. Em particular, dentre as 14 LTs presentes no genoma de X. citri, uma é exclusiva para este gênero, e não caracterizada experimentalmente, denominada XAC4296 (XAC_RS21660). Neste trabalho, empregamos métodos in-silico, mutação sítio dirigida e caracterização funcional, com a finalidade avaliar o papel que XAC4296 pode desempenhar em X. citri. Nossos resultados indicam que a proteína XAC4296 apresenta uma estrutura multidomíno, formada por dois módulos estruturalmente distintos: o primeiro módulo transglicosilase (PG_binding1, SLT_2), e o segundo módulo epimerase (aldose-1-epimerase). Análises filogenéticas e de contexto genômico indicam que XAC4296 provavelmente foi originada por um evento de fusão gênica a partir do ancestral comum para Xanthomonas, Stenotrophomonas e Pseudoxanthomonas. Análises funcionais indicam que o gene XAC4296 é expresso durante a interação patógeno-hospedeiro, porém, não é essencial para X. citri ou desenvolvimento do CC, mas influi no ‘fitness’ bacteriano. Além disso, cepas de X. citri sem o gene XAC4296 apresentaram células filamentosas e em formato de correntes, com sua massa cromossômica dispersa, porém, ainda apresentando a formação de constrição de septo, desta forma, sugerindo, primeiro o erro de segregação cromossômica e, consequentemente, divisão celular, indicando que a função LT presente neste gene possa estar relacionada com este fenótipo observado. Em contrapartida, este fenótipo mutante foi completamente restaurado utilizando sacarose como fonte de carbono, e ácido glutâmico, como fonte de nitrogênio, sugerindo que o módulo epimerase da proteína XAC4296 possa contribuir para o metabolismo basal, impactando paralelamente, na divisão celular. Neste sentido foi possível elaborar a hipótese que, na ausência do gene XAC4296 e de precursores das vias metabólicas basais, a produção de piruvato é alterada, levando ao colapso dos mecanismos de segregação cromossômica e divisão celular. Além disso, o fenótipo mutante foi intensificado na presença do antibiótico ampicilina, atingindo 100% das células, sugerindo que como função adicional, a proteína XAC4296 contribui para a resistência a antibióticos β-lactâmicos em X. citri. A expressão da fusão mCherry-XAC4296 mostrou a proteína em ambiente citoplasmático, porém a presença de peptídeo sinal sugere uma localização secundária no periplasma, corroborando a hipótese de multifuncionalidade. Esses dados ressaltam o papel das proteínas multidomínio como mecanismo de geração de diversidade enzimática, aumentando sua funcionalidade sem ocasionar expansão genômica, trazendo novos conhecimentos sobre o papel que enzimas multidomínios podem desempenhar em X. citri.
Identificação de novas enzimas de bibliotecas metagenômicas com aplicação biotecnológica para a agroindústria
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-03-18) Lima, Natália Sarmanho Monteiro [UNESP]; Lemos, Eliana Gertrudes de Macedo [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O desenvolvimento de novas tecnologias e novas abordagens para aumento da produtividade e melhoria das áreas cultivadas é uma busca constante. A utilização de enzimas de microrganismos é uma alternativa para alguns problemas encontrados no agronegócio, como utilização de resíduos agrícolas, controle biológico de pragas e doenças e biorremediação de defensivos agrícolas/pesticidas. As lacases e feruloil esterases são enzimas de grande importância biotecnológica. A metagenômica tem se mostrado bastante eficiente na busca de novos genes codificadores de proteínas/enzimas e a tecnologia do DNA recombinante facilita o acesso a esses genes. LacMeta é uma lacase metagenômica, que possui potencial para degradação de corantes, conforme resultados preliminares obtidos. Neste trabalho resolvemos aprofundar o estudo da aplicação biotecnológica desta enzima para biorremediação de outros compostos xenobióticos, visando determinar os parâmetros ótimos de reação bem como avaliar o potencial de detoxificação dos resíduos tratados. Para esta abordagem foram escolhidos o verde de malaquita (VM), amplamente utilizado na aquicultura apesar de proibições vigentes por diversas normas ambientais; o hidróxido de fentina (fungicida) e o imazapic (herbicida), ambos defensivos agrícolas largamente utilizados em monoculturas, visando verificar o potencial catalítico e mecanismos bioquímicos de atuação da LacMeta. Os resultados obtidos comprovaram a eficiência da LacMeta na detoxificação dos xenobióticos, sobretudo no que diz respeito a sua atuação na degradação completa do VM em 48 h, resultando em metabólitos inertes de acordo com os resultados de fitotoxidade e citotoxidade. Além disso, visando fomentar novos estudos de aplicação na degradação de resíduos agrícolas, prospectamos uma feruloil esterase (FAE) em bancos de dados metagenômicos. Esta enzima atua na degradação de ácidos hidroxinâmicos presentes na biomassa lignocelulósica. A nova FAE foi identificada como do tipo C. Análises preliminares da enzima em extrato celular solúvel bruto indicaram que a FeaC7 apresentou atividade enzimática positiva para esterase e tanase. Em conjunto, os resultados deste trabalho demonstram que, as enzimas metagenômicas LacMeta e FaeC7 possuem elevado potencial biotecnológico para aplicação na agroindústria, uma vez que podem atuar na degradação de resíduos agrícolas e na biorremediação de pesticidas.
