Araraquara - FCF - Faculdade de Ciências Farmacêuticas

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Desenvolvimento de modelos tridimensionais para o estudo da patogênese do biofilme de Cryptococcus neoformans
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-11-21) Gualque, Marcos William de Lima ; Fusco-Almeida, Ana Marisa ; Echeverri, Carolina Rodriguez ; UNESP ; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Os principais agentes causadores da Criptococose são o Cryptococcus neoformans e o Cryptococcus gattii, considerados de alta prioridade pela OMS (Organização Mundial da Saúde). Esse fungo possui diversos fatores de virulência, dentre estes a capacidade de formar biofilmes, tornando-se, portanto, de grande interesse para a saúde pública. Culturas tridimensionais (3D) buscam mimetizar mais fielmente o tecido in vivo. Diante dos efeitos adversos dos medicamentos antimicrobianos e a crescente resistência microbiana, é evidente a busca por novos medicamentos. O objetivo deste trabalho foi desenvolver modelos de coculturas tridimensionais para investigar a interação entre C. neoformans e o hospedeiro, com ênfase na análise dos fatores de virulência do biofilme da cepa C. neoformans H99. Adicionalmente, avaliar o potencial antifúngico de peptídeos derivados de Galleria mellonella contra Cryptococcus sp em condições de planctônico e biofilme, bem como sua toxicidade in vitro e in vivo. Os cocultivos 3D foram desenvolvidos a partir de linhagens pulmonares e cerebrais e caracterizados utilizando imagens de microscopia, análises morfológicas e técnicas de viabilidade celular por azul de trypan e resazurina. Os esferoides formados pelos cocultivos de linhagens pulmonares e cerebrais mantiveram viabilidade acima de 70% até o sétimo dia de análise, além de se manterem íntegros fisicamente e demonstrando proliferação celular ao longo do tempo avaliado. O cocultivo 3D pulmonar foi infectado com células planctônicas e oriundas de biofilme, e a análise da expressão gênica foi feita por PCR em tempo real. Os resultados sugeriram que células oriundas do biofilme de H99 exibem uma resposta metabólica e virulenta mais intensa, com destaque para a alta expressão de enolase e aminopeptidase, sugerindo maior adaptação e invasividade ao ambiente hostil do hospedeiro. Também foram realizados ensaios de concentração inibitória mínima (CIM) e concentração fungicida mínima CFM) com peptídeos antimicrobianos na forma planctônica das cepas de Cryptococcus. O peptídeo PepM2 apresentou perfil fungicida contra as espécies de Cryptococcus, com concentrações variando de 31,25 a 250 µg/mL. PepM1 e PepM5 não inibiram as leveduras de Cryptococcus spp. na maior concentração testada O biofilme foi caracterizado utilizando o ensaio de redução do sal tetrazólico (XTT), microscopia eletrônica de varredura, microscopia confocal e sua biomassa foi quantificada pelo método Cristal violeta. Na caracterização dos biofilmes, observou-se alta atividade metabólica no biofilme maduro (48h) pelo método de XTT, o que está de acordo com o aumento da biomassa avaliada por cristal violeta e pelas análises microscópicas. Não foi observada atividade antibiofilme para nenhum dos peptídeos, tanto na inibição da formação do biofilme maduro quanto na pré-adesão. Ademais, a citotoxicidade foi avaliada nos esferoides e em cultivos monocamadas por meio da adição de resazurina, e a toxicidade in vivo do peptídeo foi avaliada em G. mellonella. Nos ensaios de citotoxicidade nos modelos 3D e de toxicidade em G. mellonella, o peptídeo PepM2 demonstrou baixa toxicidade tanto em testes in vitro quanto in vivo. No geral, os resultados sugerem que peptídeos derivados e modificados estruturalmente de G. mellonella são promissores para o tratamento da criptococose não associada à formação de biofilmes deste fungo e que os modelos esferoides desenvolvidos e avaliados são bons modelos para estudos da interação fungo-hospedeiro, bem como para estudos pré-clínicos de segurança toxicológica.
Avaliação in vitro das alterações de fibras capilares submetidas a alisantes oxirredutores associados à coloração
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-10-17) Abelan, Ursulandréa Sanches ; Chin, Chung Man ; Lima, Rosana Ribeiro de Castro Lima ; Universidade Estadual Paulista (Unesp) ; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O cabelo é parte importante da saúde humana para identificação da autoimagem e manutenção da autoestima, além de ser considerado um marcador de saúde geral do organismo. Para manter as condições saudáveis do couro cabeludo, a qualidade, segurança e eficácia das formulações cosméticas são de vital importância. Além da saúde, a beleza também faz parte e a transformação tanto da cor quanto da forma dos cabelos tem sido cada vez mais desejada pelos consumidores, principalmente entre as mulheres. A indústria cosmética tem crescido muito nesta categoria o que faz com que pesquisas sobre estes temas sejam cada vez mais necessárias. Sendo assim, nesta pesquisa, avaliou-se as alterações causadas pelos alisamentos alcalinos de tioglicolato de amônio e amino metilpropanol, seguidos de coloração permanente. Para isso, utilizamos técnicas como a Espectroscopia na Região do Infravermelho (FTIR), medidas de brilho, Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), Microscopia Confocal e de Fluorescência para avaliar as alterações causadas à superfície da fibra capilar, ou seja, a cutícula. Utilizamos também a Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) e Termogravimetria (TG), testes de tração e medidas de diâmetro para avaliar as alterações causadas ao córtex, região mais interna que é responsável pelas transformações da cor e forma dos cabelos. Os resultados de FTIR, DSC, resistência à tração e TG evidenciaram que tanto a coloração quanto o alisamento promoveram alterações à cutícula quanto ao córtex das fibras capilares, como a oxidação de bandas características da superfície quanto a desnaturação das cadeias de alfa-queratina presentes no córtex. Enquanto os resultados de MEV, diâmetro, microscopia confocal, de fluorescência e brilho, evidenciaram alterações na região mais externa dos fios (cutícula). Sendo assim, esta associação de técnicas permitiu investigar as mudanças físico-químicas que ocorrem em fibras capilares submetidas a estes procedimentos.
Estudo dos efeitos de nanoemulsões de curcumina e piperina sobre a produção de lipopartículas do vírus da hepatite C e controle das vias de apoptose reguladas pela fosfoproteína NS5A em sistema In Vitro
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-06-28) Brito, Lorrane Davi ; Costa, Paulo Inácio da ; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A hepatite C é uma doença inflamatória crônica, causada pelo vírus HCV, o qual acomete milhares de pessoas em todo o mundo. O processo inflamatório crônico causado pela hepatite C pode acarretar em quadros clínicos mais graves, como cirrose e carcinoma hepatocelular. Os tratamentos disponíveis no mercado são eficientes quanto a negativação da carga viral, entretanto, além de causarem efeitos colaterais também são ineficazes quanto ao controle do processo inflamatório, caracterizando-se como o fator mais problemático da doença atualmente. Neste contexto, os compostos naturais bioativos (CNBs), curcumina e piperina, podem apresentar-se como uma possível alternativa, atuando como adjuvantes aos tratamentos já estabelecidos, potencializando os efeitos terapêuticos e contribuindo na diminuição dos efeitos adversos, além de controlar o processo inflamatório. O objetivo deste estudo foi analisar os mecanismos e vias moleculares importantes para a replicação e montagem viral, via SMAD 6, SMAD 7 e VAP-A, além das vias relacionadas à inibição da apoptose, HIF-1 α e p62, todas relacionadas à fosfoproteína NS5A, e dessa forma, comparar os resultados de células não infectadas (Huh 7.5) com as células infectadas por HCV (SGR-JFH1). Afim de melhorar a biodisponibilidade dos compostos naturais, foi utilizado um sistema de entrega de nanoemulsão. A fosfoproteína NS5A não respondeu aos tratamentos com CNBs, enquanto as proteínas HIF-1α e p62 não foram detectadas por western blotting, impossibilitando a determinação dos resultados em células Huh 7.5 e SGR-JFH1. Através das análises de PCR em tempo real foi observado que ambos os CNBs, com ou sem nanoemulsão, diminuíram significativamente a carga viral do HCV, não apresentando diferenças significativas entre si. Além disso, também foi testado o efeito do sistema de nanoemulsão sem os compostos naturais, que gerou um aumento da carga viral em células SGR-JFH1. Os resultados demonstraram que ambos os tratamentos surtiram o mesmo efeito na análise de PCR em tempo real, em células Huh 7.5 e SGR-JFH1, sobre as expressões das SMAD 6, exceto os CNBs sem nanoemulsão, que elevou a expressão da smad em questão na SGR-JFH1. Apenas os compostos não emulsionados aumentaram a expressão da SMAD 7 e VAP -A em SGR-JFH1. A nanoemulsão sem CNBs elevou significativamente a expressão de SMAD 6, porém o mesmo não ocorreu com a SMAD 7 e VAP-A. A nanoemulsão também não apresentou efeito sobre a apoptose, enquanto que os CNBs com ou sem o sistema de nanoemulsão demonstraram entre 30 e 40% de apoptose tanto em células Huh 7.5 quanto em SGR-JFH1.
