Araraquara - FCF - Faculdade de Ciências Farmacêuticas

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Perfil fitoquímico e nutricional de Plantas Alimentícias Não Convencionais (PANC)
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-07-29) Mata, Barbara Paes Miglioli da ; Santos, André Gonzaga dos
O Guia Alimentar para a População Brasileira do Ministério da Saúde e da Organização Pan-Americana da Saúde recomenda uma dieta saudável rica em frutas e legumes frescos como principal forma de promoção à saúde e prevenção de doenças crônicas. A biodiversidade dos biomas brasileiros corresponde a mais de 13% da riqueza mundial e, dentre as mais de 3.000 espécies do Reino Plantae com potencial alimentício, apenas 10% são utilizadas. Assim, propomos a triagem do perfil fitoquímico e nutricional de extratos de polpas dos frutos de plantas alimentícias não convencionais (PANC) do Brasil, a saber: bacupari (Garcinia brasiliensis Mart.); canistel (Pouteria campechiana (Kunth)); jatobá (Hymenaea courbaril L.); jenipapo (Genipa americana L.); oiti (Moquilea tomentosa (Benth.) Fritsch) e pequi (Caryocar brasiliense Cambess.), utilizando diferentes técnicas, como: i) ensaios in vitro para avaliação da atividade antioxidante; ii) toxicidade embrionária em zebrafish; iii) composição centesimal; iv) análises por HPLC-UV, TLC e HPLC-MS. O perfil fitoquímico dos extratos foi determinado por HPLC-UV. Na TLC, a fase móvel que possibilitou a visualização de maior número de bandas, nas três amostras de pequi, foi composta por tolueno:acetato de etila:metanol:ácido acético (5,3:4:0,5:0,2 v/v) e revelada com anisaldeído sulfúrico. Já as amostras de bacupari, canistel e oiti não eluíram de forma satisfatória, requerendo otimização das condições de análise por TLC. Para o jenipapo houve separação de bandas nas três fases móveis testadas e, em todas, evidenciou uma banda azulada, característica de iridoides como a genipina. O extrato etanol 70% de bacupari e o extrato etanólico de canistel demonstraram o maior potencial antioxidante dentre os extratos de polpa dos frutos das PANC estudadas, inibindo em cerca de 70% o radical DPPH na concentração de 500 μg/mL. O teor de compostos fenólicos totais equivalentes ao ácido gálico (EAG) variou de 1,05±0,3 no pequi (coleta 2) a 13,4±2,4 no oiti. O maior e o menor teor de proteínas nas polpas de frutos foram encontrados em amostras de pequi (amostra coletada no campus da Unesp e na amostra comercial, respectivamente). O maior e o menor teor de lipídeos foram encontrados na amostra comercial de pequi e no canistel, respectivamente. O teor de fibras solúveis variou de 12,1±0,3 em oiti a 22,1±3,0 na amostra de pequi coletada no assentamento (coleta 1). Oiti também contou com o menor valor de fibras insolúveis (10,4±0,8) e o pequi coletado na Unesp (coleta 2) com o maior valor (14,5±0,2). Amostra comercial de pequi contou com o menor valor de lignina klason (1,6±0,3) e oiti com o maior valor (25,0±2,7). Com relação à avaliação da embriotoxicidade, a menor concentração do extrato etanólico de jatobá (50μg/mL) não apresentou diferença com significância estatística (p > 0,05) em comparação com os controles. Já as concentrações de 100 e 200 μg/mL apresentam diferença estatística (p < 0,05), com grande impacto na queda da taxa de sobrevivência. O extrato de jenipapo, por sua vez, apresentou baixa toxicidade aos embriões nas três concentrações testadas e manteve a taxa de sobrevivência alta mesmo após as 72 horas de exposição.
Mecanismo neuroquímico local envolvido no controle das respostas cardiovasculares ao estresse de restrição por diferentes regiões da porção posterior do córtex insular em ratos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-12-21) Santos, Adrielly dos ; Souza, Ricardo Luiz Nunes de ; Santiago, Cristiane Busnardo
A sobrevivência das espécies diante de eventos aversivos ou estressores depende de um coordenado conjunto de ajustes fisiológicos e comportamentais. O córtex insular [do inglês, insular cortex (IC)] é uma estrutura cortical que foi implicada na integração e processamento de informações límbicas em humanos e animais e, nesse sentido, foi reportado estar envolvido na geração de respostas fisiológicas e comportamentais durante situações de estresse. Um estudo recente explorou a participação de sítios específicos ao longo do eixo rostro-caudal do IC no controle da função cardiovascular em roedores no estresse de restrição. Foi evidenciado que o bloqueio sináptico não-seletivo na região anterior do IC não afetou as respostas cardiovasculares ao estresse de restrição, ao passo que bloqueios na porção posterior-rostral reduziu a resposta pressora e a inibição da sub-região posterior-caudal causou redução da resposta taquicárdica. Foi avaliada também a ativação neuronial ao longo do eixo rostro-caudal do IC e foi elucidado que o controle da resposta taquicárdica pela porção caudal foi associada com uma diminuição no número de células positivas para a proteína Fos, o que indica uma redução na ativação neuronial local; ao passo que o controle da resposta pressora pela porção rostral foi acompanhado de aumento de células positivas para Fos. Esses dados indicam que o controle das respostas cardiovasculares ao estresse pelas sub-regiões rostral e caudal da porção posterior do IC seja mediado por diferentes mecanismos neuroquímicos excitatórios ou inibitórios. Assim, o presente estudo visa testar a hipótese de que a resposta de aumento da pressão arterial pela sub-região posterior-rostral está relacionado principalmente com mecanismos glutamatérgicos locais enquanto o controle da resposta taquicárdica pela porção caudal do IC posterior é mediado predominantemente por mecanismos inibitórios. Nós identificamos que o tratamento do IC posterior-rostral com ácido quinurênico (antagonista não-seletivo de receptores gluatamatérgicos ionotrópicos) não afetou significativamente as respostas taquicárdicas e de queda da temperatura cutânea da cauda induzidas pelo estresse de restrição agudo, contudo houve uma tendência de diminuição da resposta pressora. Observamos também que a microinjeção bilateral de um coquetel de SR95531 (gabazina, antagonista do receptor GABAA) e CGP35348 (antagonista do receptor GABAB) facilitou a resposta de taquicardia causada pela restrição, porém sem alterar significativamente a resposta pressora e a queda da temperatura cutânea da cauda. Adicionalmente, o tratamento do IC posterior-caudal com ácido quinurênico (antagonista não-seletivo de receptores gluatamatérgicos ionotrópicos) não afetou significativamente as respostas, pressora, taquicárdicas e de queda da temperatura cutânea da cauda induzidas pelo estresse de restrição agudo ao passo que microinjeção bilateral de um coquetel de SR95531 (gabazina, antagonista do receptor GABAA) e CGP35348 (antagonista do receptor GABAB) reduziu significativamente a resposta de taquicardia causada pela restrição, porém sem alterar significativamente a resposta pressora e a queda da temperatura cutânea da cauda. Em conjunto, os resultados obtidos até o presente momento sugerem um envolvimento da neurotrasmissão GABAérgica nas respostas taquicárdicas ao estresse de restrição agudo ao longo do eixo rostrocaudal no IC posterior, e que na porção rostral essa influência é inibitória enquanto na porção caudal ela é facilitatória.