Formulação de Aureobasidium pullulans para controle de doenças de pós-colheita em frutos cítricos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-02-08) Moura, Vanessa Santos [UNESP]; Kupper, Katia Cristina [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O Brasil é um dos maiores produtores de citros, tanto para o consumo in natura como na forma industrializada de sucos concentrados. No entanto, o setor citrícola sofre com as doenças que ocorrem na fase de pós-colheita, as quais são iniciadas no campo e se desenvolvem durante o beneficiamento dos frutos em packing houses. A podridão azeda (Geotrichum citri-aurantii) e o bolor verde (Penicillium digitatum) se destacam, em termos de importância econômica, dentre as doenças que ocorrem na pós-colheita de citros, as quais são responsáveis pela diminuição da qualidade e quantidade de frutos. A utilização de microrganismos antagônicos no desenvolvimento de formulações e o aumento do número de pesquisas na área podem contribuir para a utilização de uma alternativa ao uso de fungicidas sintéticos. O processo de formulação deve atingir, principalmente, quatro objetivos básicos: i) estabilizar o antagonista durante a produção, distribuição e armazenamento do bioproduto; ii) facilitar o manuseio e aplicação pelo agricultor; iii) proteger o agente de fatores ambientais nocivos e, finalmente, iv) manter a atividade do organismo no local de uso. Trabalhos desenvolvidos no Laboratório de Fitopatologia e Controle Biológico do Centro Avançado de Pesquisa e Desenvolvimento de Citricultura Sylvio Moreira/IAC mostraram o potencial da levedura Aureobasidium pullulans–ACBL-77 no controle destas doenças. Diante deste contexto, este trabalho visou investigar uma formulação à base da levedura A. pullulans buscando desenvolver uma tecnologia de manejo de controle na fase de pós-colheita, a fim de encontrar uma alternativa para o controle dessas doenças. Para tal foram avaliados: (i) a viabilidade e a biomassa de A. pullulans-ACBL-77 em diferentes meios de cultivo; (ii) a produção de biofilme por A. pullulans nos diferentes meios de cultura; (iii) o efeito da molaridade do tampão fosfato de potássio e pH em células da levedura; (iv) o melhor agente de preservação da levedura no processo de formulação e a vida-de-prateleira do produto; (v) a atividade killer de A. pullulans ACBL-77 após formulação; (vi) a detecção e quantificação de sideróforos produzidos por A. pullulans-ACBL-77 na formulação; (vii) o efeito das formulações à base de A. pullulans na inibição do crescimento micelial de G. citri-aurantii e de P. digitatum; (viii) o efeito da formulação à base de A. pullulans na germinação de G. citri-aurantii e de P. digitatum; (ix) a eficiência da formulação à base de A. pullulans no controle in vivo da podridão azeda e do bolor verde em frutos cítricos e, finalmente, (x) verificar o efeito da aplicação do produto formulado quanto aos parâmetros de qualidade dos frutos cítricos. Os resultados deste estudo mostraram que o produto formulado à base de A. pullulans ACBL-77 proporcionou a viabilidade da levedura por seis meses de armazenamento a 4°C, manteve as suas atividades de antagonismo (killer e produção de sideróforos) e inibiu a germinação dos conídios dos fitopatógenos. Além disso, o bioproduto independente da concentração testada, controlou, preventiva e curativamente, a podridão azeda em frutos de lima ácida Tahiti e de laranja Pêra. No entanto, para o bolor verde o produto formulado controlou de forma preventiva a doença em os frutos de laranja Pêra e, a sua eficiência de controle foi maior quando os frutos foram armazenados em câmara fria (10°C). O produto formulado não afetou os parâmetros de qualidade dos frutos cítricos. Com base nesses resultados, a formulação à base da levedura tem grandes possibilidades de ser comercializada para o biocontrole na pós-colheita de citros.