Micropartículas de amido retrogradado carregadas com nanopartículas de sílica mesoporosas destinadas à liberação colônica de mesalazina para o tratamento das doenças inflamatórias intestinais
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-06-28) Tavares Junior, Alberto Gomes ; Chorilli, Marlus ; Meneguin, Andréia Bagliotti ; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O ácido 5-aminosalicílico (5ASA), é um anti-inflamatório não esteroidal, considerado o tratamento de primeira escolha para os estágios leves a moderados de doenças inflamatórias intestinais. Geralmente, são necessárias doses muito altas de 5ASA devido à absorção sistêmica rápida e quase completa na porção intestinal superior, dificultando o alcance dos níveis locais do fármaco na mucosa colônica inflamada. Nesse trabalho, sistemas para a via oral, baseados em nanopartículas de sílica mesoporosas (NSMs) carregadas com 5ASA e incorporadas em micropartículas de amido retrogradado/pectina (MPs AR/P) foram desenvolvidos como um sistema para a liberação cólon-específica de 5ASA, visando uma alternativa para o tratamento local de doenças intestinais inflamatórias. As NSMs contendo 5ASA (NSMs@5ASA) apresentaram diâmetro médio de 109±4,80 nm, índice de polidispersão de 0,2177±0,003, potencial zeta (PZ) de -25±0,781 mV e forma esférica. A eficiência de encapsulação do 5ASA nas NSMs variou entre 85,52 e 93,19%. Ensaios de mucoadesão demonstraram que as NSMs@5ASA apresentaram capacidade mucoadesiva, evidenciado pela mudança nos valores de PZ em contato com a mucina. Os ensaios de viabilidade celular indicaram que as NSMs com e sem fármaco não foram tóxicas para células da linhagem Caco-2. As NSMs e NSMs@5ASA foram caracterizadas com sucesso por análise físico-química, as análises térmicas sugeriram melhora na estabilidade do fármaco incorporado no sistema. As MPs AR/P carregadas com NSMs@5ASA foram obtidas pelo método de reticulação iônica utilizando o Ca2+. Os sistemas nano-em-micro apresentaram diâmetro na faixa de 1386 a 1565 μm e elevada circularidade. O formato esférico das micropartículas e a eficiência na incorporação das NSMs@5ASA confirmados. Os estudos de liberação in vitro do 5ASA revelaram que o sistema de encapsulamento nano-em-micro proporcionou um controle mais preciso das taxas de liberação do 5ASA, com uma redução significativa da liberação em meio estomacal. Esse resultado é especialmente promissor, pois sugere uma proteção eficaz do fármaco contra a degradação no estômago. Com base nesses dados, as micropartículas compostas de amido retrogradado e pectina mostram-se promissoras para direcionar as NSMs@5ASA ao cólon, quando administradas por via oral. Os resultados deste trabalho oferecem uma contribuição valiosa para o avanço no tratamento de doenças inflamatórias intestinais.
Desenvolvimento de uma nova geração de produtos para alisamento capilar contendo diferentes associações de ingredientes ativos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-08-02) Martins, Celso Junior ; Chin, Chung Man ; Lima, Cibele Rosana Castro ; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Há mais de três décadas a indústria cosmética mundial aponta o Brasil como precursor de novas técnicas e produtos para redução de volume e alisamento capilar. As últimas indicações de produtos para este fim são descendentes do uso irregular do formaldeído, do glutaraldeído e, mais recentemente, do ácido glioxílico e suas derivações. Estes últimos foram proibidos pela Resolução RDC 409/2020 da ANVISA, em decorrência de sua toxicidade. A busca por novas formulações e ativos alisantes e redutores de volume dos cabelos tem motivado investimentos pela indústria, prevendo um novo ciclo mercadológico marcado pela difusão de recentes pesquisas e muito conhecimento nesta área. Além disso, a literatura disponível sobre esse tema ainda é bastante escassa. Assim, este trabalho visou comparar diferentes componentes ativos para o desenvolvimento de uma nova geração de modificadores de formas e texturas dos cabelos, além da avaliação de dano capilar e eficácia alisante. Para tanto, dez grupos de mechas submetidas a diferentes tratamentos foram comparados (incluindo um grupo virgem e um descolorido, e duas versões com diferentes concentrações de ativos e diferentes faixas de pH dos produtos alisantes) por ensaios com imagens, de resistência mecânica, térmica, morfologia cuticular, brilho capilar e diâmetro da fibra. Os resultados obtidos permitiram destacar o desempenho dos Grupos G03 (tioglicolato de amônio 13,3%) e G09 (associação do tioglicolato de amônio com tioglicolato de sódio 2%), pelo maior potencial de alisamento destas preparações. Também se notou o bom desempenho dos Grupos G05 e G06 (tioglicolato de aminometil propanol, respectivamente a 12,5% e a 7,9%) quanto ao potencial de preservação da fibra capilar, acompanhado de mesmas concentrações poliméricas, comum a todos os Grupos, na emulsão carreadora, com faixa de pH mais baixa (entre 7,5 e 8,5) do que todas as demais versões propostas, quanto ao processo de modificação de formas e texturas dos cabelos. Isso permite destacar e priorizar o uso/aplicação destes ativos nas formulações idealmente para cabelos mais finos, menos resistentes, mais fragilizados e/ou já processados anteriormente por outros procedimentos. Por fim, os Grupos G07 e G08 (cisteamina de sódio a 5% e a 4% respectivamente) apresentaram particular capacidade de interferência no comportamento térmico dos cabelos, com eventos endotérmicos precoces, o que sugere maior conveniência do uso destas substâncias para modelagens e definição dos cabelos em processos de melhoria e correções da textura. Estes grupos também apresentaram bom ganho de diâmetro pós procedimento (apesar de sua faixa de pH entre 11,0 e 13,0), atribuível à influência da associação polimérica padrão aplicada na emulsão base e uma interferência mais externa (entre camadas de cutículas), conforme as imagens destacadas pela microscopia de fluorescência. A pesquisa possibilitou mostrar melhores formas de aplicação para cada substância nas concentrações e pH propostos, considerando mesma associação polimérica para todos os Grupos, capazes de controlar a cinética de liberação de cada ativo, assim como de promover a adesão de um revestimento polimérico para o ganho de diâmetro e o aumento da resistência à tração, com diminuição de quebra em máquina de ciclos térmicos.
Desvendando os impactos das nanopartículas de ZnO e ZnS em bactérias formadoras de biofilme: insights sobre genes reguladores, respostas metabólicas e alterações morfológicas em Staphylococcus aureus, Klebsiella oxytoca e Pseudomonas aeruginosa por avaliações in vitro e in vivo
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-06-26) Fulindi, Rafael Bianchini ; Costa, Paulo Inacio da ; Favorin, Leila Aparecida Chiavacci ; University of Florida
Introdução: A formação de biofilme é uma estratégia de sobrevivência empregada por certas bactérias para prosperar em condições adversas, promovendo a resistência antimicrobiana. Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella oxytoca são patógenos notáveis que produzem biofilme. As nanopartículas, especificamente o óxido de zinco (ZnO) e o sulfeto de zinco (ZnS), estão surgindo como agentes antimicrobianos promissores devido à sua eficácia contra bactérias e biofilmes. Objetivo: investigar o impacto das nanopartículas de óxido de zinco e sulfeto de zinco no crescimento de S. aureus Gram-positivo e P. aeruginosa e K. oxytoca Gram-negativo, bem como na formação de biofilme. Foram realizadas análises de expressão gênica e experimentos in vivo usando um modelo de ferida cutânea murina. Métodos: As suspensões bacterianas em meio líquido Müller-Hinton foram tratadas com várias concentrações de nanopartículas de ZnO e ZnS por 24 horas a 37°C. A viabilidade celular foi avaliada usando o ensaio XTT. As concentrações inibitórias mínimas foram determinadas e os efeitos inibitórios sobre a formação de biofilme foram confirmados por meio de microscopia eletrônica de varredura e microscopia confocal de varredura a laser. A análise de PCR foi realizada para avaliar o efeito das nanopartículas nos perfis de expressão gênica bacteriana. Os experimentos in vivo envolveram a criação de feridas padronizadas em camundongos BalbC, com algumas feridas tratadas com nanopartículas. Os tecidos das feridas foram analisados quanto à carga bacteriana e às alterações histológicas. Resultados: Tanto as nanopartículas de óxido de zinco quanto as de sulfeto de zinco apresentaram efeitos inibitórios na formação de biofilme bacteriano. Notavelmente, o ZnS demonstrou eficácia superior em comparação com o ZnO, particularmente em concentrações mais baixas. A análise de PCR revelou uma regulação negativa significativa da expressão gênica em Pseudomonas aeruginosa tratada com nanopartículas ZnS. Estudos in vivo em camundongos BalbC corroboraram essas descobertas, mostrando uma carga bacteriana reduzida e resultados histológicos favoráveis em feridas tratadas com nanopartículas. Conclusão: As descobertas apoiam as possíveis aplicações de nanopartículas de sulfeto de zinco em vários contextos, incluindo preservação industrial de alimentos, dispositivos médicos e curativos de feridas, onde a formação de biofilme representa um risco de infecção.