Síntese de ésteres de geraniol catalisada por micélio de Aspergillus tubingensis com elevada atividade lipolítica
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-04-11) Gonçalves, Rhyan Lelis Nubile ; Paula, Ariela Veloso de ; Carvalho, Ana Karine Furtado de
Nos últimos anos, o micélio de fungos filamentosos tem emergido como um protagonista promissor na área da biotransformação. Essa rede intricada de filamentos, conhecida como micélio, desempenha um papel crucial na absorção de nutrientes do ambiente e, mais recentemente, tem sido explorado por sua capacidade catalítica. Uma das áreas de interesse é a esterificação de terpenos, componentes aromáticos encontrados em muitas plantas e presentes em óleos essenciais, utilizados desde a antiguidade para o tratamento de diversas doenças. Descobriu-se que a esterificação de terpenos resulta em uma molécula mais estável, menos tóxica e com propriedades similares aos seus álcoois constituintes. Aliado a isso, a esterificação enzimática catalisada por lipases é mais sustentável, pois reduz drasticamente o uso de reagentes químicos e processos pouco sustentáveis. Assim, neste estudo, utilizaram-se lipases ligadas ao micélio de Aspergillus tubingensis em um reator de tanque agitado operando em modo batelada, para síntese de éster terpênico. Os substratos utilizados foram geraniol (álcool) e ácido acético (acil doador). O objetivo deste trabalho foi desenvolvimento do micélio de A. tubingensis a fim de se obter uma biomassa com maior potencial catalítico, e a otimização da produção de acetato de geranila. A partir dos tratamentos efetuados no micélio, a priori foram obtidos resultados elevados de atividade hidrolítica 955,73 ± 31,65 U/g e de esterificação 989,08 ± 30,33 U/g. Em seguida, o micélio foi caracterizado com relação aos valores de pH e temperatura ótimos, resultando em pH ótimo de 7,0 e temperatura ótima de 37 ºC. Com relação aos parâmetros cinéticos, foram obtidos Km de 280,2 Mm e Vmáx de 2000 U/g, demonstrando que o micélio segue a cinética de Michaelis-Menten. Visando à otimização da produção de acetato de geranila, realizaram-se planejamentos fatoriais, com as variáveis independentes: temperatura, razão molar e carga enzimática. A produção do acetato de geranila foi otimizada, alcançando 100% m/m de conversão nas condições razão molar 1:5 (geraniol/ácido acético), temperatura 45 ºC e carga enzimática 5% (% m/m) em 24 h de reação. Resultados obtidos revelam que as novas abordagens aplicadas ao micélio como biocatalisador aumentaram seu potencial de forma significativa. De forma notável, o micélio de A. tubingensis demonstrou boa resistência a ambientes ácidos. Além disso, sua capacidade de alcançar uma conversão de 100% de ésteres de geraniol é um marco significativo. Essa realização, até então inédita na literatura cientifica, abre novas perspectivas para a aplicação do micélio como um biocatalisador eficiente. A possibilidade de produzir moléculas bioativas com a conversão obtida é promissora e pode revolucionar a indústria biotecnológica e outras áreas de pesquisa.
Implantação de projeto piloto IGRA-TB – Ministério da Saúde: padronização, otimização, epidemiologia e avanços na quantificação de IFN-ᵞ para inovações frente ao diagnóstico de tuberculose latente
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-04-18) Filardi, Eloise Trostdorf Monteiro ; Costa, Paulo Inácio da
A tuberculose continua sendo um importante desafio para a saúde pública mundial ao longo dos anos, com cerca de dez milhões de novos casos e 1,2 milhões de óbitos registrados. O Brasil está entre os 30 países com alta carga de coinfecção por tuberculose e HIV (Vírus da Imunodeficiência Humana), sendo está uma das principais causas de morte nesse grupo específico. Controlar a disseminação da doença é uma prioridade global estabelecida pela Organização Mundial da Saúde (OMS). A infecção pode se manifestar de forma ativa ou latente. No primeiro caso, o diagnóstico pode ser feito por meio de exames de imagem ou pela identificação direta do agente etiológico. A dificuldade reside no diagnóstico da tuberculose latente (ILTB), na qual o indivíduo contaminado não apresenta sintomas nem sinais clínicos evidentes, apesar de os bacilos de Koch permanecerem nos granulomas, onde o Mycobacterium tuberculosis (MT) prolifera e se desenvolve até a eventual manifestação da tuberculose ativa, especialmente em pacientes imunossuprimidos nos quais o bacilo escapa do sistema imunológico. A resposta imunológica ao MT ocorre após a prévia sensibilização dos linfócitos T, que são responsáveis pela produção e secreção da citocina interferon-gamma (IFN-γ). Essa citocina pode ser quantificada por meio de um ensaio clínico, como o teste IGRA-TB, que é uma alternativa para o diagnóstico da ILTB. No entanto, o teste pode apresentar limitações de sensibilidade em pacientes com linfopenia e redução nos valores absolutos de linfócitos CD4+ e CD8+, os quais são responsáveis pela secreção de IFN-γ após a apresentação de antígenos da tuberculose por monócitos, resultando em falsos negativos ou resultados inconclusivos, especialmente em casos de coinfecção com o vírus HIV. O método de RT-PCR foi proposto para dosagem de RNAm de IFN-γ na presença de antígenos específicos do MT, ESAT-6 e CPF-10, demonstrando resultados promissores, com uma maior frequência de RNAm expresso em amostras que foram positivas para ILTB. Além de descrever o processo de padronização, implementação e propostas para o refinamento da dosagem de IFN-γ, o presente estudo também analisou a epidemiologia dos casos de tuberculose em cinco regiões diferentes do estado de São Paulo. Os resultados revelaram uma taxa de 14,3% de casos positivos para ILTB nas seguintes regiões: DRS III - Araraquara/São Carlos, XIII - Ribeirão Preto, VIII - Franca, XV - São José do Rio Preto e V - Barretos, juntamente com uma análise descritiva das populações estudadas.