Genômica aplicada à predição dos mecanismos moleculares de resistência aos metais potencialmente tóxicos e promoção de crescimento vegetal em Rhizobium sp. LBMP-C04
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-09-14) Bonaldi, Daiane Silva; Alves, Lucia Maria Carareto [UNESP]; Pinheiro, Daniel Guariz [UNESP]; Kishi, Luciano Takeshi; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A associação de microrganismos com plantas hiperacumuladoras de metais potencialmente tóxicos (MPT) para remover, transferir ou estabilizar esses elementos do solo é uma ferramenta adequada para processos de biorremediação de ambientes contaminados. A capacidade dos microrganismos em resistir a esses ambientes depende de fatores bioquímicos, estruturais, fisiológicos e de adaptação genética deles. Sendo assim, o objetivo desde trabalho consiste na avaliação da capacidade do isolado Rhizobium sp. LBMP-C04 em ser usado para biorremediação e promoção de crescimento vegetal em solos contaminados com metais. Para isso, nesse trabalho foi realizada a predição de genes relacionados ao metabolismo de MPT, genes de promoção de crescimento e genes de resistência a antimicrobianos, bem como a realização de testes bioquímicos para comprovar essas características in vitro da bactéria Rhizobium sp. LBMP-C04. Através das anotações funcionais do genoma sequenciado foi possível predizer uma variedade de genes relacionados à resistência aos MPT, de promoção de crescimento vegetal e resistência a antimicrobianos no genoma bacteriano. Os genes de resistência estão associados principalmente a mecanismos relacionados a bombas de efluxo, reparo de danos ao DNA e na importação ou exportação de metal nas células bacterianas, a fim de manter a homeostase celular. Os genes que promovem o crescimento vegetal estão relacionados com os mecanismos de tolerância ao estresse osmótico, solubilização de fosfato, metabolismo do nitrogênio, fixação biológica de nitrogênio, formação de biofilme, respostas ao choque térmico e a biossíntese de ácido indol-3-ácetico (AIA), de triptofano e de ácidos orgânicos. Os resultados bioquímicos indicam que o isolado Rhizobium sp. LBMP-C04 é capaz de solubilizar fosfato de cálcio, produzir sideróforos e compostos indólicos in vitro; o isolado foi resistente aos antibióticos ampicilina, amoxicilina, rifampicina, ácido nalidíxico e trimetropina. O isolado Rhizobium sp. LBMP-C04 apresentou MIC de 5, 14, 13, 12, 48 e 401 mmol dm-3 respectivamente aos metais Cd2+, Cu2+, Cr6+, Cr3+, Zn2 e Ni2+, além de ter sido detectado acúmulo intracelular desses metais, demostrado pela remoção de metais do meio de cultivo e por microscopia eletrônica de transmissão. Os resultados observados indicam a possibilidade de se utilizar o isolado Rhizobium sp. LBMP-C04 como uma bactéria eficiente em processos de biorremediação e fitorremediação de ambientes contaminados por metais potencialmente tóxicos por apresentar resistência a diversos metais e ter possibilidade de atuar como promotora de crescimento em plantas bioacumuladoras
Efeito de dose para o estabelecimento rizosférico e endofítico de microrganismos promotores de crescimento de plantas
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-03-11) Diaz, Paola Andrea Escobar [UNESP]; Rigobelo, Everlon Cid [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A agricultura desempenha um papel importante na economia do Brasil. Nesse contexto, fertilizantes minerais e defensivos agrícolas são aplicados em grande escala visando o aumento da produtividade para atender a demanda da população mundial. Um dos aspectos negativos associados a essas atividades é a perda da qualidade do solo e suas propriedades físicas e químicas. O assunto se tornou uma preocupação ambiental devido às mudanças nas condições climáticas e riscos à saúde pública que afetam a segurança alimentar e a sustentabilidade na agricultura. Essa situação exigiu o desenvolvimento de alternativas sustentáveis e ecologicamente corretas para a agricultura. Diante disso, o estudo de microrganismos do solo associados às plantas tem grande potencial pois estão direta ou indiretamente envolvidos na promoção de crescimento e aumento da produtividade das plantas através da produção de fitormônios, disponibilização de nutrientes e produção de compostos orgânicos voláteis e antimicrobianos (antibióticos, enzimas líticas e sideróforos). Os microrganismos interagem de diversas maneiras com as plantas beneficiando-as e garantindo recursos para si em troca. Várias espécies de fungos e bactérias são relatadas como promotoras de crescimento em várias culturas e vêm sendo utilizados como inoculantes biológicos na agricultura com a finalidade de aumentar a produtividade das culturas. Assim, o presente estudo teve como objetivo determinar o efeito da concentração para o estabelecimento rizosférico e endofítico de três cepas de fungos do gênero Aspergillus e três cepas bacterianas do gênero Bacillus selecionados pelo potencial de promoção de crescimento de plantas. O potencial de promoção de crescimento e colonização em plantas de algodão foram avaliados a partir de testes em casa-de-vegetação na cultura do algodão. Foram avaliados os parâmetros massa seca, teores de fósforo e nitrogênio nas plantas e contagem de unidades formadoras de colônias nas plantas e no solo. Posteriormente, duas cepas de fungos e bactérias foram selecionadas e testadas em duas concentrações em campo para determinar o efeito das cepas e concentrações na produtividade da cultura de algodão. Foi verificado que a colonização das plantas de algodão e produtividade da cultura foi variável e não associada à concentração. Finalmente, estudos são necessários para determinar a capacidade de promoção de crescimento de Bacillus e Aspergillus em outras culturas e seu impacto na produtividade e no ambiente.