Nano-in-nano containing curcumin and benzydamine hydrochloride for the treatment of vulvovaginal candidiasis: from development to biological application in vitro and in vivo
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-07-17) Carvalho, Gabriela Corrêa ; Chorilli, Marlus ; Santos, Hélder Almeida ; Bauab, Tais Maria ; Peterson, Brandon W. ; Sábio, Rafael Miguel ; University of Groningen
Nesta tese buscou-se o desenvolvimento de uma formulação para o tratamento de candidíase vulvovaginal (CVV) causada por cepa resistente associando produtos de origem natural e nanotecnologia. Entretanto, para se chegar na formulação ideal vários degraus foram necessários. Após a apresentação da temática da tese (Capítulo 1) iniciou-se com o cálculo estimado da prevalência desta doença no Brasil por meio de uma revisão sistemática da literatura com meta-análise, Capítulo 2, a fim de suprir esta lacuna uma vez que faltam dados oficiais no país. Na sequência, em se tratando se cepas resistentes de Candida a C. auris não poderia não ter sido mencionada, uma vez que além de seus problemas de resistência, mencionados no Capítulo 3, ainda foi a causa de casos de infecções vaginais. Na sequência, nos Capítulos 4 e 5 foi apresentado as características físico-química e biológica do licopeno, uma molécula dita como promissora pela literatura. Uma vez que não foi encontrado estudos na literatura associando este produto de origem natural com nanopartículas inorgânicas, no Capítulo 6 foi abordado questões inerentes a aplicação da nanopartícula de sílica mesoporosa (NSM), nanopartícula de escolha desta tese, para o tratamento de doenças infecciosas. Nos dois Capítulos subsequentes, 7 e 8 o desenvolvimento farmacotécnico do licopeno incorporado na NSM, sua atividade antifúngica e toxicidade em modelo in vivo de larvas de Galleria Mellonella foram estudados. Em vista dos resíduos de matéria orgânica de brometo de cetiltrimetilamônio observados nas análises de FTIR no Capítulo 9 foi abordado em detalhes sobre os aspectos gerais deste surfactante e sua toxicidade em células procarióticas e eucarióticas. Uma vez que o licopeno não apresentou atividade antifúngica (nem livre nem incorporado) e anti-inflamatória (Anexo 1) o foco do estudo recaiu sobre outro produto natural também considerado promissor, a curcumina, sujas características físico-químicas e biológicas foram abordadas em detalhes no Capítulo 10. Para esta nova estratégia, este fármaco foi combinado em uma nanopartícula hibrida com o cloridrato de benzidamina, um anti-inflamatório com atividade antifúngica muito utilizado para o tratamento de patologias vaginais. O desenvolvimento farmacotecnológico e a avaliação de sua atividade biológica in vitro e in vivo foi abordada em detalhes no Capítulo 11. Por fim, no Capítulo 12 foi abordado sobre o comportamento termorresponsivo do poloxamer, comportamento este explorado para a aplicação do nanosistema in vivo no capítulo anterior.
Desenvolvimento de pontos quânticos à base de ferro e zinco para aplicações de bioimagem por fluorescência e ressonância magnética
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-06-29) Barbosa, Thúlio Wliandon Lemos ; Chiavacci, Leila Aparecida ; Lemaire, Laurent ; Université d'Angers
Devido à toxicidade associada a compostos inorgânicos como cádmio e gadolínio, a seleção de agentes de contraste para diagnóstico é crucial. Compostos à base de zinco e ferro surgiram como alternativas potenciais devido à sua abundância, baixo custo e baixa toxicidade. O óxido de zinco (ZnO) oferece alta luminescência devido ao seu alto rendimento quântico, enquanto o óxido de ferro (IO) exibe propriedades de relaxividade adequadas para ressonância magnética. Este projeto visa sintetizar e explorar as propriedades luminescentes e magnéticas de agentes de contraste à base de ferro e zinco para aplicações potenciais de imagem diagnóstica. Compostos incluindo ZnO, IO, cobre-índio-zinco-enxofre/sulfeto de zinco (CIS/ZnS) e óxido de zinco dopado com ferro (FeZnO) foram obtidos e incorporados em um copolímero de ácido poliláctico-glicólico (PLGA) visando aumentar a sua estabilidade em meios biológicos. A caracterização dos sistemas poliméricos foi realizada usando espalhamento dinâmico de luz (DLS) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM). As propriedades ópticas foram examinadas por meio de espectros de absorção e fluorescência, enquanto as propriedades magnéticas foram quantificadas por meio de medidas de tempo de relaxação transversal e longitudinal. O primeiro sistema foi avaliado baseado em nanopartículas de PLGA, contendo ZnO e IO. Em uma proporção de PLGA:ZnO:IO de 10:6:1 foi possível obter um agente de contraste duplo com emissão em 540 nm ao ser excitado em 343 nm e um forte efeito T2 com uma relaxividade r2 de 171 mmol L-1 s-1 a 7 teslas. O tamanho das nanopartículas determinado por DLS foi de aproximadamente 200 nm com um PDI abaixo de 0,3, enquanto as partículas de ZnO e IO incorporadas tinham cerca de 4 nm e 8 nm, respectivamente. A investigação de um segundo agente de contraste envolvendo a dopagem das nanopartículas de ZnO com ferro revelou que uma concentração molar de Fe entre 0,1 e 1,0% e um tempo de adição de dopante de 30 minutos produziram material luminescente com emissão em 540 nm quando excitado a 343 nm, com tamanhos de nanopartículas de aproximadamente 4 nm. As propriedades magnéticas exibiram propriedades de relaxação T1 e T2, com uma relaxividade de r2 = 18,47 mmol L-1 s-1 e r1 = 1,79 mmol L-1 s-1 a 7T para a amostra FeZnO0.1. A investigação de um terceiro agente de contraste baseado em compostos de cobre-índio-zinco-enxofre revelou que as nanopartículas dopadas com Fe e sistemas núcleo-casca perderam suas propriedades de luminescência. No entanto, a coencapsulação de agentes de contraste à base de cobre-índio-zinco-enxofre e óxido de ferro dentro do polímero PLGA resultou na produção de um sistema caracterizado por uma forte emissão a 650 nm ao ser excitado a 365 nm e 525 nm, bem como propriedades magnéticas exibindo um efeito T2 a 7T. No geral, este estudo destaca o potencial de agentes de contraste à base de ferro e zinco para aplicações de imagem diagnóstica.
Impactos do tratamento com extrato rico em bixina e/ou metformina carreados em nanoemulsões sobre biomarcadores fisiometabólicos e do estresse glico-oxidativo em sistema-modelo in vivo de obesidade.