Construção de uma plataforma para avaliação da resposta imunológica à vacinação contra SARS-CoV-2 em indivíduos HIV positivos: uma abordagem ex vivo para a liberação de citocinas
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-04-24) Valderrama Filho, Rualdo ; Costa, Paulo Inácio da ; Araujo Junior, João Pessoa
Este projeto de pesquisa teve como objetivo o desenvolvimento de uma plataforma para avaliar a expressão ex vivo das citocinas produzidas pelas células T desenvolvidas na imuni-zação contra SARS-CoV-2 em indivíduos infectados pelo HIV. Para isso, os participantes foram divididos em três grupos conforme os níveis de linfócitos T CD4+ no sangue periféri-co, e o plasma e células sanguíneas dos doadores foram utilizados em diferentes testes imu-nológicos. Para isso, os níveis de anticorpos neutralizantes para SARS-CoV-2 foram detec-tados no plasma, e a quantificação de imunoglobulinas IgG e IgM totais não apresentou vari-ações significativas entre os grupos. Além disso, a expressão relativa dos transcritos de cito-cinas expressos por células mononucleares do sangue periférico (CMSP ou a sigla em inglês PBMC) foi determinada após estímulo com o replicon viral ccSARS-CoV-2 e peptídeos sin-téticos da região RBD da proteína Spike, visando avaliar a resposta celular específica à va-cinação. A estimulação viral mostrou-se mais efetiva no período de exposição de 24 horas, comparado ao período de 12 horas, como demonstrado pela expressão relativa de citocinas quantificada por RT-qPCR seguida pela análise de correlação de PERSON (r) que apresentou com índice muito forte (0,97) entre IFN-ɣ / IP-10 e (0,95) com IL-1β / IL-17A e nula (-0,19 a -0,85) entre TNF-α e as demais citocinas estudadas. Esses dados sugerem que a plataforma pode ser uma ferramenta valiosa para avaliar a eficácia das vacinas contra SARS-CoV-2, indicando o timing ideal para doses de reforço e potencialmente contribuindo para o desen-volvimento de novas vacinas.
Desenvolvimento de bases de maquiagem faciais e estudo da estabilidade e FPS
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-05-31) Tessaro, Hariel Maffei Umesaki ; Isaac, Vera Lucia Borges ; Faculdade de Ciências Farmacêuticas - FCF
A pele, o maior órgão do corpo humano, apresenta na epiderme e derme substâncias capazes de reter as moléculas de água nessa localidade. A emulsão é uma combinação de substâncias aquosas e oleosas que necessitam de um tensoativo para se misturarem, sendo que, no caso de algumas bases de maquiagem, obtêm-se primeiro a emulsão e depois incorpora-se os pigmentos. O objetivo deste trabalho consistiu no desenvolvimento de uma base de maquiagem multifuncional, com pigmentos tratado e não tratado, sendo as suas características o sensorial aveludado, a ação fotoprotetora e a ação hidratante. Foram manipuladas cinco formulações, e duas delas foram escolhidas de acordo com o sensorial, sendo que, para ambas foram selecionadas matérias-primas de alta tecnologia oferecidas pelo mercado, para que as características desejadas do produto fossem alcançadas. As matérias-primas das formulações foram separadas em fase aquosa e oleosa, e levadas ao aquecimento em banho maria para fusão e/ou solubilização, para a formação da emulsão e, posteriormente, adição dos pigmentos em gral de vidro. A fórmula 1, com os pigmentos tratado e não tratado foi submetida ao ensaio da estabilidade preliminar, enquanto a fórmula 2, com os mesmos pigmentos, foi submetida as estabilidades preliminar e acelerada, nas condições ambiente, estufa e geladeira, e sendo avaliadas suas características organolépticas, pH, espalhabilidade e FPS. Os brancos das bases de maquiagem com os filtros solares e os dióxidos de titânio tratado e não tratado também foram manipulados para avaliação do FPS. Dentre os resultados encontrados, a fórmula 1, após a sua reformulação, permaneceu estável com ambos os pigmentos, na estabilidade preliminar. A fórmula 2 foi estável durante os 90 dias de análise, com exceção do pH da base de maquiagem com o pigmento tratado armazenado na estufa, que não ficou dentro do limite de variação média±10% determinado pela literatura. Em relação aos brancos das bases de maquiagem, foi possível observar que os valores de FPS apresentam pouca diferença quando comparados aos das bases de maquiagem. Assim, concluiu-se que a formulação 2 é a melhor opção para o consumidor, independente de qual pigmento seja utilizado, sendo apenas necessário recomendação de armazenamento do produto desenvolvido com o pigmento tratado em locais que não fique exposto a elevadas temperaturas. Em relação ao FPS, constatou-se que os elevados valores encontrados não estão relacionados apenas aos dióxidos de titânio, mas sim ao uso dos demais pigmentos, por também poderem ser considerados filtros físicos.