Unravelling the diversity, metabolic and biotechnological potential of a lignocellulose-decomposing bacterial community by genomic-centered metagenomics
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-10-29) Weiss, Bruno [UNESP]; Varani, Alessandro de Mello [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Os processos de produção de biocombustíveis de segunda geração estão em alta demanda. Na natureza, a lignocelulose pode ser rapidamente desconstruída. A eficácia do fenômeno na natureza pode ser devido à divisão de trabalho bioquímico efetuado nas comunidades bacterianas. Aqui, projetamos um experimento para coletar e enriquecer seletivamente um consórcio bacteriano obtido do solo e sobras de palha seca da cana-de-açúcar de uma usina de cana-de-açúcar. Procedeu-se ao sequenciamento de duas amostras provenientes da 2ª e 20ª semanas (fração bacteriana anexada as fibras da cana-de-açucar e a fração bacteriana livre disposta no meio de cultivo), visando definir a dinâmica composicional do consórcio, sua composição metagenômica, espécias, abundâncias e potencial metabólico em relação às suas capacidades desconstrutoras de lignocelulose e de controlar ecofisiologicamente a dinâmica da comunidade. Fomos capazes de separar 52 genomas das leituras metagenômicas, apresentando alta completude e baixa contaminação, estimando a abundância relativa de cada espécie representada por tais genomas montados a partir dos dados metagenômicos. Observamos a dinâmica do consórcio, em que ~46% das espécies não mostrou nenhuma modificação relevante em sua abundância. Três espécies encontradas na 2ª semana estavam mormente ausentes na 20ª semana, enquanto todas as espécies altamente abundantes encontradas no início mantiveram alta abundância na 20ª semana. Também, foi possível reconstruir o metabolismo de cada genoma. Encontramos sequências relacionadas à desconstrução da lignina na maioria dos genomas, e muitas das espécies mais abundantes em todas as amostras e frações são relacionadas a gêneros de organismos conhecidos por serem capazes de desconstruir a lignina. Propusemos um modelo metabólico qualitativo que nos permite ver as diferentes potencialidades cada genoma e grupo taxonômico no que diz respeito à desconstrução de polímeros sacarídicos e lignina, e também esclarecer a divisão de trabalho bioquímico que este consórcio pode utilizar para desconstruir a lignocelulose. Estas informações poderão auxiliar na estruturação de decisões para esforços de engenharia e biologia sintética visando o aprimoramento ou seleção de partes do consórcio para a execução de etapas específicas na desconstrução de biomassa lignocelulósica.
Bactérias com potencial probiótico: hematoimunologia, desempenho produtivo e sobrevivência do tambaqui (Colossoma macropomum)
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-07-01) Kotzent, Suzana [UNESP]; Pilarski, Fabiana [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Os probióticos são microrganismos que contribuem para a melhora de um ou mais fatores na saúde do hospedeiro. Na aquicultura, o uso de probióticos é evidenciado na melhora das respostas imunológicas e sobrevivência às infecções, no desempenho produtivo, além da melhora na qualidade do ambiente de produção. Para o tambaqui (Colossoma macropomum), a espécie de peixe nativo mais produzido no Brasil, não há qualquer probiótico autóctone para ser comercializado como aditivo alimentar. Desta forma, neste trabalho foram avaliados o efeito de cepas autóctones com potencial probiótico na saúde e desempenho do tambaqui. Em um primeiro experimento, foi investigada a ação imunoestimulante de quatro cepas bacterianas selecionadas em estudo prévio: Enterococcus hirae, Lactococcus lactis, Pediococcus pentosaceus e Staphylococcus hominis. As cepas liofilizadas foram incorporadas na dieta à 106 UFC/g de ração, e os peixes foram alimentados durante 60 dias com as quatro dietas experimentais além do grupo controle. Análises hematológicas, bioquímicas e imunológicas foram realizadas nos dias 0, 7, 15, 30, 45 e 60. No dia 60, foi analisada a histoquímica intestinal de todos os grupos experimentais. No segundo experimento, as bactérias L. lactis e P. pentosaceus foram adicionadas separadamente a dieta em suspensão de PBS nas concentrações 107 e 109 UFC/g de ração, mais um grupo controle. As dietas foram fornecidas aos animais durante 58 dias, e durante este período, nos dias 0, 15, 30 e 58 foram avaliados os parâmetros hematológicos, bioquímicos, imunológicos e desempenho produtivo. No dia 58 foram avaliados também o índice hepatossomático, histoquímica intestinal, a composição microbiana intestinal e a resistência à infecção por Aeromonas hydrophila. Os resultados encontrados no primeiro experimento demonstraram aumento significativo da atividade respiratória dos leucócitos nos peixes que receberam a ração contendo as bactérias L. lactis e P. pentosaceus, desta forma estas cepas foram selecionadas para o segundo experimento. No segundo estudo, as bactérias modularam a microbiota intestinal dos peixes, sem alterar os parâmetros fisiológicos. Com base nestes resultados, novos estudos devem ser realizados para elucidar à ação de probióticos no tambaqui, visto a baixa responsividade a este tipo de aditivo para esta espécie.