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-09-08) Pinheiro, Camila Graça ; Baviera, Amanda Martins
A obesidade e o diabetes mellitus tipo 2 são caracterizados por resistência à insulina e intolerância à glicose, contribuindo para a hiperglicemia. A hiperglicemia crônica leva ao aumento nas taxas de glicação de biomoléculas e acelera a geração dos produtos finais de glicação avançada (AGEs) e das espécies reativas de oxigênio (ERO), o quais estão envolvidos no desenvolvimento das complicações crônicas dessas doenças. É grande a importância da prospecção de tratamentos que sejam capazes de controlar a glicemia, bem como reduzir os impactos deletérios do estresse glico-oxidativo. Este trabalho propôs a investigação dos impactos do tratamento de camundongos em sistema-modelo de obesidade/resistência à insulina com extrato de Bixa orellana L. rico em bixina ou metformina, sozinhos ou co- administrados, preparados em um sistema lipídico nanoestruturado, avaliando parâmetros fisiometabólicos, biomarcadores relacionados ao estresse glico-oxidativo e atividade antioxidante. Os animais foram divididos em 8 grupos (n=12): animais em dieta padrão (P), animais em dieta hiperlipídica (HL) e que receberam por gavagem água ou veículo (HL e V), animais em dieta HL tratados com metformina (M, 50 mg/kg) e/ou extrato rico em bixina (B1: 5,5 mg/kg, B2: 11 mg/kg), sozinhos ou combinados (MB1 e MB2). Os animais receberam as dietas por 17 semanas, e foram tratados durante as últimas 8 semanas de experimento. Animais HL e V desenvolveram obesidade, em decorrência do aumento observado na ingestão energética, bem como resistência à insulina e intolerância à glicose, em relação aos animais do grupo P. Animais HL e V apresentaram alterações no perfil lipídico, com aumentos nos níveis plasmáticos de colesterol total e HDL-colesterol. Foram observadas elevações nos níveis de AGEs fluorescentes (biomarcadores de glicação avançada) e de TBARS (biomarcadores de peroxidação lipídica) no plasma, fígado e rins de animais HL e V. Em animais HL e V, houve diminuição nas atividades as enzimas antioxidantes PON 1 (plasma), SOD, CAT e GSH-Px (fígado) e SOD e CAT (rins). Em animais mantidos em dieta HL e tratados com metformina ou extrato rico em bixina (5,5 e 11 mg/kg), sozinhos ou combinados, houve diminuição no ganho de peso corporal, sem diminuição na ingestão energética. Os tratamentos também foram capazes de melhorar a tolerância à glicose e a sensibilidade à insulina. A terapia combinada entre metformina + bixina melhorou os níveis de TBARS no plasma e a atividade de PON 1. No fígado e nos rins, metformina + bixina diminuiu os níveis de AGEs e TBARS, e aumentou as atividades de todas as enzimas antioxidantes. Em de animais HL, tratados ou não com metformina e/ou bixina, não foram observadas diferenças nos níveis proteicos de AGE-R1 e GLO 1 (componentes pertencentes aos sistemas de detoxificação dos produtos avançados da glicação). Em tecido adiposo branco epididimal, houve um aumento dos níveis de PPARγ em animais tratados com bixina (5,5 e 11 mg/kg). Os tratamentos com metformina e/ou bixina apresentam significativo potencial para o controle das complicações advindas do quadro de obesidade, especialmente aquelas relacionadas ao estresse glico-oxidativo, bem como parece melhorar a função adipocítica via promoção de aumento na expressão de PPARγ.
Micropartículas contendo nanopartículas de trans-resveratrol aplicadas ao tratamento de infecções por Helicobacter pylori
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-04-25) Spósito, Larissa ; Chorilli, Marlus ; Bauab, Taís Maria ; Meneguin, Andréia
O Helicobacter pylori (H. pylori) é um microrganismo diretamente ligado às condições clínicas graves que afetam o estômago. Os fatores de virulência e sua capacidade de formar biofilmes aumentam a resistência aos antibióticos convencionais, necessitando de novas substâncias e estratégias para o tratamento da infecção por esse patógeno. O trans-resveratrol (RESV), um polifenol bioativo de origem natural e tem potencial atividade contra esse patógeno gástrico. Considerando que o tempo de permanência das formas farmacêuticas convencionais no trato gastrointestinal é um dos principais fatores que prejudicam a biodisponibilidade dos fármacos, os sistemas de liberação gastrorrententivos estão sendo empregados com o intuito de aumentar o tempo de ação do fármaco no estômago, de forma a melhorar o sítio de ação específico. O objetivo desse estudo foi desenvolver micropartículas (MPs) compostas por ácido hialurônico (AH) e alginato de sódio (AS) visando a microencapsulação de nanopartículas (NPs) de quitosana (QTS) contendo RESV. Primeiramente foram desenvolvidas NPs pelo método de geleificação ionotrópica utilizando QTS e tripolifosfato de sódio (TPP) para encapsulação do RESV, as quais caracterizadas por Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS), Análise de Rastreamento de Nanopartículas (NTA), Microscopia Eletrônica de Transmissão Criogênica (Cryo – TEM). Posteriormente foram obtidas MPs por spray drying e caracterizadas utilizando Microscopia eletrônica de Varredura (MEV). A eficiência de encapsulamento (EE) e a taxa de liberação in vitro do RESV foram quantificadas por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). O desempenho das formulações contra H. pylori foi avaliado pela quantificação das concentrações inibitórias/bactericidas mínimas (MIC/MBC), tempo de morte, alterações na morfologia do H. pylori em sua forma planctônica, efeitos contra o biofilme de H. pylori, em modelo de infecção in vitro e in vivo, além do ensaio de gastroproteção in vivo. A citotoxicidade foi avaliada contra linhagens celulares AGS e MKN-74 e por ensaio de hemólise. A toxicidade aguda foi testada utilizando ensaios em Galleria mellonella. Os dados obtidos demonstraram que as NPs obtidas usando a concentração de QTS (2mg/mL) e de TPP (1 mg/mL) na proporção de QTS:TPP (2,5:1, B-NP) foram bem sucedidas em relação ao diâmetro hidrodinâmico médio (DHM), com valores de 154,2 nm, índice de polidispersão (IPD; 0,24) e potencial zeta (PZ; 22,6 mV). Os dados demonstraram que a adição do RESV (RESV-NP) alterou tanto o DHM (145,3 nm) quanto o IPD (0,28) das amostras e diminuiu o PZ (16,9 mV). As fotomicrografias obtidas por MET e MEV evidenciaram que tanto as RESV-NP, as MPs com RESV (RESV-MP) e as micro nanopartículas contendo RESV (RESV-MNP) apresentaram morfologia aproximadamente esférica e típica, com diâmetro ~ 153,2 nm, ~ 12 µm e ~ 2 µm respectivamente. A EE de RESV-NP foi de 72%, enquanto que para RESV-MP foi de 87,7% e 79,99% para RESV-MNP. No ensaio de liberação in vitro em meio gástrico as RESV-NP liberaram o fármaco incorporado logo nos primeiros 5 minutos de avaliação. Por sua vez, RESV-MP e RESV-MNP liberaram cerca de 41% do RESV nas primeiras 24 h, demonstrando um perfil de liberação prolongado das MPs comparado ao fármaco livre (100% em 30 minutos). Além disso RESV-NP e RESV-MP mostraram interação com a mucina de porco em ambiente gástrico, demonstrando importante caráter mucoadesivo. No ensaio de citotoxicidade, RESV-NP e RESV-MNP não demonstraram caráter tóxico na concentração de CIM para ambas as linhagens celulares (AGS e MKN-74) o que também foi encontrado no ensaio de toxicidade aguda em modelo alternativo de G. mellonella. Nos ensaios microbiológicos, o RESV-NP e RESV-MNP apresentaram CIM/MBC de 3,9 µg/mL enquanto RESV-MP CIM/CBM de 125 µg/mL. A erradicação completa da H. pylori ocorreu após 24 h para todas as formulações. Na concentração de 2xMIC (7,8 µg/mL), RESV-NP, RESV-MP e RESV-MNP erradicaram completamente o biofilme de H. pylori. Em modelo de infecção in vitro, RESV-NP, RESV-MP e RESV-MNP mostraram diminuição significativa na carga bacteriana quando comparado ao controle H. pylori J99. No ensaio de infecção in vivo utilizando G. mellonella, todas as formulações agiram efetivamente diminuindo a taxa de morte das larvas infectadas. RESV-MNP apresentou efeito gastroprotetor, uma vez que foi eficaz em diminuir a extensão e gravidade das lesões causadas por indometacina. Desta forma, pode-se concluir que as MPs contendo NPs de RESV mostraram-se promissoras no efeito gastroprotetor, sendo uma alternativa promissora em infecções causadas por H. pylori.