Avaliação de bioprodutos e bioprocesso para micropropagação in vitro de cúrcuma ornamental em sistema de biorreator de imersão temporária
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-02-29) Zucherato, Raphael ; Machado, Levi Pompermayer ; Ferraz, Marcelo Vieira
No setor de plantas ornamentais a micropropagação in vitro é uma ferramenta essencial para produção em escala comercial de mudas de diferentes espécies. Esta técnica envolve bioprocessos desenvolvidos em ambientes controlados, nos quais os tecidos vegetais são manipulados em condições assépticas com o objetivo de multiplicar plantas de interesse comercial. Dessa forma, é possível obter clones que mantenham características desejadas dos cultivares selecionados e valor comercial. Nesse contexto, a presente proposta abordará duas estratégias na produção de micropropagação in vitro de Cúrcuma SPLASH®, (Cúrcuma alismatifolia – Zingiberaceae). A primeira envolverá a micropropagação convencional utilizando meio de cultura MS sólido, substituindo os macronutrientes por Peters® 0,4 gr/l, adicionado hormônio BAP 0,6 mg/l, suplementando concentrações diferentes de extratos líquidos de macroalgas Acadian® (0,1/0,5/1,0 ml/l), Cia das Algas® (0,1/0,5/1,0 ml/l) e AquaGreen® (0,1/0,5/1,0 ml/l) com hormônio BAP (0,6 mg/l). A segunda proposta é replicar o mesmo tratamento da primeira fase, com a utilização do processo de micropropagação através de biorreatores de imersão temporária utilizando meio de cultura líquido. Com análise dos resultados o trabalho mostra que a substituição dos macronutrientes por fertilizante Peters® 0,4 gr./l é uma alternativa economicamente mais viável em comparação ao uso dos macronutrientes com alto teor de pureza, comparando os métodos de micropropagação in vitro de mudas, para ambas as fases, o sistema de biorreator de imersão temporária mostrou mais eficiência em comparação com o método convencional alongamento e enraizamento. A suplementação do meio de cultura com os biofertilizantes, traz benefícios para produção de mudas micropropagadas in vitro, AquaGreen® e Cia das Algas® na fase de multiplicação e geração de novos brotos, Acadian para fase de alongamento, AquaGreen® e Cia das Algas® para fase de enraizamento.
Desenvolvimento e avaliação de peptídeos análogos da plectasina: síntese, conjugação a nanopartículas de sílica mesoporosas e avaliação biológica contra o Mycobacterium tuberculosis
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-03-19) Carnero Canales, Christian Shleider ; Sabio, Rafael Miguel
A resistência antimicrobiana representa um dos maiores desafios para a saúde pública mundial, exigindo o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos eficazes contra patógenos resistentes a múltiplos fármacos. Neste contexto, os peptídeos antimicrobianos (PAMs) emergem como promissores candidatos devido à sua especificidade e mecanismo de ação diferenciado. Este estudo focou na avaliação de análogos da Plectasina, particularmente o peptídeo DC05, para explorar sua atividade antimicrobiana, biocompatibilidade e capacidade de inibir bombas de efluxo em Mycobacterium tuberculosis (Mtb) e outras bactérias patogênicas. Os resultados demonstraram que o DC05 possui atividade antimicrobiana notável contra Mtb, com uma concentração inibitória mínima (CIM) de 12 µM, além de eficácia contra Pseudomonas aeruginosa e Salmonella Typhi. Este perfil sugere a aplicabilidade do DC05 como um amplo espectro de agente antimicrobiano, com um foco particular em bactérias gram-negativas e micobactérias. Além disso, a análise da biocompatibilidade em diversas linhas celulares confirmou um perfil de segurança favorável, permitindo o uso terapêutico dos peptídeos sintetizados sem causar danos celulares significativos. Um achado crucial foi a capacidade do DC05 de aumentar o acúmulo de brometo de etídio em Mtb, indicando uma inibição efetiva das bombas de efluxo. Este mecanismo propõe o uso potencial de peptídeos como adjuvantes em terapias combinadas com antibióticos tradicionais, potencializando sua eficácia. A variabilidade na estabilidade dos peptídeos em diferentes modelos biológicos in silico ressalta a necessidade de otimização das sequências para aumentar sua meia-vida e eficácia terapêutica.
Avaliação da atividade antioxidante e antimicrobiana dos componentes fitoquímicos de Physalis angulata associados a sistema polimérico
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-12-28) Medeiros, Camila Cristina Baccetti ; Pietro, Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues
Physalis angulata é uma espécie com propriedades farmacológicas que são associadas à presença de metabólitos secundários específicos denominados fisalinas. Baseado nisso, este trabalho teve como objetivo analisar a capacidade de inibição de crescimento de microrganismos de interesse em Saúde Pública e a atividade antioxidante dos extratos etanólico e clorofórmico das partes aéreas de P. angulata. Para atingir os objetivos foram obtidos os extratos etanólico e clorofórmico e suas frações, além de realizar a triagem fitoquímica das principais classes de metabólitos secundários presentes nas partes aéreas de P. angulata. Análises de CCD apontam para a presença de ergosterol, possivelmente vitanolídeos. O perfil cromatográfico em CLAE-UV expõe a presença de um mesmo tipo de composto nos extratos e frações, sugerindo que esses sejam os responsáveis pela atividade biológica. Resultados obtidos na triagem fitoquímica apontam a presença de flavonoides, taninos, alcalóides, terpenos e glicosídeos cardiotônicos que justificam o EC50 de 127,11 μg/mL do extrato etanólico e 415 μg/mL do extrato clorofórmico apresentado nos testes de atividade antioxidante. O extrato clorofórmico demonstrou as melhores concentrações inibitórias mínimas (CIM) sendo 0,62 mg/mL para o fungo filamentoso Microsporum canis, 1,25 mg/mL para a levedura Candida albicans, 2,50 mg/mL para Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis, Candida krusei e Candida parapsilosis e 5,00 mg/mL para Pseudomonas aeruginosa. A fração metanol obtida do extrato clorofórmico apresentou os melhores resultados para bactérias, variando de 0,62 a 1,25 mg/mL, enquanto a fração Hexano-Acetato (6:4) foi melhor para fungos, com CIMs variando de 0,07 a 1,25 mg/mL. Apesar dos resultados apresentados com os patógenos planctônicos, o extrato clorofórmico, a fração Hexano-Acetato (6:4) e a fração metanol não apresentaram atividade anti-biofilme de Candida albicans. Os extratos, a fração metanol e Hexano-Acetato (6:4) foram incorporadas em nanoemulsão e tiveram seu desempenho biológico avaliado, porém não demonstraram atividade contra bactérias e fungos e a atividade contra fungos filamentosos não foi melhor do que os resultados obtidos sem incorporação na nanopartícula. Apesar dos valores obtidos nos testes com a nanoemulsão, ajustes na formulação e no tempo do experimento podem trazer dados relevantes sobre a capacidade antimicrobiana da P. angulata.
