Avaliação do potencial lítico de endolisinas produzidas por fagos de Xanthomonas citri
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Data
2024-03-06
Autores
Orientador
Ferreira, Henrique 
Coorientador
Pós-graduação
Ciências Biológicas (Biologia Celular, Molecular e Microbiologia) - IB 33004137046P4
Curso de graduação
Título da Revista
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Título de Volume
Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Dissertação de mestrado
Direito de acesso
Acesso restrito
Resumo
Resumo (português)
O cancro cítrico é uma doença causada pela bactéria Gram-negativa Xanthomonas citri subsp. citri (X. citri). Essa bactéria é responsável por diversas perdas na produção de citrus. Assim o objetivo do presente trabalho foi avaliar o potencial de endolisinas de bacteriófagos como possíveis antimicrobianos anti - X. citri. Selecionamos 4 genes, dois de cada bacteriófago, para isolamento e construção de sistemas de expressão heteróloga em bactérias. Para os genes do bacteriófago CP1 não fomos capazes de realizar a amplificação por PCR de nenhum dos genes selecionados. Para os dois genes selecionados do bacteriófago CP2, conseguimos amplificar ambos, mas não observamos expressão aparente da endolisina CP2_29-His. Conseguimos, entretanto, expressar e purificar a proteína His-CP2_07. Com a caracterização estrutural por meio do dicroísmo circular (CD), observamos presença de cerca de 40,8% de alfa-hélices. Além disso, realizamos ensaios de estabilidade térmica na faixa de 20 ºC a 90 ºC, onde observamos perda de estrutura a partir dos 50 ºC. Entretanto, com o resfriamento da amostra, observamos um possível ganho de estrutura ocasionado por provável re-enovelamento da proteína. Avaliamos a atividade enzimática da endolisina, onde observamos a degradação de fragmentos celulares de Pseudomonas aeruginosa, bem como degradação do peptidoglicano purificado de Bacillus subtilis. Observamos também ação bactericida da endolisina em X. citri, bem como de outros isolados de interesse clínico (P. aeruginosa e E. coli). Avaliamos também a lise celular de X. citri tratadas com a His-CP2_07 e EDTA 0,375 mM. Estabelecemos a estabilidade de nossa endolisina em pHs próximos ao neutro ou levemente alcalinos e salinidades próximas de 60 mM. Desta forma, nossos resultados demonstram o potencial bactericida de His-CP2_07 contra X. citri e abre caminho para o desenvolvimento de formulações alternativas para controle desta bactéria, bem como de outras bactérias de interesse clínico.
Resumo (inglês)
Citrus canker is a disease caused by the Gram-negative bacterium Xanthomonas citri subsp. citri (X. citri). This bacteria is responsible for several losses in citrus production. Thus, the objective of the present work was to evaluate the potential of bacteriophage endolysins as possible anti-X. citri antimicrobials. We selected 4 genes, two from each bacteriophage, for isolation and construction of heterologous expression systems in bacteria. For the CP1 bacteriophage genes, we were unable to perform PCR amplification of any of the selected genes. For the two genes selected from bacteriophage CP2, we were able to amplify both, but we did not observe apparent expression of the CP2_29-His endolysin. We were, however, able to express and purify the His-CP2_07 protein. With structural characterization using circular dichroism (CD), we observed the presence of around 40.8% alpha-helices. Furthermore, we carried out thermal stability tests in the range of 20 ºC to 90 ºC, where we observed loss of structure from 50 ºC onwards. However, as the sample cooled, we observed a possible gain in structure caused by probable refolding of the protein. We evaluated the enzymatic activity of endolysin, where we observed the degradation of cellular fragments of Pseudomonas aeruginosa, as well as degradation of peptidoglycan purified from Bacillus subtilis. We also observed the bactericidal action of endolysin in X. citri, as well as other isolates of clinical interest (P. aeruginosa and E. coli). We also evaluated cell lysis of X. citri treated with His-CP2_07 and 0.375 mM EDTA. We established the stability of our endolysin at pHs close to neutral or slightly alkaline and salinities close to 60 mM. Thus, our results demonstrate the bactericidal potential of His-CP2_07 against X. citri and paves the way for the development of alternative formulations to control this bacterium, as well as other bacteria of clinical interest.
Descrição
Palavras-chave
Idioma
Português