Planejamento, síntese e avaliação farmacológica de derivados de ácidos borônicos como inibidores da protease principal de SARS-COV-2
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-03-28) Lopes, Juliana Romano ; Santos, Jean Leandro dos
O SARS-CoV-2, causador da COVID-19, é um vírus do gênero β-coronavírus identificado em 2019. Até o mês de Agosto de 2023 estima-se mais de 769 milhões de casos confirmados de COVID-19 e mais de 6 milhões de mortes relacionadas a infecção por esse novo coronavírus no mundo. Com aprovação das vacinas, a letalidade da COVID-19 diminuiu consideravelmente atingindo atualmente um patamar de 1,9%, mas a infecção pelo vírus ainda é comum mesmo em pessoas com esquema vacinal completo. A grande circulação do vírus causa também o aparecimento de diferentes cepas, que pode representar uma preocupação futura. Poucas intervenções terapêuticas são possíveis para o tratamento da COVID-19. O Paxlovid, um dos únicos medicamentos efetivos contra o vírus foi aprovado recentemente no Brasil, mas ainda apresenta incertezas frente ao seu uso no tratamento de casos severos. O planejamento e desenvolvimento de novos compostos antivirais frente a SARS-CoV-2 e outros coronavírus é de grande importância para que haja diferentes alternativas para o tratamento da COVID-19, bem como, no aparecimento de novos vírus desse gênero. A protease principal desses coronavírus (3CLpro) é essencial para as etapas de replicação viral e constituí um alvo potencial para o planejamento de compostos ativos. O composto FL-166, identificado em estudos frente ao vírus SARS-CoV, demonstrou um valor potente de Ki = 40 nM. Com base em sua estrutura química, derivados de ácidos borônicos foram planejados com uso de docking molecular e sintetizados. Dos 34 compostos sintetizados, 16 foram avaliados em estudos de inibição enzimática frente as proteases 3CLpro e PLpro de SARS-CoV-2 e apresentaram atividade de inibição <5%, com isso, não foram selecionados para determinação de IC50. Dessa forma, conclui-se que os derivados de ácidos borônicos neste estudo foram inativos frente a inibição do alvo proposto.
Aspectos afetivos, cognitivos e volitivos da atitude alimentar
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-02-22) Martins, Bianca Gonzalez ; Campos, Juliana Alvares Duarte Bonini
Introdução: A atitude alimentar representa o relacionamento do indivíduo com sua alimentação e pode ser investigado a partir de aspectos afetivos que se referem à influência das emoções no processo alimentar, cognitivo, que envolve o processamento de informações (motivação, satisfação, percepção) no âmbito da alimentação e comportamentais/volitivos que abordam a predisposição ao consumo alimentar propriamente dito. Objetivos: i) avaliar o apetite emocional em três amostras de adultos brasileiros, obtidas antes e após o início da pandemia de COVID-19; ii) apresentar a versão em português e avaliar as propriedades psicométricas da Motivation for Dietary Self-control Scale (MDSC), da Satisfaction with Dietary Behavior Scale (SWDB) e da Dietary Goal-Desire Incongruence Scale (DG-DI) para amostra de adultos; iii) investigar a incongruência desejo-meta, motivação para autorregulação da ingestão alimentar e satisfação com o comportamento alimentar desses indivíduos de acordo com características amostrais; e iv) avaliar aspectos sociais e a autopercepção dos participantes de seus hábitos alimentares na pandemia de COVID-19. Métodos: Trata de estudo transversal. O apetite emocional foi investigado a partir do Emotional Appetite Questionnaire (EMAQ), aplicado antes (2019) e após início da pandemia (2020-2021). As escalas MDSC, SWDB e DG-DI foram utilizadas para investigação da motivação para autorregulação da ingestão alimentar, satisfação com o comportamento alimentar e incongruência desejo-meta na alimentação, respectivamente. Os instrumentos psicométricos passaram por adaptação transcultural e avaliação das evidências de validade e confiabilidade dos dados. O apetite emocional foi investigado com base no modelo circumplexo que considera valência e ativação das emoções. Os escores das escalas MDSC, SWDB e DG-DI foram comparados pelo teste t-Student ou Análise de Variância (ANOVA) a dois fatores, com pós-teste de Bonferroni (α=5%). A autopercepção dos hábitos alimentares foi investigada a partir de questão aberta, avaliada por análise de similitude. Resultados: A amostra foi composta por 323 adultos antes da pandemia (média de idade=19,7 [desvio-padrão(DP)=1,5] anos; 75,2% mulheres) e 1.921 adultos após seu início (média de idade=24,9 (DP=4,6) anos; 74,2% mulheres]. Emoções negativas e pouco ativadas (ex., deprimido, aborrecido) foram associadas à redução do consumo alimentar, enquanto emoções negativas e altamente ativadas (ex., ansiedade) foram relacionadas a seu aumento. Não houve diferença no apetite emocional antes e após o início da pandemia. Maior incongruência desejo-meta foi observada entre mulheres, praticantes de dietas, indivíduos com sobrepeso/obesidade e aqueles que avaliam a própria alimentação como ruim. Indivíduos que se alimentam acompanhados, não praticam dietas e não possuem excesso de peso apresentaram maior satisfação com seu comportamento alimentar. Durante a pandemia, os participantes relataram realizar as refeições em casa e perceberam impacto da ansiedade sobre sua alimentação. Indivíduos com sobrepeso/obesidade também relataram preocupação com o peso. Conclusões: os dados obtidos com os instrumentos foram válidos e confiáveis. O sexo, a prática de dietas, a autoavaliação da alimentação e o estado nutricional antropométrico foram relevantes para avaliação de aspectos afetivos e cognitivos da alimentação. Houve alterações percebidas nos hábitos alimentares das pessoas durante a pandemia, sendo relevante acompanhar essas no contexto pós-pandêmico.
Mecanismo de ação e atividade in vitro e in vivo do complexo tris(1,10-fenantrolina)ferro(II) frente a Mycobacterium tuberculosis
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-02-26) Demarqui, Fernanda Manaia ; Pavan, Fernando Rogério
O tratamento disponível contra a tuberculose é composto por uma combinação de medicamentos antimicobacterianos, isoniazida, rifampicina, etambutol e pirazinamida para casos de tuberculose sensível a medicamentos. No entanto, o regime de tratamento é longo, com duração de seis meses ou mais, e associado a efeitos colaterais tóxicos. Este trabalho busca, baseado em trabalhos anteriores do grupo, aprofundar o estudo sobre o Complexo ([Fe(fen)3]2+) como um possível candidato a fármaco contra a tuberculose e outras micobactérias não tuberculosas (MNT). Para tanto, experimentos in vitro foram realizados para avaliação da atividade do complexo frente as diferentes micobactérias; o mecanismo de ação foi determinado através do Sequenciamento Completo do Genoma de mutantes espontaneamente resistentes e a eficácia in vivo foi avaliada em modelo experimental de camundongos BALB/C. Para M. tuberculosis os resultados obtidos mostram que o Complexo ([Fe(fen)3]2+) possui sinergismo a fármacos de primeira linha além de ter melhora em sua atividade em concentrações fisiológicas de NaCl. Mutações encontradas no genoma de mutantes resistentes apontam que o Complexo atua em processos relacionados a síntese de parede bacteriana, resultado que foi corroborado pela avaliação da morfologia celular após exposição ao tratamento por microscopia eletrônica de varredura (MEV). In vivo, o Complexo mostrou-se altamente efetivo não sendo observado crescimento bacteriano após tratamento de camundongos infectados com M. tuberculosis. Os casos de doenças, causadas pelas chamadas MNT vem aumentando a cada ano. O tratamento dessas infecções é por vezes mais longo do que da tuberculose. O Complexo ([Fe(fen)3]2+) foi ativo contra três isolados clínicos de MNT. No ensaio de cinética bacteriana, ele teve comportamento bactericida contra a cepa padrão de M. abscessus. Em síntese, os resultados obtidos sugerem que o Complexo ([Fe(fen)3]2+) pode representar uma alternativa promissora no arsenal terapêutico contra a tuberculose e infecções por micobactérias não tuberculosas, oferecendo uma abordagem inovadora e potencialmente mais eficaz para o tratamento dessas doenças.