Estudo de hemicelulases através de RT-qPCR e expressão heteróloga
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-06-07) Leonel, Tatiane Fernanda [UNESP]; Lemos, Eliana Gertrudes de Macedo [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A produção de energia e de químicos renováveis a partir de resíduos agroindústrias de origens lignocelulósicas se tornou uma alternativa viável para minimizar os impactos causados pela utilização de combustíveis de origem fóssil. Porém, tal processo envolve altos custos, tendo em vista a recalcitrância da parede celular vegetal, o que dificulta a liberação de açúcares fermentáveis, fazendo-se necessário o uso de etapas de pré-tratamento e hidrólise frequentemente conduzidas em condições de concentração de reagentes químicos, temperatura e pressão elevadas, o que resultam na produção de metabólitos secundários e tóxicos indesejáveis. Assim, diversos estudos estão sendo realizados a fim de otimizar o processo de sacarificação da biomassa lignocelulósica, proporcionando um produto final menos oneroso e menos tóxico. Algumas enzimas de origens microbiológicas já estão sendo estudadas para serem utilizadas nessa etapa, sejam estas de função celulolítica, hemicelulolítica, lignocelulolítica ou mesmo auxiliar, porém a falta de eficiência, aliada ao alto custo de produção tem demandado a busca por novas moléculas para desconstrução da parede celular em formulações de coquetéis enzimáticos mais efetivos. Diante disto, o presente estudo teve por objetivo estudar duas hemicelulases da família GH2 de β-manosidases, obtidas por prospecção in silico e anotadas à partir do genoma da bactéria Chitinophaga sp. CB10 que foi isolada de um consórcio microbiano enriquecido a partir de uma pilha de bagaço de cana-de-açúcar. CB10 demonstrou ser uma fonte rica em carboidrases, com 350 domínios CAZyme previstos, o que pode explicar sua capacidade de se desenvolver a partir de carboidratos de diferentes complexidades estruturais: glicose, carboximetilcelulose, galactomanana, goma Aloe vera e bagaço de cana-de-açúcar. O bagaço da cana-de-açúcar é uma fonte rica em polímeros complexos, de forma que a diversidade de metabólitos liberados pela hidrólise enzimática destes polímeros tem um papel importante para a química verde, incluindo a hidrólise por vias enzimáticas minoritárias, como é o caso da degradação de conjugados de manana. Nesse sentido, CB10 demonstrou níveis de aumento consideráveis de expressão gênica para mananases na presença de bagaço de cana-de-açúcar como única fonte de carbono, quando comparado aos níveis de expressão em glicose (controle). Estes aumentos apresentaram respectivos níveis de 4,8x para o gene CB10-00347, localizado dentro de um agrupamento gênico identificado como “Polysaccharide Utilization Loci” (PUL), e 5,6x de aumento para o gene CB10-153.446, não associado a nenhum cluster enzimático. Essas enzimas compartilharam menos do que 45% de identidade com enzimas caracterizadas do gênero Chitinophaga pertencente ao filo Bacteroidetes. O grau de novidade - conforme demonstrado pela baixa identidade com enzimas caracterizadas anteriormente; a notável capacidade de crescer em diferentes substratos; a confirmação de atividade de mananase, evidenciada pela liberação de oligossacarídeos residuais no cultivo com galactomanano (HPLC-RID, 12,3 mMol); associados à capacidade de expressar mananases em uma baixa concentração de condições indutoras (bagaço-de-cana contém cerca de 0,2% de manose) indicam o alto potencial para a aplicação de CB10 como fonte de enzimas na produção de oligossacarídeos conjugados de manose a partir de biomassa. Além destes resultados, grandes esforços foram empreendidos com o intuito de compreender melhor a atividade de uma das enzimas preditas para β-manosidase (ORF CB10_153.446) utilizando ensaios de expressão heteróloga de proteína recombinante. Entretanto, apesar de diversas tentativas de otimização, não houve êxito na estratégia de expressão proteica em E. coli Bl21 DE3, sendo necessários novos estudos para usufruir do potencial biotecnológico demostrado pelas demais técnicas utilizadas, visando aplicação biotecnológica em biorrefinarias de precursores pré-bióticos e outros oligossacarídeos funcionais focados no indústrias alimentícias e farmacêuticas
Avaliação da produção de etanol a partir de sorgo e caracterização dos produtos alimentícios e bebidas
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-05-12) Teixeira, Vitor [UNESP]; Mutton, Márcia Justino Rossini [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O cultivo da cultura do sorgo vem crescendo de modo significativo, objetivando o uso desta planta para a produção de etanol combustível e alguns alimentos (xarope, bebidas alcoólicas e vinagre). Sendo assim, a presente pesquisa foi separada em três partes, a primeira teve como objetivo: I) Avaliar o desempenho do sorgo sacarino (Malibu J53) com e sem o uso de fitorregulador etefom no cultivo da matéria-prima, utilizando-se duas estirpes de leveduras (PEDRA-2 e FT-858L) no processo fermentativo para determinar o potencial de produção de etanol combustível e a interação entre o regulador vegetal e os inóculos (Capítulo 2). Neste estudo, foi observado que a aplicação do etefom não restringiu a formação da panícula, apenas retardou o crescimento, resultando em uma panícula 20 centímetros menor e diminuição da massa úmida em 6,8 t.ha-1, com pequeno acrescimento no acúmulo de açúcares. Dentre as leveduras utilizadas no processo fermentativo, a PE-2 apresentou maior adequação ao mosto de sorgo sacarino e ao uso do etefom. Com relação a produtividade de etanol, o uso do etefom resultou em redução da produtividade de etanol em 711,92 L.ha-1, embora não significativa, com produtividade de até 5387,26 litros de etanol.ha-1. Conclui-se que o uso do etefom no cultivo do sorgo sacarino Malibu J53 não favorece uma melhor qualidade químico-tecnológica do caldo e aumento na produção de etanol, com melhor desempenho fermentativo para a levedura PE-2. A segunda parte, teve como objetivo: II) Avaliação e viabilização do processo enzimático e fermentativo, em escala laboratorial, objetivando o uso de grãos de sorgo granífero (branco e roxo) como matéria-prima para produção de etanol (Capítulo 3). De acordo com o tratamento enzimático realizado, a hidrólise do amido foi quase total na primeira etapa com o tratamento físico e uso do TSC (α- amilase). Durante o processo fermentativo, foram obtidas as concentrações de etanol de 5,28% para o farelo roxo e 6,98% para o farelo branco. Conclui-se que os farelos roxo e branco de sorgo granífero apresentam elevado potencial para aplicabilidade para processos fermentativos e o tratamento físico (temperatura) e a enzima α-amilase apresentam potencial para ser utilizados para os farelos. A terceira parte, teve como objetivo: III) Avaliação e caracterização físico-química de produtos alimentícios oriundos de uma biorrefinaria exclusiva de sorgo sacarino, a qual produziu xarope, vodca, uísque e vinagres de sorgo sacarino (claro e escuro), realizado na Heckemeyer Biorefinery nos EUA (Capítulo 4). O xarope de sorgo sacarino apresenta concentração total de 48,07% de açúcares, além disso, elevada concentração de antioxidantes comparado a outros xaropes comerciais. Foram observados para a vodca e uísque a concentração de etanol de 46,67% e 48,61%, respectivamente. Ambos os vinagres produzidos de sorgo sacarino (claro e escuro) destacam-se comparados a outros vinagres comerciais de diferentes matérias-primas, decorrente a elevada concentração de antioxidantes e corantes fenólicos. Sendo assim, conclui-se que o xarope e vinagre produzidos destacam-se perante produtos comerciais com elevada concentração de antioxidantes e a necessidade de mais estudos para comparar a vodca e uísque de sorgo sacarino com outros destilados.
