Avaliação da composição lipídica na membrana citoplasmática de embriões bovinos produzidos in vitro e co-cultivados com vesículas multilamelares
| dc.contributor.advisor | Nogueira, Marcelo Fábio Gouveia [UNESP] | |
| dc.contributor.advisor | Mingoti, Gisele Zoccal [UNESP] | |
| dc.contributor.advisor | Aoki, Pedro Henrique Benites | |
| dc.contributor.author | De Rossi, Hugo | |
| dc.contributor.institution | Universidade Estadual Paulista (Unesp) | |
| dc.date.accessioned | 2019-09-05T19:16:27Z | |
| dc.date.available | 2019-09-05T19:16:27Z | |
| dc.date.issued | 2019-06-28 | |
| dc.description.abstract | Embriões bovinos produzidos in vitro são mais sensíveis à preservação de células e tecidos à baixas temperaturas do que aqueles produzidos in vivo. Vários estudos têm sido conduzidos na tentativa de melhorar esse ponto crítico, e dentro desse cenário, o conteúdo lipídico intracelular e a membrana plasmática têm sido apontados como fatores determinantes para o sucesso da criotolerância. Portanto, a modificação de um ou dos dois fatores, pode minimizar a sensibilidade embrionária à criopreservação, melhorando assim as taxas de sobrevivência para essa técnica. Neste contexto, as vesículas lipídicas se apresentam como uma excelente alternativa de reposição lipídica, pois proporcionam baixa toxicidade e conseguem ser absorvidas pela membrana plasmática in vivo. Porém, até o momento não há pesquisas que avaliem o uso das vesículas lipídicas durante a produção in vitro de embriões. Portanto, o objetivo dessa dissertação foi avaliar o perfil lipídico da membrana plasmática de embriões bovinos produzidos in vitro e co-cultivados com vesículas lipídicas do tipo multilamelares (MLV). Primeiramente foi avaliado a estabilidade das vesículas lipídicas em condições de cultivo in vitro de embriões, com atmosfera, temperatura e umidade controladas. Também foi avaliado a embriotoxicidade das vesículas co-cultivadas com embriões bovinos. Para a avaliação da estabilidade foram utilizados dois meios veículos na produção das vesículas: meio de cultivo embrionário e água ultrapura, em três concentrações de vesículas: 1,0 mmol/L; 1,5 mmol/L e 2,0 mmol/L, todas as concentrações foram submetidas à dois ambientes diferentes, sem incubação (4º C) e incubadas (5% CO2 e 38,5º C) por dois períodos 24 e 48 horas. Para o teste de embriotoxicidade foram avaliados 5 grupos G1 (1,0 mmol/L), G2 (1,25 mmol/L), G3 (1,5 mmol/L), G4 (1,75 mmol/L) e G5 (2,0 mmol/L). O meio de cultivo in vitro contendo as vesículas lipídicas foi adicionado no D5, momento em que foi realizado o feeding. Os resultados obtidos pelas análises de DLS demonstraram que houve produção de vesículas utilizando meio de cultivo embrionário e que as vesículas são estáveis no ambiente de cultivo in vitro durante 24 e 48 horas. Produzindo vesículas de tamanho compatível com a zona pelúcida embrionária nos grupos meio de cultivo embrionário 1,0 mmol/L incubado por 48 horas (454,35 nm) e, meio de cultivo embrionário 2,0 mmol/L incubadas por 24 horas (380,93 nm). No teste de embriotoxicidade não houve redução na taxa de desenvolvimento embrionário (P<0,05) nos grupos co-cultivados com vesículas lipídicas G1 (43,10%), G2 (44,33%), G3 (39,85%), G4 (33,00%) e G5 (38,14%) quando comparados ao grupo controle GC (47,31%). Em conclusão, as vesículas lipídicas não apresentaram toxicidade ou letalidade quando co-cultivadas com embriões bovinos e, o meio de cultivo embrionário e ambiente controlado (incubadora) não inibiu a produção de vesículas. Posteriormente, foi avaliado o perfil lipídico da membrana plasmática de embriões bovinos produzidos in vitro e co-cultivados com vesículas lipídicas do tipo multilamelares (MLV). Para isso foram testados 4 grupos, grupo controle (GC) sem vesículas, e os grupos tratamentos G1 (1,0 mmol/L), G3 (1,5 mmol/L) e G5 (2,0 mmol/L), com vesículas. Os embriões foram submetidos ao co-cultivo com as vesículas multilamelares no quinto dia de cultivo in vitro (D5), permanecendo incubados por 48h. Os íons obtidos através da análise Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI-MS) foram submetidos a análise discriminante por mínimos quadrados parciais (PLS-DA), onde foram selecionadas 6 espécies de lipídios de acordo com sua significância, comparando os grupos extremos (GC x G5), foi possível observar que os íons tiveram maior abundância no grupo tratado (G5) em relação ao grupo controle (GC). Os íons selecionados foram atribuídos aos fosfolipídios do tipo fosfatidilcolina, 720.6 (PCe 32:0), 754.9 (PC 32:1 ou PC 34:4), 759.0 (PC 34:2) e 781.2 (PC 34:2 ou 36:5) e glicerofosfolipídios, 779.1 (PG 42:4) e 797.3 (PG 44:5). Desses íons com maior abundância pós tratamento, dois já foram relacionados com o aumento da sobrevivência pós criopreservação (PC 32:1 ou PC 34:4 e PC 34:2). Em conclusão, o co-cultivo de embriões bovinos com vesículas lipídicas multilamelares aumentou a abundância do perfil lipídico da membrana plasmática dos embriões, o que pode aumentar a resistência dos embriões à criopreservação. | pt |