Identificação e caracterização de espécies de triatomíneos e de tripanossomatídeos coletados em região de fronteira (Brasil – Bolívia)
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-11-30) Menezes, André Luiz Rodrigues ; Rosa, João Aristeu ; Oliveira, Jader de
Em 1909, o pesquisador Carlos Ribeiro Justiniano Chagas identificou e descreveu o ciclo completo da doença de Chagas (DC). Essa enfermidade, que leva seu nome, é uma doença negligenciada e confinada, principalmente, aos países latinos – que, de forma geral, são considerados endêmicos. Os triatomíneos são insetos hematófagos vetores da DC e a maioria das espécies ocorre nas Américas. Esses insetos foram notificados, pela primeira vez, no século 15. Atualmente, existem 160 espécies descritas (agrupadas em 18 gêneros), das quais, cerca de 65 espécies foram notificadas no Brasil e 32 na Amazônia brasileira. O agente etiológico da DC é o protozoário flagelado Trypanosoma cruzi. Neste estudo, foi realizada a identificação e caracterização de espécies de triatomíneos e de tripanossomatídeos coletados em região de fronteira (Brasil – Bolívia). Coletas de triatomíneos foram realizadas em seis regiões do município de Guajará-Mirim, Rondônia, Brasil e Guayaramerín, Beni, Bolívia. As coletas foram feitas por buscas ativas em palmeiras, assim como, por meio de armadilhas luminosas e capturas de insetos que invadiram ambientes considerados domiciliares. Para identificação das espécies, utilizou-se de caracteres morfológicos, por intermédio de chaves dicotômicas. A identificação de tripanossomatídeos foi efetuada em microscopia ótica (MO) e por biologia molecular, pelo método Fluorescent Fragment Length Barcoding (FFLB). Foram capturados 1.232 espécimes de triatomíneos, dos seguintes estágios evolutivos: NI- 72; NII-94; NIII-128; NIV-146; NV-190 e adultos (602), para isso utilizamos chaves ditocômicas. Os triatomíneos coletados em palmeiras encontravam-se, predominantemente, em Attalea speciosa, embora, também em A. maripa e Oenocarpus bataua. Após as coletas, os triatomíneos foram examinados por MO, para investigar a presença de tripanossomatídeos. Posteriormente, foi extraído o DNA, para as análises moleculares. As espécies capturadas foram P. lignarius, P. geniculatus, R. montenegrensis, R. pictipes, R. robustus e R. stali. Por MO, cerca de 13% foram positivos à presença de tripanossomatídeos. No entanto, a taxa de infecção para tripanossomatídeos, por meio de PCR foi de 58,29% (549 insetos adultos examinados). Desses, 45% estavam infectados, somente por T. cruzi e 39,81% com infecção mista com T. rangeli. Com relação à genotipagem, 32,81% foram positivos para TcI, 21,25% para infecção mista (TrA+TcI), 15,63% para TrA e 15% para infecção mista (TrA+TcI+TcIV). O estudo possibilitou detalhar as distribuições dos triatomíneos e tripanossomatídeos em regiões de fronteira (Brasil – Bolívia), o que poderá subsidiar ações de vigilância na região estudada.
Produção de triglicerídeos dietéticos obtidos por acidólise enzimática em reatores contínuos e avaliação do potencial antineoplásico
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-11-23) Miotti Junior, Rodney Helder ; Paula, Ariela Veloso de ; Primo, Fernando Lucas ; Pereira, Jorge Fernando Brandão ; Universidade de Coimbra
Um grande desafio na modificação de óleos e gorduras para a síntese de lipídios estruturados é a falta de seletividade dos catalisadores químicos quanto às posições dos ácidos graxos a serem substituídos no triacilglicerol, dificultando a formação de triglicerídeos compostos por ácido graxos de cadeias média (M) nas posições sn-1 e sn-3 e ácido graxo de cadeia longa (L) na posição sn-2 (MLM). Por outro lado, as lipases possuem a capacidade de catalisar posições específicas do grupo funcional da molécula de triacilglicerol. Deste modo, o presente trabalho teve como objetivo sintetizar triglicerídeos dietéticos do tipo MLM em reação de acidólise do óleo de semente de uva com ácido cáprico em diferentes configurações de reatores, os quais foram nanoemulsionadas usando um núcleo de óleo inovador, aplicado em ensaios de viabilidade celular com fibroblastos embrionários murinos (NIH-3T3 - ATCC® CRL-1658™) e células de câncer cervical (HeLa, ATCC® CCL-2), a fim de desenvolver a nanoemulsão como uma nova abordagem terapêutica. As reações foram catalisadas por lipase de Rhizopus oryzae imobilizada em estireno-divinilbenzeno (Diaion™ HP-20). Inicialmente foram desenvolvidos os biocatalisadores, sendo selecionado para a imobilização o carregamento de 0,3 gramas de pó enzimático para cada grama de suporte. Os ensaios preliminares para a síntese dos lipídios estruturado foram desenvolvidos em reatores de tanque agitado. Utilizando-se da técnica de planejamento de experimentos, as melhores condições reacionais foram de 1:8 (razão molar entre óleo: ácido cáprico) e 45 °C atingindo o grau de incorporação do ácido cáprico em 56 %GI. Com o intuído de melhora a eficiência do processo, seja reduzindo temperatura ou reduzindo a quantidade de ácido cáprico, foi utilizado inteligência artificial na forma de redes neuronais para melhorar o processo. Assim, a rede foi capaz de aumentar grau de incorporação do ácido cáprico na estrutura do triacilglicerol, atingindo valores de 61%GI para as condições reacionais de 41°C e razão molar de 1:6,7. A partir do melhoramento apresentado pela rede neuronal e a busca pela transição de um sistema reacional em batelada para um de sistema contínuo, as condições reacionais foram aplicadas em reatores de leito fixo. O sistema continuo operou ao longo de 192 horas, com incorporação do ácido cáprico atingindo os 61%GI em seu estado estacionário. Em busca de minimizar os efeitos de perda de pressão, o presente trabalho utilizou reator de leito fluidizado, o qual obteve o grau teórico máximo de incorporação do ácido cáprico (66%GI) quando aplicado as condições reacionais atribuídas pela rede neuronal em reciclo. O máximo teórico foi atingido com vazão de alimentação de 3 mL/min após 48 horas de reação, sendo utilizada o carregamento enzimático de 1,0 grama de pó enzimática para cada grama de suporte. A partir deste alto grau de incorporação, foram realizados testes de viabilidade celular com linhagens de fibroblastos murinos e linhagens de células de adenocarcinoma cervical humano. No que diz respeito aos ensaios de citotoxicidade, a concentração de MLM-SL de 1,75% e 2% v/v foi capaz de induzir a morte celular em 56% e 64% das células de adenocarcinoma, respectivamente. As células de adenocarcinoma cervical humano mostraram maior sensibilidade à indução de morte celular ao usar emulsões com MLM-SL > 1,75% v/v em comparação com emulsões com menor conteúdo, indicando um potencial no combate a células cancerígenas.
Nanoemulsão para co-encapsulação de anfotericina B e micafungina: desenvolvimento, caracterização e avaliação do potencial terapêutico contra Candida auris
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-11-30) Marena, Gabriel Davi ; Chorilli, Marlus ; Bauab, Taís Maria ; Ramos, Matheus Aparecido dos Santos
Infecções sistêmicas causadas por Candida sp, principalmente as novas espécies como C. auris, têm aumentado nos últimos anos. Dos potenciais fármacos que podem ser empregados no tratamento, destacam-se a anfotericina B (AmB) e a micafungina (MICA); no entanto, a resistência antifúngica apresentada pelos microrganismos e os efeitos colaterais que os antifúngicos possuem limitam o seu uso na terapia. Desta forma, novas estratégias podem ser exploradas, como a incorporação destes fármacos em nanoemulsões (NE), com o objetivo de melhorar o perfil terapêutico. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o potencial antifúngico in vitro e in vivo da AmB e/ou da MICA incorporados em NE frente a Candida auris CDC B11903. As NEs foram compostas por 10% de óleo de girassol e colesterol (5:1) como fase oleosa, 10% de polioxietileno 20 cetil éter (Brij® 58) e fosfatodilcolina de soja (2:1) como tensoativo e 80 % de solução PBS como fase aquosa. As NE foram caracterizadas por ensaios de espalhamento dinâmico de luz (DLS), potencial zeta, análise de rastreamento de partículas (NTA) e microscopia eletrônica de transmissão (MET). A estabilidade das nanoemulsões foi acompanhada por 100 dias em DLS. Foi validada uma metodologia analítica por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) para quantificação de MICA e AmB e para os fármacos associados (MICAmB). Foi determinada a eficiência de encapsulação (EE) dos fármacos por HPLC e verificada a liberação in vitro das formulações. Posteriormente, realizou-se os ensaios biológicos in vitro utilizando a técnica de determinação da Concentração Mínima Inibitória (CMI90), Checkerboard, Time kill, ensaio de sorbitol e ergosterol e determinação do potencial anti-biofilme em diferentes tempos de formação. Foram realizados ensaios biológicos in vivo em modelo alternativo de Galleria mellonella para a determinação do potencial tóxico agudo e antifúngico e em camundongos com infecção sistêmica para a determinação da atividade antifúngica em tecidos. As NEs apresentaram diâmetro hidrodinâmico médio de 41,2 nm a 48,6 nm, índice de polidispersão (PDI) de 0,259 a 0,429 e o Potencial Zeta (PZ) de -4,7 mV a -3,6 mV. A concentração de partículas variou de 6,87 x 1013 a 1,98 x 1014 partículas /mL. A metodologia analítica foi desenvolvida e validada com sucesso, apresentando resultados satisfatórios de seletividade, linearidade, precisão, exatidão, limite de deteção e quantificação. A %EE para AmB, MICA em NE foram de 70 e 69 %, respectivamente e a EE de AmB e MICA em NEMA foi de 100 % e 44,7 %, respectivamente. A liberação dos fármacos incorporados nas NEs foi menor e mais lenta em comparação com o fármaco livre, variando de 62 a 100% de liberação após 24h de ensaio. Ensaios in vitro mostraram CMI90 mais baixo para fármacos livres. Houve sinergismo antimicrobiano entre MICA e AmB. Resultados promissores frente a biofilmes pré aderidos e formados foram observados após tratamento com os antifúngicos incorporados em NE, em especial frente aos biofilmes maduros. Ensaios de toxicidade aguda em larvas de G. mellonella mostraram que a NE diminuiu a toxicidade de AmB comparada com AmB livre. Os resultados de atividade antifúngica em modelo in vivo de G. mellonella mostraram que os fármacos incorporados em NE apresentaram melhor atividade terapêutica comparado aos fármacos livres. O ensaio em camundongos infectados evidenciou que as NEs potencializaram a ação antifúngica da AmB e MICAmB. Em conclusão, os resultados deste trabalham apontam o potencial das NE para incorporação de AmB e MICA no tratamento de infecções sistêmicas causada por C. auris.