Estudo da variabilidade de bactérias promotoras de crescimento de plantas da espécie Bacillus subtilis
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-02-01) Santos, Bianca de Melo Silveira dos; Rigobelo, Everlon Cid [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A utilização contínua de fertilizantes minerais na agricultura promove o excesso de nutrientes no solo, tais como nitrogênio, potássio e fósforo, podendo causar alterações na microbiota do solo, promovendo danos. Em geral, as plantas possuem baixa eficiência em absorver tais nutrientes, o que leva a uma baixa eficiência na utilização da adubação mineral. A utilização de bactérias promotoras de crescimento de plantas tem sido uma promissora alternativa na busca de melhorar a eficiência na utilização de insumos agrícolas, podendo trazer inúmeros benefícios para a agricultura. Porém, bactérias da mesma espécie podem promover diferentes níveis de crescimento. O presente estudo teve por objetivo avaliar a ação de oito isolados de Bacillus subtilis quanto à promoção do crescimento de plantas na cultura do milho em condições de casa de vegetação, assim como sua atividade metabólica, capacidade de degradação enzimática, produção de sideróforos, tolerância aos íons Cd(II), Cr(III), Ni(II), Zn(II), Cu(II) e Cr(VI) e antagonismo de agentes fitopatogênicos. O experimento foi conduzido em casa de vegetação, constituído por nove tratamentos – oito isolados de B. subtilis e um controle, em delineamento utilizado foi o casualizado com cinco repetições. A atividade metabólica foi avaliada pelo consumo de diferentes fontes de carbono utilizando placas EcoPlate. A capacidade de degradação enzimática, produção de sideróforos, tolerância a Cd(II), Cr(III), Ni(II), Zn(II), Cu(II) e Cr(VI) e antagonismo foi verificada utilizando meio de cultura (caldo nutriente) em placas. O isolado 290 promoveu maior crescimento de plantas, e foi o único capaz de consumir ácido glicil – L – glutâmico. Todos os isolados foram capazes de produzir amilase, celulase, e solubilizar fosfato orgânico. Os isolados foram mais resistentes ao Zn(II) e Cr(III). O antagonismo contra agentes fitopatogênicos foi verificado para os fungos: Alternaria alternata, apenas 290 apresentou ausência de antagonismo; Colletotrichum gloeosporioides apenas os isolados 248, 291, e 287 foram antagônicos; Phyllosticta citricarpa todos os isolados foram antagônicos, e apenas 290 apresentou um fraco antagonismo; e para o Geotrichum citri-aurantii apenas os isolados 309 e 287 foram antagônicos. Seis isolados foram capazes de produzir sideróforos, exceto o isolado 290 e 291. O presente estudo avaliou o comportamento de oito isolados de Bacillus subtilis perante a promoção de crescimento de plantas relacionando com suas características genéticas e fisiológicas. Estes resultados abrem caminho para novos estudos na tentativa de esclarecer quais são os mecanismos de ação de cada isolado, e quais fatores genéticos podem interferir em suas atividades a fim de promover o crescimento vegetal de maneira mais efetiva. Os resultados também mostram a possibilidade da utilização desses isolados para produção de enzimas de interesse biotecnológico, biorremediação áreas contaminadas e promoção de ações antagônicas contra agentes fitopatogênicos.