Modelagem molecular e síntese de inibidores de histona deacetilase-3 (HDAC-3), planejados como como agentes reversores de latência do HIV
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-08-31) Fernandes, Lívia da Rocha ; Santos, Jean Leandro dos ; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Ainda que mais de 40 anos da descoberta do vírus da imunodeficiência humana (HIV), tenham se passado, e avanços significativos tenham sido conquistados, a exemplo do aumento na expectativa de vida dos pacientes vivendo com HIV, a infecção ainda se mantem incurável. Em 2019, estimou-se que o número de pessoas infectadas era de cerca 37,9 milhões no mundo, das quais 24,5 milhões tinham acesso a terapia antirretroviral (TARV). A TARV reduz efetivamente a carga viral, mas não elimina o vírus, que permanece latente em células T CD4+ podendo ser reativado com a interrupção do tratamento. Nesse contexto, abordagens terapêuticas visando a cura funcional são urgentes. Dentre essas, a estratégia “kick-and-kill”, visa esgotar o reservatório viral pela reativação do HIV latente por agentes reversores latência (ARL) (kick), e eliminação de células infectadas por efeitos citopáticos, resposta imunológica ou associação a compostos que induzam a eliminação do vírus reativado (kill). A hipótese é que a combinação dessa nova estratégia associada ao tratamento continuo com a TARV impeça que o vírus reativado consiga infectar células saudáveis, podendo ser um novo caminho a ser explorado para a eliminação dos reservatórios celulares latentes do vírus. A perpetuação do vírus nestes reservatórios e em baixo estado de replicação é um dos grandes desafios para sua completa eliminação a fim de atingir a cura funcional. Dentre os reservatórios de HIV, os linfonodos constituem o exemplo mais conhecido, por conterem grande quantidade de linfócitos T CD4+ e outras células imunes. Dentre os ARL, aqueles que atuam por mecanismos epigenéticos parecem ser promissores, dos quais se destacam os inibidores de histona deacetilase (HDAC). Dessa maneira, este estudo visa planejar e sintetizar novos potenciais inibidores de histona deacetilase-3 como candidatos a ARL para o HIV, direcionados aos linfonodos por meio da estratégia da latenciação de fármacos. Assim, por meio de estudos de modelagem molecular foram planejadas uma série de compostos, que foram divididos em duas séries, a saber: série A (cap amina), e série B (cap metil-amina). No total, foram sintetizados 21 compostos, dos quais 13 são intermediários; e 6 são produtos finais. Destes finais, 2 são pertencentes a série A, e 4 pertencentes a série B. Todos os compostos foram caracterizados por métodos analíticos como ressonância magnética nuclear (RMN) e infravermelho (IV). Os produtos finais foram obtidos em rendimentos globais que variaram de 2-15% (2% (3b); 3% (2a); 6% (4b); 10% (19); 14% (1a); 15% (23)).
Análise do potencial antifúngico e antibiofilme de peptídeos antimicrobianos frente ao Histoplasma capsulatum e análise toxicológica de um derivado de mastoparano
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-06-27) Carvalho, Angélica Romão ; Fusco-Almeida, Ana Marisa ; Gomes, Paulo César ; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A histoplasmose é uma doença que afeta gravemente populações imunossuprimidas, cujo tratamento apresenta opções farmacológicas limitadas com efeitos adversos consideráveis. O seu agente etiológico, Histoplasma capsulatum, distribui-se globalmente e de forma endêmica pelo território brasileiro. Ademais este fungo possui a habilidade de formar biofilmes, estruturas que intensificam a gravidade das infecções causadas por ele. No presente trabalho, cinco peptídeos antimicrobianos foram testados frente ao fungo. Três derivados de mastoparano e dois derivados de moricin C3 foram testados contra as formas planctônica e de biofilme das cepas G186A e EH-315 de H. capsulatum. O peptídeo MK58911, apresentou a melhor performance, causando a inibição da biomassa dos biofilmes em ambas as cepas de H. capsulatum. Observou-se 33,8% de inibição com 31,2 μg/mL para a cepa G186A e 32,9% com 125 μg/mL para a cepa EH-315. Quanto a viabilidade metabólica nenhum dos peptídeos testados, incluindo o MK58911, foi capaz de afetá-la em nenhuma das formas fúngicas. A análise da atividade sinérgica entre o MK58911 e o itraconazol frente ao biofilme revelou a existência de atividade aditiva entre as moléculas, com valores de ICIF de 0,53 para a cepa G186A e 0,62 para a cepa EH-315. A toxicidade do MK58911 foi analisada em diversos modelos. Para a linhagem celular A549, foram determinados os valores de IC50 de 292 μg/mL para a monocamada e 500 μg/mL para os esferóides. Em modelo alternativo Tenebrio molitor não foi observada toxicidade em nenhuma das doses analisadas (10, 50 e 100 mg/Kg). No entanto, o mesmo peptídeo mostrou-se embriotóxico e teratogênico em modelo Danio rerio, para o qual encontrou-se um valor de LC50 de 6,9 μg/mL. Ademais observou-se diminuição na movimentação espontânea (em 15,6 e 7,8 μg/mL) e na frequência cardíaca (em 15,6; 7,8 e 3,9 μg/mL) dos embriões. Finalmente, realizou-se a cromatografia de afinidade com extrato proteico total de H. capsulatum em coluna acoplada com o peptídeo MK58911. Nas alíquotas eluidas analisadas por SDS-PAGE, observou-se duas bandas diferenciais possivelmente relacionadas a interação entre proteínas do extrato e o peptídeo MK58911, podendo ser estas, indicativos para a explicação dos mecanismos exercidos por este peptídeo.