The role of chemical signaling and gut mucosal immunity during Citrobacter rodentium infection
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-12-01) Melchior, Karine ; Moreira, Cristiano Gallina ; Raffatellu, Manuela ; University of California San Diego (UCSD)
The human pathogens enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) and enterohemorrhagic E. coli (EHEC) are transmitted by the fecal-oral route and cause severe diseases worldwide. Due to their potential to induce pathological lesions in the gut epithelium, they are commonly known as attaching and effacing pathogens (A/E pathogens). To date, effective strategies to manage EPEC and EHEC infections beyond standard supportive measures are lacking. Therefore, preclinical studies to better understand the mechanisms of infection of EPEC and EHEC are required. Because these bacteria are poorly pathogenic in mice, Citrobacter rodentium has been broadly used as an alternative in vivo model pathogen to study EHEC and EPEC disease. Similarly, to human pathogens, C. rodentium causes A/E lesions in mice without requiring antibiotic pretreatment to establish infection. Studies have shown that the membrane-bound histidine sensor kinase QseC promotes A/E pathogen colonization in vivo. However, whether QseC signaling is essential for A/E pathogens to resist and evade immune responses to establish disease remains unknown. On the host side, interleukin IL-22 is critical to resolve C. rodentium-mediated disease, although the exact mechanism(s) of IL-22-mediated protection are not well understood. Here, we aimed to investigate the role of chemical signaling through the QseC sensor for establishing disease and resistance to the host immune response. Furthermore, we studied the downstream mechanisms that mediate the mucosal immune protection conferred by IL-22 during C. rodentium infection. Our data suggest that the QseC sensor is directly involved in triggering intestinal inflammation and promoting transmissible colonic crypt hyperplasia, a hallmark pathological feature of C. rodentium-mediated disease. Moreover, QseC-mediated signaling enhanced C. rodentium’s resistance to neutrophil antimicrobial responses, resulting in the pathogen’s systemic dissemination in vivo. We identified changes in the lipopolysaccharide membrane modulated by the QseC sensor as a potential mechanism. Furthermore, we found that the IL-22-mediated resolution of C. rodentium infection was independent of the induction of several downstream responses, including calprotectin, Reg3β, Reg3γ, lipocalin-2, and C3. Instead, the susceptibility of IL-22 deficient mice to C. rodentium was primarily associated with increased intestinal permeability. Together, our data show that C. rodentium depends on chemical signaling mediated by QseC for disease establishment and to resist the immune responses conferred by neutrophils. Upon infection, IL-22 plays an essential role in host protection, which was independent of a single deficiency of either antimicrobial peptide regulated by this cytokine; instead, protection was related to IL-22’s regenerative properties by promoting the epithelial barrier integrity. Overall, our work expands the knowledge of the in vivo mechanisms triggered by A/E pathogens during infection.
Uso da técnica phage display para identificação e avaliação de peptídeos capazes de reduzir a taxa de infecção em macrófagos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-11-17) Verga, Juliane Buzzon Meneghesso ; Graminha, Márcia Aparecida Silva ; Pinto, Mara Cristina
Diante da alta incidência e gravidade das leishmanioses, especialmente a leishmaniose visceral (LV), e reconhecendo as limitações dos métodos convencionais de controle e tratamento, nosso projeto de pesquisa buscou contribuir para o combate e prevenção dessas doenças. Tivemos como principal objetivo deste projeto a identificação de peptídeos capazes de reduzir a taxa de infecção de células THP-1 diferenciadas a macrófagos pelas espécies Leishmania amazonensis, Leishmania mexicana e Leishmania infantum. A identificação de tais peptídeos se deu via aplicação da técnica de phage display como um meio para selecionar fagos recombinantes que expressassem peptídeos com alta afinidade à superfície das diferentes espécies de Leishmania. O processo de seleção de sequências peptídicas de interesse se deu com base em três critérios i) análise da frequência de sequências identificadas por meio de sequenciamento, ii) análise qualitativa da interação fago-Leishmania via ensaios de fluorescência, e iii) ensaios de inibição da taxa de infecção em macrófagos utilizando fagos recombinantes. O fago selecionado a partir de ensaios de phage display frente à L. infantum, A9, reduziu a taxa de infecção de macrófagos em 51.5% e 53.6% para L. infantum e L. amazonensis, respectivamente. Já o fago, H1, selecionado via interação com L. amazonensis, apresentou reduções significativas da taxa de infecção, 47%, apenas da própria espécie. Partindo da sequência peptídica expressa por tais fagos, foram sintetizados os peptídeos La1 e Li1, derivados dos fagos H1 e A9, respectivamente. Análises dos ensaios de inibição de infecção com peptídeos sintéticos mostraram que o peptídeo La1 inibe em 45% a taxa de infecção de macrófagos por L. amazonensis, enquanto o peptídeo, Li1, reduziu a taxa de infecção de macrófagos tanto para L. infantum (42%) quanto para L. mexicana (39%). Estudos in vivo, utilizando o modelo murino BALB/c infectado com L. infantum, mostraram uma redução da carga parasitária em 84%, demonstrando o potencial terapêutico do peptídeo Li1. A descoberta de dois peptídeos, um capaz de inibir a infecção por duas espécies e um espécie-específico, abre a possibilidade de uma continuidade deste trabalho com capacidade de impacto em ciência básica. Futuros trabalhos, podem utilizar das sequências peptídicas e resultados apresentados nessa tese para identificar proteínas de superfície responsáveis pela interação parasita-hospedeiro das diferentes espécies. Além disso, a significativa redução da infecção in vivo também mostra a capacidade deste trabalho em contribuir com futuras estratégias de combate às leishmanioses.