Isolamento, caracterização e identificação de rizobactérias com habilidades para promover o crescimento de plantas
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-12-16) Santos, Roberta Mendes dos; Rigobelo, Everlon Cid [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
As rizobactérias promotoras de crescimento de plantas têm o potencial para melhorar a produtividade das culturas. Os principais mecanismos pelos quais essas bactérias podem estimular o crescimento das plantas incluem, a produção de fitormônios, disponibilização de nutrientes e produção de compostos orgânicos voláteis e antimicrobianos, tais como antibióticos, enzimas líticas e sideróforos. Vários isolados bacterianos são relatados com o potencial de estimular o crescimento em diferentes culturas e sob diversos sistemas de produção agrícola e vêm sendo utilizados como inoculantes na agricultura, com a finalidade de melhorar a produtividade das culturas. Neste contexto, o presente estudo teve o objetivo isolar, caracterizar e identificar bactérias provenientes da rizosfera de cana-de-açúcar e analisar seu potencial de crescimento em plantas de cana-de-açúcar e milho. O isolamento das rizobactérias foi realizado a partir de solo rizosférico de seis diferentes variedades de cana-de-açúcar, coletado nas cidades de Jaboticabal – SP, Pirajuba – MG e Frutal – MG. A seleção das cepas bacterianas ocorreu a partir da realização de testes in vitro qualitativos e quantitativos de fixação biológica de nitrogênio, produção de ácido indolacético, atividade celulolítica e solubilização de fosfatos e potássio. Os isolados selecionados foram identificados a partir da extração e amplificação do rDNA 16S. Enquanto que, o potencial de promoção de crescimento e colonização de sete isolados foi avaliado a partir de testes em casa de vegetação com cana-de-açúcar e milho. Foi avaliado altura, massa seca, teores de fósforo e nitrogênio nas plantas e contagem de unidades formadoras de colônias nas plantas e no solo. Foram isoladas 167 cepas bacterianas que apresentaram habilidades de promoção de crescimento, destas, sete cepas foram selecionadas e identificadas pertencendo aos gêneros, Staphylococcus, Enterobacter, Bacillus e Achromobacter. Cinco isolados conseguiram proporcionar o crescimento em cana-de-açúcar, Enterobacter sp. IP11, Enterobacter sp. IP14, Bacillus anthracis IP17, B. thuringiensis IP21, Achromobacter spanius IP23. Na cultura do milho, somente Enterobacter sp. IP14, B. anthracis IP17 e B. thuringiensis IP21 promoveram o crescimento. A maioria das cepas bacterianas isoladas da rizosfera de cana-de-açúcar tiveram uma preferência pela mesma cultura. Entretanto, é possível e foi verificado com esse estudo, que rizobactérias isoladas de cana-de-açúcar podem também ser capazes de promover o crescimento e o desenvolvimento vegetal do milho.
Emprego da moringa oleífera lam para destoxificação do licor hemicelulóstico de sorgo e cana-energia para produção de etanol de segunda geração
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-11-17) Freita, Cristhyane Millena de [UNESP]; Mutton, Márcia Justino Rossini [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Para que se tenha o aproveitamento das frações lignocelulósicas de biomassas residuais, é necessário disponibilizar os açúcares congênitos, porém o rompimento das células vegetais, geram também constituintes prejudiciais para os microrganismos nos processos fermentativos, logo uma etapa de destoxificação é necessária. Comumente emprega-se o método do carvão ativado, mas este gera residuais no meio e alternativas devem ser propostas. Neste contexto, objetivou-se avaliar diferentes métodos de destoxificação de licores hemicelulósicos em duas matérias-primas fibrosas, sorgo biomassa e cana-energia, através da hidrólise ácida diluída. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, com mistura gradativa de sorgo biomassa e cana-energia (SB: CE), nas proporções de 25:75%; 50:50%; 75:25% e de 100 (CE) %, 100%(SB) como tratamento principal. O tratamento secundário foi a destoxificação dos licores com o tratamento convencional (carvão ativado), biofloculante de M. oleífera LAM e a não destoxificação. Avaliou-se a caracterização da celulose, hemicelulose, lignina, os teores de compostos fenólicos totais (mg. L-1), acidez total (g.L-1 de H2SO4), viabilidade celular, brotos e brotamento no processo fermentativo, glicerol (%), teor alcoólico (%) e nutrientes. A utilização da M. oleífera LAM como biofloculante no processo de destoxificação dos licores para produção de etanol de segunda geração reduziu significativamente compostos inibitórios como fenóis e ácidos totais, ocasionando assim, viabilidades celulares importantes para promover o reciclo de células. A levedura Pichia kudriavzevii LJ3, utilizada neste experimento demonstrou desempenho fermentativo superior, em meios tratados com moringa, tanto para o sorgo biomassa, quanto para cana-energia. O tratamento da biomassa constituído unicamente de sorgo demonstrou maiores teores alcoólicos, especialmente quando se associou com o método com M. oleífera LAM. Contudo tem-se que a metodologia de destoxificação da M. oleífera LAM foi eficiente devido ao reflexo exercido no processo.