Estudo da eficácia e segurança in vitro do ácido gentísico incorporado em emulsões para administração cutânea
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-07-13) Cunha, Luciano Borges ; Corrêa, Marcos Antônio ; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A aplicação tópica do ácido gentísico é de interesse tanto acadêmico quanto mercadológico visto o amplo espectro de funções. Já foram identificadas atividades como: adstringente, antioxidante, anti-inflamatória, antitumoral dentre outras. Além das funções é importante elucidar as possíveis formas de administração do fármaco. Neste trabalho, desenvolveu-se emulsões com ácido gentísico onde se avaliou sua estabilidade e o processo de liberação do ativo. Como parâmetros de eficácia avaliou-se o potencial antioxidante e antimicrobiano. Já em termos de segurança o potencial citotóxico. Na quantificação do ativo houve o desenvolvimento de três metodologias analíticas. A mais eficiente, a espectrofotometria de fluorescência, foi validada com limites de detecção de 1,01 e quantificação de 3,07 µg/L. Os resultados foram: atividade antioxidante medida pelo método cinético de DPPH com a razão molar, EC50 de 0,09, antioxidant reducing power (ARP) de 11,1; a concentração inibitória mínima (MIC) frente ao Staphylococcus aureus foi 4,15±0,09 mg/mL, Escherichia coli foi 4,00±0,69 mg/mL, Candida albicans foi 3,00±0,26 mg/mL e Cutibacterium acnes de 3,60±0,0 mg/mL; concentrações até 10,0; 7,3 e 4,0 mM não apresentaram citotoxicidade para as células HaCat, HDFa e HepG2, respectivamente, por método NRU; as emulsões possuem processo de liberação (IVRT) seguindo modelo de Higuchi até 2 horas, e após isso modelo de Korsmeyer-Peppa com K de 18,2529 e n de 0,4930. A substância apresenta potencial para administração cutânea com ação antioxidante e potencial citoprotetor em baixas concentrações.
Desenvolvimento e construção de uma impressora 3d para obtenção de scaffolds por meio da tecnologia FDM
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-05-29) Oliveira, Alessandro de ; Guastaldi, Antônio Carlos ; Carvalho, Jonas de ; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A tecnologia de manufatura aditiva já se tornou uma importante ferramenta para os ramos de pesquisa e de desenvolvimento de produtos nas indústrias, universidades e sociedade em geral. Devido a rapidez e baixo custo de produção de protótipos ou até mesmo partes funcionais de um mecanismo, essa tecnologia ganha espaço a cada dia e abre portas para novas linhas de pesquisa. Da mesma maneira que a área de desenvolvimento de produtos, a engenharia de tecidos tem a cada dia avançado no desenvolvimento de materiais e processos capazes de produzir tecidos, órgãos e próteses de forma rápida, segura e que possam ser implantados em organismos vivos permitindo a regeneração de tecidos perdidos ou mesmo implantados de forma a solucionar problemas de saúde ou possibilitar melhor qualidade de vida seja a um ser humanos ou animal. Dessa forma a área de engenharia de biomateriais tem trabalhado em pesquisas e desenvolvimentos de materiais que possuam propriedades adequadas a aplicação em engenharia de tecidos. Tal tarefa é dificultada pela falta de equipamentos capazes de transformar os materiais desenvolvidos em modelos tridimensionais com propriedades químicas e físicas ideais para a aplicação em regeneração óssea, seja pela indisponibilidade de impressoras adequadas ou pelo alto custo de aquisição de máquinas sofisticadas. Por este motivo, o este trabalho possibilitou o desenvolvimento de uma impressora 3d capaz de imprimir modelos tridimensionais a partir de filamentos compostos de biomaterial. Além do desenvolvimento, também foi explorado e apresentado os parâmetros de impressão de acordo com as características do biomaterial utilizado, contribuindo assim para o avanço dos estudos e ensaios práticos do comportamento desses materiais na regeneração de tecidos de forma rápida, precisa e a um custo acessível.
