Estudo metabólico e atividades biológicas de extratos produzidos pelos fungos endofíticos Preussia sp. e Phyllosticta sp. isolados de Platonia insignis Mart.

Abstract

O estudo dos fungos endofíticos (FE) isolados das folhas de Platonia insignis Mart, popularmente conhecida como bacuri, o que resultou, entre outros, no isolamento dos FE Phyllosticta sp e Preussia sp. Estes foram cultivados em diferentes meios e os extratos obtidos, avaliados quanto ao perfil químico e biológico (ensaios antiglicante, antileishmania, tripanocida e citotóxico) a fim de direcionar o isolamento e a identificação de substâncias bioativas. No estudo realizado por GC-MS com os extratos do fungo Preussia sp. foram anotadas duas dicetopiperazinas. A desreplicação dos extratos de Preussia sp. foi realizada pelo uso da plataforma GNPS (Global Natural Products Social Molecular Networking), utilizando dados espectrais obtidos por UPLC-Q-TOF-MS/MS. Relatou-se a anotação putativa do cluster de citocalasinas: citocalasina J, citocalasina B e ascocalasina no extrato de Czapek. Os extratos e frações foram testados contra o protozoário Leishmania infantum sendo que os extratos de Preussia sp. de Czapek (76%) e frações F6 (91%) e F7 (70%) do extrato PDB apresentaram alta porcentagem de inibição comparáveis ao controle positivo miltefosina (98%). Os extratos e frações dos fungos estudados apresentaram substâncias com propriedades antiparasitárias, destacando as substâncias ferricrocina e ferricrisina isoladas do fungo Phyllosticta sp. que mostram potencial para atividade antileishmania, com IC50 entre 5,31 – 8,51, respectivamente. Realizou-se também, estudo de compostos orgânicos voláteis microbianos (mCOVs), visto que é uma área de pesquisa recente em desenvolvimento com impacto nas áreas: agrícola, médica e biotecnológica. Assim, estudamos os COVs produzidos pelos dois FE (Phyllosticta sp e Preussia sp.) e seu co-cultivo em duas condições de luminosidade (com e sem luminosidade) e tempo de cultivo (10 e 20 dias), que foram avaliados por microextração em fase sólida (HS-SPME-GC-MS). Os dados de GC-MS foram analisados por ferramentas estatísticas uni e multivariadas, como análise de componentes principais (PCA), análise discriminante de mínimos quadrados parciais (PLS-DA) e abordagem metabolômica para identificar os COVs produzidos pelos dois fungos em culturas axênicas e co-cultivo. O conjunto de dados obtido foi analisado combinando a rede molecular gerada a partir dos dados de GC-MS com uma análise multivariada não-alvo, a fim de identificar as variações metabólicas ocorridas no perfil dos COVs. Identificou-se 23 COVs, como: álcoois 26%, hidrocarbonetos alifáticos 26%, ésteres 21,8%, cetonas 17,5% e outras classes 8,7%. O 3-metilbutan-1-ol e o álcool 2-feniletílico foram emitidos em todas as culturas axênicas (Phyllosticta sp. e Preussia sp.) e co-cultivo dos fungos. O éster 2-etil-hexanoato de metila foi identificado com composto majoritário do co-cultivo produzido por Phyllosticta sp. Uma análise multivariada dos dados foi realizada para visualizar tendências de agrupamento entre amostras e possíveis variáveis dispersas que pudessem distinguir entre culturas axênicas e co-cultivo. Deste modo, O gráfico de PCA indicou que não houve separação entre os COVs emitidos por F3 (Phyllosticta sp.) na cultura axênica e durante o co-cultivo, indicando semelhanças entre os COVs produzidos por esses grupos. Conforme os dados apresentados pelas variáveis VIP os voláteis que mais contribuíram para a descrição dos grupos foram as variáveis: 2-etil-hexanoato de etila, 3-metil-but-2-enoato de etila, nona-2-ona e undecan-2-ona. Os dados deste estudo contribuem para o conhecimento dos perfis metabólicos e biológicos de fungos endofíticos bem como suas interações com a planta hospedeira.

The study of endophytic fungi (EF) isolated from the leaves of Platonia insignis Mart, commonly reffered to as bacuri, which resulted, among others, in the isolation of EF Phyllosticta sp. and Preussia sp. These were cultivated in different media and the extracts obtained were evaluated for their chemical and biological profile (antiglycant, antileishmanial, trypanocidal and cytotoxic assays) in order to direct the isolation and identification of bioactive substances. In the study conducted using GC-MS with extracts of the fungus Preussia sp., two diketopiperazines were identified. The dereplication of Preussia sp. extracts was carried out using the GNPS (Global Natural Products Social Molecular Networking) platform, employing spectral data obtained by UPLC-Q-TOF-MS/MS. Putative annotation of the cytochalasin cluster was reported: cytochalasin J, cytochalasin B and ascochalasin in the czapek extract. The extracts and fractions were tested against the protozoan Leishmania infantum, with Preussia sp. extracts from czapek (76%) and fractions F6 (91%) and F7 (70%) of the PDB extract showing high inhibition percentages comparable to the positive control miltefosine (98%). The extracts and fractions of the studied fungi presented substances with antiparasitic properties, with particular emphasis on the compounds ferricrocin and ferrichrysin isolated from the fungus Phyllosticta sp. These compounds demonstrated potential antileishmanial activity, with IC50 values ranging from 5.31 - 8.51, respectively. In addition, a study of microbial volatile organic compounds (mVOCs) was conducted, as it represents a recent and developing research area with implications in agricultural, medical, and biotechnological fields. Therefore, we investigated the VOCs produced by the two endophytic fungi (Phyllosticta sp. and Preussia sp.) and their co-culture under two lighting conditions (with and without luminosity) and different cultivation times (10 and 20 days). The evaluation was performed using solid-phase microextraction (HS-SPME-GC-MS). The GC-MS data were analyzed using both univariate and multivariate statistical tools, such as Principal Component Analysis (PCA), Partial Least Squares Discriminant Analysis (PLS-DA), and a metabolomics approach, to identify the VOCs produced by the two fungi in axenic cultures and co-culture conditions. The dataset obtained was analyzed by combining the molecular network generated from the GC-MS data with a non- targeted multivariate analysis to identify the metabolic variations occurring in the VOCs profile. A total of 23 VOCs were identified, including alcohols (26%), aliphatic hydrocarbons (26%), esters (21.8%), ketones (17.5%), and other classes (8.7%). The compounds 3-methylbutan-1-ol and 2-phenylethanol were emitted in all axenic cultures (Phyllosticta sp. and Preussia sp.) and during the co-cultivation of the fungi. The 2-ethylhexanoate methyl ester was identified as the major compound in the co-culture produced by Phyllosticta sp. A multivariate analysis of the data was conducted to visualize clustering trends among samples and identify potential dispersed variables that could distinguish between axenic cultures and co-cultivation. Thus, the PCA plot indicated that there was no clear separation between the emitted VOCs by F3 (Phyllosticta sp.) in the axenic culture and during co-cultivation, suggesting similarities between the VOCs produced by these groups. According to the Variable Importance in Projection (VIP) analysis, the volatiles that most contributed to the grouping description were the variables: ethyl 2-ethylhexanoate, ethyl 3-methyl-2-butenoate, nonan-2-one, and undecan- 2-one. The data from this study contribute to the understanding of the metabolic and biological profiles of endophytic fungi, as well as their interactions with the host plant.