Avaliação do potencial de carreadores lipídicos nanoestruturados para co-encapsulação de curcumina e fluconazol dispersos em hidrogéis termorresponsivos no tratamento de candidíase vulvovaginal
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-08-11) Araujo, Victor Hugo Sousa ; Chorilli, Marlus
Candidíase vulvovaginal (CVV) é uma patologia que acomete boa parte da população de sexo feminino. O tratamento com agentes azólicos é amplamente prescrito e o número de isolados resistentes vem crescendo. Desta forma, se faz necessária a pesquisa de novas alternativas terapêuticas. Curcumina (CUR) demonstra ser uma alternativa promissora visto a sua bioatividade versátil e amplamente discutida na literatura. Em estudos, a associação de CUR com outros insumos farmacêuticos ativos (IFAs), como o fluconazol (FL) proporcionou otimização de atividade. Em virtude da baixa solubilidade da CUR, sua incorporação em sistemas de liberação nanoestruturados, como carreador lipídico nanoestruturado (CLN) pode ser interessante, de forma a otimizar sua ação biológica. Considerando a alta fluidez de CLN e aplicação intravaginal, o estudo avaliou a sua dispersão em hidrogel termorresponsivo. Desta forma, este projeto buscou avaliar o potencial de CLN para co-encapsulação de CUR e FL dispersos em hidrogéis termorresponsivos no tratamento de CVV. O desenvolvimento do CLN foi realizado com a abordagem Quality by Design (QbD) com intuito de obter um desenvolvimento baseado na qualidade. Desta forma, um estudo Box-Behnken (3³) foi conduzido. Diferentes técnicas de caracterização físico-químicas foram abordadas e foi possível obter CLN monodispersa, com diâmetro hidrodinâmico médio de 142,5 nm, com alta eficiência de encapsulação de CUR e FLU, liberação prolongada, índice de cristalinidade reduzido e forma esférica. Os hidrogéis foram obtidos utilizando CLN como fase aquosa (H-CLN) e a avaliação das propriedades mecânicas de H-CLN demonstrou que cada hidrogel teve um comportamento diferente de acordo com a CLN utilizada. A atividade da combinação CUR e FLU, a nanoestruturada (CLNFC) e hidrogel (H-CLNFC) foi avaliada em modelos in vitro com células planctônicas. Avaliação in vitro com biofilmes de C.albicans e C.glabrata, in vivo em modelo de Galleria melonella e anti-inflamatória in vitro (doseamento de TNF-alfa, IL-6, IL-10, IL-2) foram realizados com CLNFC. Os resultados indicaram o potencial anti-cândida da combinação CUR + FL e a otimização da atividade quando em CLNFC. Os resultados de H-CLNFC demonstraram redução do potencial antifúngico demonstrado por CLNFC. A citotoxicidade das amostras foi avaliada indicando que CLNFC não se apresentou tóxica em linhagens de macrófagos murinos e de células epiteliais de mucosa vaginal, além de exercer atividade anti-inflamatória. Desta forma, o sistema desenvolvido tem potencial no tratamento de CVV, visto as atividades antifúngica e anti-inflamatória demonstradas.
Efeitos benéficos da insulina associada a bioativos naturais no combate ao estresse glico-oxidativo em ratos diabéticos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-10-20) Figueiredo, Ingrid Delbone ; Baviera, Amanda Martins
A hiperglicemia crônica é um dos principais fatores envolvidos no estabelecimento e manutenção do estresse glico-oxidativo, o qual participa no desenvolvimento das complicações do diabetes mellitus (DM) tipo 1. A insulina é o principal agente antidiabético utilizado para o tratamento do DM tipo 1; no entanto, a insulinização crônica pode aumentar os riscos de ocorrência de episódios de hipoglicemia. Com o objetivo de diminuir os efeitos indesejados da terapia insulínica, a utilização de bioativos naturais como opção terapêutica complementar torna-se interessante. O licopeno e o ácido alfa lipoico possuem elevada capacidade antioxidante. Tornam-se interessantes os estudos dos benefícios que podem ser alcançados com as terapias combinadas entre insulina em menor dose e o licopeno ou o ácido alfa lipoico, principalmente na atenuação do estresse glico-oxidativo e prevenção das complicações diabéticas. O trabalho foi dividido em duas etapas. Na primeira etapa do trabalho, ratos diabéticos induzidos com estreptozotocina (40 mg/kg; i.v) foram tratados com insulina (4U/dia ou 1U/dia, via subcutânea) ou licopeno em iogurte (45 mg/kg, via oral), sozinhos ou combinados, durante 30 dias. Níveis de glicose (pós-prandial e jejum), frutosamina, perfil lipídico e atividade de paraoxonase 1 (PON 1) foram avaliados no plasma, e hemoglobina glicada (HbA1c) no sangue. Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e produtos finais de glicação avançada (AGEs fluorescentes) foram determinados no plasma e rins. As atividades das enzimas antioxidantes superóxido dismutase, (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GSH-Px) foram determinadas nos rins. Massa corporal, massas de tecidos (adiposos, muscular e rins), ingestão alimentar, ingestão hídrica e volume urinário foram monitorados. A função e a integridade dos rins foram avaliadas pela determinação dos níveis de ácido úrico no plasma, proteinúria e excreção de albumina (urina de 24 horas). A sensibilidade à insulina foi monitorada em músculos gastrocnemius através da análise dos níveis de fosforilação da AKT após estímulo com insulina. Níveis proteicos dos componentes pertencentes aos sistemas de detoxificação dos AGEs, AGE receptor-1 (AGER-1) e glioxalase 1 (GLO 1), também foram avaliados nos rins. Na segunda etapa do trabalho, ratos diabéticos induzidos com estreptozotocina (40 mg/kg; i.v) foram tratados com insulina (4U/dia ou 1U/dia, via subcutânea) ou ácido alfa lipoico em iogurte (50 mg/kg ou 25 mg/kg; via oral), sozinhos ou combinados, durante 30 dias. Tal como na primeira etapa do trabalho, os marcadores bioquímicos, fisiológicos e relacionados ao estresse glico-oxidativo no plasma, fígado e rins, bem como a função e a integridade dos rins foram monitorados. A terapia combinada “insulina (1U/dia) + licopeno” promoveu significativa diminuição da glicemia, atenuou a dislipidemia, diminuiu os níveis dos biomarcadores relacionados ao estresse oxidativo (TBARS no plasma), aumentou a atividade de PON 1 no plasma. Maiores níveis de fosforilação de AKT estimulada por insulina foram observados, indicando uma melhoria na sensibilidade à insulina. Foi observada uma ação benéfica nos rins de ratos diabéticos, com aumento nas atividades de SOD e CAT, diminuição da peroxidação lipídica (TBARS), aumento nos níveis de AGER-1 e GLO 1. Houve diminuição da albuminúria e nos níveis de ácido úrico no plasma de ratos diabéticos tratados com “insulina (1U/dia) + licopeno”. Em relação às terapias combinadas entre “insulina (1U/dia) + ácido alfa lipoico (50 mg/kg ou 25 mg/kg)”, estas também promoveram significativa diminuição da glicemia, atenuaram a dislipidemia, diminuiram os níveis de HbA1c, frutosamina, TBARS, AGEs fluorescentes e aumentaram a atividade de PON 1 no plasma. O tratamento com “insulina (1U/dia) + ácido alfa lipoico (50 mg/kg ou 25 mg/kg)”, nos rins de ratos diabéticos, aumentou a atividade de SOD, reduziu a peroxidação lipídica (TBARS) e a glicação avançada (AGEs fluorescentes). Houve diminuição da albuminúria e nos níveis de ácido úrico no plasma de ratos diabéticos tratados com “insulina (1U/dia) + ácido alfa lipoico (50 mg/kg ou 25 mg/kg)”. Adicionalmente, foi observado um aumento expressivo nos níveis de AGER-1 e GLO 1 em ratos diabéticos tratados com “insulina (1U/dia) + ácido alfa lipoico (25mg/kg)”. O tratamento com “insulina (1U/dia) + ácido alfa lipoico (50 mg/kg ou 25 mg/kg)”, no fígado de ratos diabéticos, aumentou as atividades de SOD e CAT, diminuiu os AGEs fluorescentes. O tratamento de ratos diabéticos com “insulina 1U/dia + ácido alfa lipoico (50 mg/kg)” promoveu diminuição significativa nos níveis de AGEs fluorescentes no fígado. Houve uma diminuição nos níveis de ALT no plasma dos ratos tratados com “insulina (1U/dia) + ácido alfa lipoico (50 mg/kg ou 25 mg/kg)”. Os tratamentos de ratos diabéticos com “insulina (1U/dia) + licopeno” ou “insulina (1U/dia) + ácido alfa lipoico” promoveram diversos efeitos benéficos, os quais muitas vezes não foram observados com os tratamentos isolados. Os benefícios das terapias combinadas foram especialmente observados na diminuição dos níveis glicêmicos e na atenuação do estresse glico-oxidativo, com ênfase no potencial em acionar os sistemas endógenos de detoxificação das espécies reativas de oxigênio e dos produtos avançados da glicação. Levando-se em consideração que um fármaco antidiabético ideal deve ser aquele capaz de controlar efetivamente os níveis glicêmicos e atenuar o estresse glico-oxidativo, as terapias combinadas “insulina 1U/dia + licopeno” e “insulina 1U/dia + ácido alfa lipoico” surgem como estratégias terapêuticas promissoras para atenuar ou prevenir as complicações relacionadas ao DM tipo 1, principalmente àquelas que impactam o fígado e os rins.

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