Aproveitamento da água residual da termorretificação do cedro indiano e avaliação do potencial de aplicação como biofertilizante
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-05-23) Santos, Victor Galvão dos ; Goveia, Danielle ; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Na busca por técnicas para reduzir a poluição ambiental, bem como de novas matérias-primas a serem utilizadas, torna-se cada vez mais comum a realização de pesquisas e estudos para aproveitamento de resíduos gerados pelas indústrias. A termorretificação da madeira produz, por suas características, um líquido residual contendo frações de matéria vegetal, oriundas da degradação parcial da madeira. Desse modo, o presente trabalho buscou avaliar o aproveitamento do líquido residual da termorretificação de madeira da espécie Acrocarpus fraxinifolius (Cedro Indiano) como biofertilizante. Foram realizados análise de macro e micronutrientes, ensaios de germinação, com sementes de milho (Zea mays), além disso, efetuaram-se testes de toxicidade, aguda (com Daphnia magna) e crônica (com Desmodesmus subspicatus), de modo a avaliar possíveis efeitos danosos do líquido residual, partindo posteriormente para a Avaliação e Identificação de Toxicidade (AIT). Utilizou-se um delineamento em blocos casualizados, aplicando-se tratamentos com concentrações de 0 (tratamento de controle); 1; 2; 3; 4 e 5 mL (ensaio de germinação). A análise química indicou teores satisfatórios de Ca, Mg, Cu, Fe, Mn, Zn e K, no que diz respeito à aplicação como biofertilizante. Durante o ensaio de germinação, as sementes que receberam doses do líquido residual não apresentaram desenvolvimento, ou seja, somente as sementes que foram irrigadas com água germinaram. Assim, os testes de toxicidade tiveram o objetivo de avaliar se o líquido é tóxico. O teste de toxicidade aguda indicou um fator de toxicidade (FT) >16 (unidade de medida que expressa quantas vezes a toxicidade de um material ultrapassa o limite estabelecido pela legislação), expressando efeitos tóxicos por parte do resíduo. Logo, o ensaio de Avaliação e Identificação da Toxicidade (AIT) foi utilizado para encontrar o composto químico tóxico presente no líquido. Desse modo, detectou-se concentrações de compostos fenólicos acima da legislação vigente (CONAMA – Resolução 430 de 2011). Tais compostos, provavelmente, originaram-se da degradação parcial da lignina presente na madeira e podem ser prejudiciais a ambientes aquáticos, devido à sua letalidade a organismos aquáticos, de modo que, mesmo em doses pequenas, pode causar a mortandade de peixes. Portanto, o líquido residual produzido durante a termorretificação da madeira de Cedro Indiano não apresentou viabilidade para aplicação como biofertilizante. Pode-se realizar tratamentos no resíduo, com o objetivo de neutralizar seus efeitos tóxicos, avaliando-se, posteriormente, sua utilização como biofertilizante ou ensaios para extração do fenol presente, para uso como matéria-prima em indústrias químicas.
Avaliação de isolados bacterianos a partir de hamsters sírios (Mesocricetus auratus) antes e após a infecção por Leishmania (Leishmania) amazonensis
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-07-29) Oliveira, Cintia Marcelo de ; Pinto, Mara Cristina ; Souza Neto, Jayme Augusto ; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Os flebotomíneos são insetos dípteros hematófagos, pertencentes à subfamília Phlebotominae, responsáveis por transmitirem o protozoário do gênero Leishmania (Trypanosomatidae), agente etiológico das leishmanioses. Estima-se que anualmente surjam entre 700.000 a 1 milhão de novos casos ao redor do mundo dessa parasitose. Durante o ano de 2020, a forma visceral da doença (LV) esteve presente em 10 países, totalizando 90% dos casos, dos quais 97% concentrados no Brasil. Em relação à leishmaniose tegumentar (LT), forma mais comum da doença, estima-se que 85% dos casos globais estejam concentrados em 10 países, dos quais, 15.484 são pertencentes ao Brasil. Uma das abordagens para o monitoramento e/ou controle dos insetos hematófagos é o estudo dos compostos orgânicos voláteis (COV) envolvidos na comunicação entre o hospedeiro e o inseto, denominados de cairomônios. Além disso, tem-se diferenças individuais na composição e concentração dos cairomônios o que, consequentemente, influencia na atratividade dos insetos. Estudos recentes têm apontado que hospedeiros infectados com parasitas, como Plasmodium spp e Leishmania infantum, podem ser mais atrativos para os insetos que os não infectados. Uma hipótese que explicaria tais alterações no padrão de voláteis emitidos é a microbiota da pele, que contém diversas espécies e cepas de bactérias capazes de produzir mais de 350 compostos voláteis diferentes. O presente projeto teve por objetivo avaliar as alterações causadas na microbiota das patas de hamsters sírios (Mesocricetus auratus) antes e após a infecção por L. amazonensis, assim como os voláteis produzidos por meio de isolamento e sequenciamento das bactérias cultiváveis, assim como os voláteis produzidos. Através da biblioteca Blastn (NCBI), foi possível identificar os gêneros das bactérias cultivadas (Bacillus e Staphylococcus), todas gram positivas. Além disso, foram realizados ensaios de microextração em fase sólida acoplado à cromatografia gasosa (CG-EM) para a identificação dos voláteis produzidos pelas bactérias cultivadas. Em relação aos compostos voláteis, foram identificados 46, com destaque para o ciclooctatetraeno, biomarcador para a bactéria Staphylococcus aureus e piridina-3-carboxilato de metila, volátil que indicou a presença de bactérias do gênero Mycobacterium, potencial agravadora das lesões leishmanióticas. Através do sequenciamento genético confirmou-se a presença dos gêneros Staphylococcus spp. e Bacillus spp. nos animais saudáveis e infectados, ambos pertencentes a classe Bacilli. O estudo demonstra, portanto, a associação existente entre a liberação de diferentes COV a partir de diferentes gêneros de bactérias. Além disso, destaca-se a presença frequente do gênero Staphylococcus na pele do hospedeiro, considerada uma bactéria oportunista, capaz de, ao adentrar o organismo do hospedeiro, criar biofilmes resistentes à ação de antibióticos. Deste modo, a identificação, o entendimento e a compreensão dos COV emitidos pela microbiota presente na pele de diferentes indivíduos se fazem necessárias, uma vez que podem servir como iscas atrativas passíveis de serem aplicadas no monitoramento ou controle destes insetos.
