Estudos estruturais e calorimétricos com a importina-α de Mus musculus e as sequência de localização nuclear (NLS) de proteínas da via alternativa do reparo de DNA por excisão de base
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Data
2021-08-30
Autores
Orientador
Barros, Andréa Coelho de ![](assets/repositorio/images/logo-unesp.png)
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Fontes, Marcos Roberto de Mattos ![](assets/repositorio/images/logo-unesp.png)
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Coorientador
Pós-graduação
Curso de graduação
Ciências Biomédicas - ibb
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Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Trabalho de conclusão de curso
Direito de acesso
Acesso restrito
Resumo
Resumo (inglês)
The integrity of the human genome is constantly attacked by endogenous reactive metabolites, therapeutic drugs, and various environmental mutagens. In order to repair the damage caused to the DNA, the organism itself has DNA repair mechanisms, one of them being the base excision repair (BER). An important point for this repair to occur is that the proteins responsible for the repair need to be transported to the nucleus, so it is necessary to have a regulation of the protein import pathway from the cytoplasm to the nucleus protein. Among the regulation mechanisms of nuclear importation, one of the most known and studied is the classical nuclear import pathway, which is constituted by the heterodimer Importin-α/β, in which Importin-β is responsible for the transport and Importin-α (Impα) for the recognition of the cargo proteins that must contain a nuclear localization sequence (NLS) in their structure. This work aims to elucidate the binding of the NLSs from the NEIL1 and NEIL3 proteins, which are endonucleases present in the BER, to the Impα from Mus musculus. The methods were divided into two parts, structural and calorimetric, the first is crystallography to elucidate at atomic level the interaction between these NLS sequences of the cargo proteins and the Impα. For the calorimetric studies, the isothermal titration calorimetry (ITC) was chosen to obtain quantitative data, such as dissociation constant, enthalpy and entropy of the processes. The Impα from M. musculus was expressed as a recombinant protein and truncated in its Nterminus, then purified to be used in the subsequent experiments. The calorimetric studies performed using the ITC technique to the Impα-NLS_NEIL1 complex resulted in a nonperceptible affinity and the result of this experiment to the Impα-NLS_NEIL3 resulted in a medium affinity compared with previous studies with the same protein receptor. Impα and NEIL1 and NEIL3 NLS peptides were co crystallized, followed by X-ray diffraction experiments. The obtained data from the complexes containing the NEIL1 and NEIL3 NLSs were processed at 2.3 and 2.2 Å resolution, respectively. The NLS peptide from NEIL1 was bounded in a monopartite manner at both the major and minor sites of the Impα, contrasting with the NLS peptide from NEIL3 that was only bounded to the major site. By analyzing the interactions between the protein and peptides, it was possible to identify that the Impα and the NEIL1 NLS complex lack some key interactions, which is consistent with the calorimetric data obtained, leading to suggest that it is likely that NEIL1 is not transported by the classical nuclear import pathway. The interactions observed between the Impα and the NEIL3 NLS corroborate with the results of the calorimetric data, thus there is a high possibility that NEIL3 imported to the nucleus by the classical pathway.
Resumo (português)
A integridade do genoma humano é constantemente atacada por metabólitos reativos endógenos, drogas terapêuticas e diversos agentes mutagênicos ambientais. Para corrigir os danos causados ao DNA, o próprio organismo detém mecanismos de reparo de DNA, sendo um deles o reparo por excisão de bases (BER). Um fator importante para que esse reparo ocorra é que as proteínas responsáveis por esse reparo sejam transportadas para dentro do núcleo, logo é necessário que haja uma regulação da importação de proteínas do citoplasma para o núcleo. Dentre os mecanismos de regulação da importação nuclear, um dos mais conhecidos e estudados é a via clássica de importação nuclear, que é constituída pelo heterodímero Importina-α/β em que a Importina-β é responsável pelo carreamento e a Importina-α (Impα) pelo reconhecimento das proteínas cargo que devem ter uma sequência de localização nuclear em sua estrutura. Esse trabalho visa elucidar a ligação das Sequências de localização nuclear (NLSs) das proteínas NEIL1 e NEIL3, que são endonucleases presentes no BER, com a Impα de Mus musculus. Os métodos foram divididos em duas partes, estrutural e calorimétrico, sendo o primeiro a cristalografia para obter informações em nível atômico da interação entre essas sequências NLSs das proteínas carreadas com a Impα e o segundo a calorimetria por titulação isotérmica (ITC) para obter dados quantitativos destas interações, incluindo a constante de dissociação, entalpia e entropia dos processos. A Impα de M. musculus foi expressa de maneira recombinante e truncada em sua porção N-terminal, além de ser purificada para utilização nos experimentos subsequentes. Os estudos calorimétricos realizados com a técnica ITC resultaram em uma afinidade não perceptível do complexo Impα-NLS_NEIL1 e o complexo Impα-NLS_NEIL3 obteve uma afinidade considerada intermediária quando comparada a outros complexos previamente estudados. Em seguida, foi feita a co-cristalização da Impα com os peptídeos NLS da NEIL1 e NEIL3, que resultaram em cristais que foram submetidos à experimentos de difração de raios-X. Os dados coletados destes experimentos dos complexos com a NEIL1 e NEIL3 foram processados com, respectivamente, 2,3 e 2,2 Å de resolução. O peptídeo NLS da NEIL1 foi modelado e refinado como monopartida nos dois sítios da Impα, principal e secundário, e o peptídeo NLS da NEIL3 se ligou apenas no sítio principal. Pela análise das interações entre a proteína e os peptídeos foi possível identificar que complexo entre a Impα e a NLS da NEIL1 não têm algumas interações chave, o que condiz com os dados calorimétricos obtidos, levando a crer que possivelmente a NEIL1 não é transportada pela via clássica de importação nuclear. Já as interações entre a Impα e a NLS da NEIL3 corroboram com os resultados dos dados calorimétricos em que ocorre uma afinidade, logo existe grande possibilidade de ser importada para o núcleo pela via clássica.
Descrição
Palavras-chave
Idioma
Português