| dc.description.abstract | In vitro produced bovine embryos are more sensitive to the preservation of cells and tissues at low temperatures than those produced in vivo. Several studies have been conducted to improve this critical point, and within this scenario, intracellular lipid content and plasma membrane have been pointed as determining factors for the success of cryotolerance. Therefore, modification of one or both factors may minimize embryonic sensitivity to cryopreservation, thus improving survival rates for this technique. In this context, lipid vesicles are an excellent alternative for lipid replacement, as they provide low toxicity and can be absorbed by the plasma membrane in vivo. However, to date there is no research evaluating the use of lipid vesicles during in vitro embryo production. Therefore, the aim of this dissertation was to evaluate the lipid profile of the plasma membrane of bovine embryos produced in vitro and co-cultured with multilamellar lipid vesicles (MLV). Firstly, the stability of lipid vesicles was evaluated under in vitro culture conditions of embryos, with controlled atmosphere, temperature and humidity. The embryotoxicity of vesicles co-cultured with bovine embryos was also evaluated. For the stability evaluation, two vehicle media were used in the production of vesicles: embryonic culture medium and ultrapure water, in three vesicle concentrations: 1.0 mmol / L; 1.5 mmol / L and 2.0 mmol / L, all concentrations were subjected to two different environments without incubation (4° C) and incubated (5% CO2 and 38.5° C) for two periods 24 and 48 hours. For the embryotoxicity test 5 groups G1 (1.0 mmol / L), G2 (1.25 mmol / L), G3 (1.5 mmol / L), G4 (1.75 mmol / L) and G5 were evaluated. (2.0 mmol / L). In vitro culture medium containing lipid vesicles was added at D5, at which time feeding was performed. The results obtained by DLS analysis demonstrated that vesicles were produced using embryonic culture medium and that the vesicles are stable in the in vitro culture environment for 24 and 48 hours. Producing vesicles of embryonic zona-compatible size in the 1.0 mmol / L embryonic culture medium incubated for 48 hours (454.35 nm) and 24 mmol / L embryonic culture medium incubated for 24 hours (380 .93 nm). In the embryotoxicity test there was no reduction in embryonic development rate (P <0.05) in groups co-cultivated with lipid vesicles G1 (43.10%), G2 (44.33%), G3 (39.85%). , G4 (33.00%) and G5 (38.14%) when compared to the CG control group (47.31%). In conclusion, lipid vesicles showed no toxicity or lethality when co-cultured with bovine embryos and the embryonic culture medium and controlled environment (incubator) did not inhibit vesicle production. Subsequently, the plasma membrane lipid profile of bovine embryos produced in vitro and co-cultured with multilamellar lipid vesicles (MLV) was evaluated. Four groups were tested, control group (CG) without vesicles, and treatment groups G1 (1.0 mmol / L), G3 (1.5 mmol / L) and G5 (2.0 mmol / L), with vesicles. Embryos were co-cultured with multilamellar vesicles on the fifth day of in vitro culture (D5) and incubated for 48h. The ions obtained by Matrix-assisted laser desorption / ionization analysis (MALDI-MS) were submitted to partial least squares discriminant analysis (PLS-DA), where 6 lipid species were selected according to their significance, comparing the extreme groups. (GC x G5), it was observed that the ions were more abundant in the treated group (G5) compared to the control group (CG). The selected ions were assigned to phosphatidylcholine-like phospholipids, 720.6 (PC 32: 0), 754.9 (PC 32: 1 or PC 34: 4), 759.0 (PC 34: 2), and 781.2 (PC 34: 2 or 36: 5 ) and glycerophospholipids, 779.1 (PG 42: 4) and 797.3 (PG 44: 5). Of these ions with greater abundance after treatment, two have been related to increased survival after cryopreservation (PC 32: 1 or PC 34: 4 and PC 34: 2). In conclusion, co-cultivation of bovine embryos with multilamellar lipid vesicles increased the abundance of the plasma membrane lipid profile of the embryos, which may increase embryo resistance to cryopreservation. | en |
| dc.description.sponsorship | Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) | |
| dc.description.sponsorshipId | 001 | |
| dc.identifier.aleph | 000924770 | |
| dc.identifier.capes | 33004048023P9 | |
| dc.identifier.lattes | 7384168674539702 | |
| dc.identifier.lattes | 3734933152414412 | |
| dc.identifier.orcid | 0000-0003-4701-6408 | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/11449/183428 | |
| dc.language.iso | por | |
| dc.publisher | Universidade Estadual Paulista (Unesp) | |
| dc.rights.accessRights | Acesso aberto | |
| dc.subject | Membrana plasmática | pt |
| dc.subject | Embriotoxicidade | pt |
| dc.subject | Criotolerância | pt |
| dc.title | Avaliação da composição lipídica na membrana citoplasmática de embriões bovinos produzidos in vitro e co-cultivados com vesículas multilamelares | pt |
| dc.title.alternative | Evaluation of lipid composition in the cytoplasmic membrane of bovine embryos produced in vitro and co-cultured with multilamellar vesicles | en |
| dc.type | Dissertação de mestrado | |
| unesp.advisor.lattes | 7384168674539702[3] | |
| unesp.advisor.orcid | 0000-0003-4701-6408[3] | |
| unesp.author.lattes | 3734933152414412 | |
| unesp.campus | Universidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Ciências e Letras, Assis | pt |
| unesp.embargo | 24 meses após a data da defesa | pt |
| unesp.examinationboard.type | Banca restrita | pt |
| unesp.graduateProgram | Biociências - FCLAS | pt |
| unesp.knowledgeArea | Caracterização e aplicação da diversidade biológica | pt |
| unesp.researchArea | Não consta | pt |
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