Overreaching/overtraining de ratos wistar: resposta inflamatória, microbiota intestinal e comparação da abundância relativa com equinos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-11-27) Almeida, Maria Luiza Mendes de [UNESP]; Lemos, Eliana Gertrudes de Macedo [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
É conhecido que o exercício pode induzir respostas inflamatórias com relativa repercussão sobre múltiplos órgãos e evidências científicas indicam que o mutualismo entre a microbiota intestinal (MI) e o hospedeiro pode ser modificado por programas de treinamento. Quando o equilíbrio delicado entre sessões de exercícios de alta carga e adequado períodos de recuperação é interrompido, o treinamento excessivo, conhecido como overtraining, pode levar ao declínio transitório (overreaching funcional - FOR) ou persistente (overreaching não funcional/síndrome overtraining - NFOR/SOT) do desempenho. Aqui foi caracterizado a dinâmica de citocinas intestinais, bem como a resposta da microbiota cecal, explorando mudanças na composição e estrutura microbiana de ratos Wistar machos sob condições FOR e NFOR submetidos a teste de esforço máximo na esteira. Para caracterização das condições FOR e NFOR dois grupos foram utilizados. O primeiro foi utilizado como referência, semi-sedentário (SSED), que realizou programa de condicionamento leve e, outro, treinado (TR), que executou programa de treino intenso, constituído por doze semanas e cinco fases. A fase final foi prescrita com períodos de recuperação reduzidos. FOR e NFOR/SOT foram determinadas por meio de avaliação longitudinal pelo método que considera o trabalho mecânico (W) efetuado durante teste de esforço máximo. Obteve-se DNA metagenômico para sequenciamento da região V4-V5 do gene 16S rRNA pelo Illumina. NFOR/SOT apresentou redução de TNF-α, IL-1β, IFN-γ e IL-10 no íleo e não houve alteração nas interleucinas colônicas, sendo evidenciado que a “hipótese de Smith das citocinas para condição de overtraining” parece não ocorrer no intestino já que íleo de citocinas tanto anti como pro-inflamatória. NFOR/SOT apresentou valores menores nos índices correspondentes à diversidade α, tais como “observed”, ACE, Chao1, Fisher e phylogenetic diversity (PD). Detectou-se redução do filo Proteobacteria na condição NFOR. A presença destacada do gênero Lactobacillus, em ambas as condições, pode significar resposta adaptativa protetora do intestino para atletas sob treinamento intensificado. As modificações obtidas aqui podem ter implicações na patogênese de algumas enfermidades, assim como na proteção intestinal.
Caracterização estrutural de enzimas lignocelulolíticas com potencial de aplicação em biorrefinaria
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-09-04) Pereira, Pâmela Aparecida Maldaner; Lemos, Eliana Gertrudes de Macedo [UNESP]; Gomes-Pepe, Elisângela Soares [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O cenário atual do uso de biocatalisadores em processos industriais movimenta a busca por novas enzimas, principalmente as que são capazes de degradar material lignocelulósico potencialmente utilizado na produção de biocombustíveis e outros produtos de alto valor agregado. O etanol de segunda geração é considerado um substituto sustentável aos combustíveis fósseis, devido ao processo ser desenvolvido a partir de resíduos agroindustriais. No entanto, a produção deste biocombustível detém diversos interferentes próprios do processo de produção, que contribuem para impulsionar a busca e o aperfeiçoamento de enzimas a fim de torná-las mais estáveis e eficientes. As enzimas β-glicosidase, β-xilosidase e lacase apresentam um amplo potencial biotecnológico, principalmente no que diz respeito à sacarificação da biomassa lignocelulósica. A resolução da estrutura tridimensional destas enzimas é de grande relevância, pois permite compreender alguns dos inúmeros mecanismos biológicos destas macromoléculas, como a especificidade da enzima pelo substrato, relação estrutura-função, arquitetura proteica e centros catalíticos. Deste modo, o presente estudo teve como objetivo expressar, purificar e caracterizar estruturalmente as enzimas β-glicosidase, β-xilosidase e lacase. A enzima β-glicosidase tolerante e estimulada pela glicose (Bg10) foi expressa e purificada em alta concentração e submetida a ensaios de cristalografia e difração de raios-X que forneceram dados de difração a uma resolução de 2,3 Å e permitiram determinar sua estrutura tridimensional. A estrutura proteica apresentou características estruturais conservadas entre as β-glicosidases GH1 tolerantes e estimuladas pela glicose. Além disso, seus dados estruturais forneceram percepções importantes sobre alguns dos mecanismos biológicos envolvidos na tolerância e estímulo pela glicose desta molécula, tais como a configuração do canal do sítio ativo e a presença de resíduos “gatekeepers”, os quais regulam a passagem e a orientação da glicose. A enzima β-xilosidase (BXil), por sua vez, teve sua caracterização estrutural realizada através de abordagens in silico e estudos de ancoragem molecular, os quais forneceram informações importantes sobre esta molécula, tais como a arquitetura de domínios composta pela repetição de dois domínios típicos de GH43 conservados e até hoje não caracterizados; a disposição do seu sítio catalítico e os principais resíduos envolvidos em interações com diferentes substratos. A expressão da enzima BXil ocorreu em corpos de inclusão e, assim, sua extração foi realizada através de métodos desnaturantes com otimização de protocolo e submetida a ensaios de cristalografia, no entanto, não ocorreu a formação de cristais. Sendo assim, novas abordagens para obtenção da proteína solúvel estão sendo realizadas, a fim de sustentar a caracterização in silico e desvendar a função e a interação entre seus domínios a partir de caracterização cinética e estrutural. Por último, a enzima lacase (LacMeta), também foi submetida à ensaios de cristalografia e difração de raios-X com dados coletados a uma resolução de 1,8 Å. Apesar disso, não foi possível determinar a estrutura da LacMeta através do método de substituição molecular devido à falta de um modelo de fase adequado no Banco de Dados de Proteínas. Diante disso, será necessária a realização de novos ensaios para obtenção de cristais derivados com selenometionina para obtenção das fases e determinação da estrutura. Este trabalho de caracterização permitiu elucidar algumas características estruturais destas macromoléculas, conhecimento este que poderá ser útil para potencializar suas propriedades catalíticas de acordo com propósitos específicos para aplicação biotecnológica em biorrefinaria.

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