Desenvolvimento de biopolímeros à base de nanocelulose com potencial para desintoxicação humana por glifosato
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-05-29) Lessa, Suzan da Silva ; Goveia, Danielle ; Tonello, Paulo Sergio ; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Para a economia brasileira, a produção agrícola é um dos setores mais importantes e se mostrou fundamental e resiliente nos anos de crise provocada pela pandemia da Covid-19. Em contrapartida, o uso intenso de agrotóxicos, tem causado intoxicação, poluição do meio ambiente etc. Quanto à intoxicação humana, o glifosato ocupa a segunda posição nos casos que levaram a atendimento médico entre 2010 e 2019. O tratamento para a intoxicação por glifosato não tem um antídoto específico e se restringe à manutenção das funções fisiológicas e monitoramento, para casos mais graves adota-se lavagem gástrica, administração de carvão ativado e hemodiálise. Pelo exposto, esse trabalho tem por objetivo demonstrar a viabilidade para o desenvolvimento de um material natural, não tóxico e sustentável, como alternativa para a remediação nos casos de intoxicação oral por glifosato. Para a quantificação do glifosato, usamos a técnica da espectrofotometria na faixa do ultra violeta – visível (UV-VIS). Dois materiais foram testados para verificar a capacidade de remoção do glifosato em meio aquoso: 1) nanocelulose, obtida por meio do processo físico de desfibrilação da celulose e 2) nanocelulose modificada por inclusão de grupos amino. Diferentes formas das nanoceluloses foram testadas: contida em membrana de diálise, diretamente na solução, empacotada em coluna e filme seco. Esses testes com a nanocelulose obtiveram melhores resultados, com capacidade de adsorção, em média, 9% de remoção. A Nanocelulose Modificada teve capacidade de remoção do glifosato maior do que a da nanocelulose original (27,9% de remoção). Realizaram-se apenas os testes cinéticos com filmes secos, devido à facilidade, resultados de estabilidade e de interação com o glifosato. Ao verificar os resultados utilizando a quantidade de glifosato (mg) adsorvida por grama do adsorvente obtida pelos estudos cinéticos plotados no modelo de pseudoprimeira ordem (Nanocelulose: qe = 4,7 mg.g-1 e Nanocelulose Modificada: qe = 6,1 mg.g-1) conclui-se que a nanocelulose modificada apresenta potencial para promover a descontaminação de pessoas intoxicada por glifosato.
Assuntos regulatórios para biofármacos e produtos nanobiotecnológicos: uma análise documental comparativa da legislação brasileira e europeia
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-04-26) Nassur, Priscila Leone ; Primo, Fernando Lucas ; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Introdução: O cenário regulatório brasileiro foi marcado nos últimos anos por constantes atualizações e adequações para atender padronizações e harmonizações internacionais de referência. Como precursor do International Council of Harmonizations (ICH), o European Medicines Agency (EMA) é uma agência regulatória que abrange os países da União Européia (UE) e é referência em termos de regulamentação para medicamentos de uso humano, com um amplo respaldo regulatório. Tendo em vista a importância de regulamentações que assegurem a segurança, qualidade e efetividade de todos os produtos a serem registrados e a harmonização da regulamentação que permite um comércio internacional simplificado de produtos para a saúde, a regulação para produtos biológicos e nanobiotecnológicos é importantíssima para inserir o Brasil no mercado internacional de produção e comercialização destes produtos, os quais têm uma demanda crescendo exponencialmente nas últimas décadas. Objetivo: Executar uma análise documental comparativa da regulamentação dos medicamentos biológicos e nanobiotecnológicos no Brasil e na União Europeia. Métodos: Este estudo é uma análise documental das bases de dados da Anvisa e EMA. Foram incluídas legislações, resoluções, guias, orientações e documentos que regulavam o pré-registro, registro e pós-registro de produtos biológicos e nanobiotecnológicos. As variáveis extraídas foram: local de abrangência e/ou atuação, ano de publicação, vigência, tipo de documento, tipo de produto, etapa do procedimento regulatório a que se aplica e escopo do documento. Resultados: Foram localizados 4.019 resultados na busca inicial nas bases de dados incluídas. Após a avaliação de triagem e elegibilidade com base nos critérios de inclusão, foram incluídos 301 documentos para a extração de resultados e após a atualização da busca mais 17 documentos foram incluídos. Dentre os documentos analisados, a maior diferença encontrada foi na especificidade dos guias para produtos individualizados. A Anvisa apresenta Resoluções completas para os produtos biológicos em si, enquanto o EMA, além das Diretivas, também recomenda uso de guias específicos para cada tipo de medicamento. Para os produtos nanobiotecnológicos o conteúdo localizado consistiu em pareceres e artigos de opinião de moléculas específicas, ainda observando o EMA com maior especificidade, mas ambas agências com lacunas regulatórias. Conclusão: Com a harmonização regulatória da ANVISA iniciada em 2015, suas diretrizes regulatórias passaram a ter um escopo completo para guias gerais e a legislação principal dos produtos biológicos. Comparada com a Diretiva 2001/83/EC que se refere a todos os medicamentos de uso humano, a RDC 55/2010 é mais completa e específica, entretanto, considerando-se os guias adicionais e específicos publicados pelo EMA, ressalta-se a falta de orientações para produtos de alta especificidade no Brasil. Para os produtos nanobiotecnológicos, o embasamento regulatório ainda é escasso e necessita de instruções específicas para o registro, boas práticas clínicas, farmacovigilância e avaliação de qualidade e segurança.
Desenvolvimento de protótipo para remoção de biofilmes em tubulações de água do circuito de hemodiálise utilizando radiação Ultravioleta-C
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-03-29) Storion Junior, Fernando Antonio ; Almeida, Ana Maria Fusco ; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
O tratamento de hemodiálise, que realiza o processo de filtragem artificial dos rins, é altamente invasivo e torna seus pacientes imunossuprimidos. Os quase 150 mil pacientes que realizam hemodiálise por ano apresentam uma taxa anual de morte de 25% e tem a contaminação como a segunda maior causa de morte. Dentre a diversas formas que uma pessoa com doença renal crônica (DRC) tem de se contaminar, a contaminação da água é uma das mais relevantes, pois um paciente entra em contato com até 600L de água por semana, que cairá diretamente em sua corrente sanguínea. Um dos maiores problemas da contaminação da água é a formação de biofilmes nos ductos que ligam a estação de tratamento às máquinas de hemodiálise, pois trata-se de um sistema longo e interconectado que normalmente recebe apenas uma desinfecção química mensal. Esses biofilmes podem liberar endotoxinas capazes de causar diversas comorbidades e até a morte. Portanto, este trabalho traz uma solução para a esterilização de paredes dos ductos de água de hemodiálise, que é a esterilização através de LEDs emissores de radiação Ultravioleta-C (UVC), uma onda eletromagnética capaz de quebrar cadeias de DNA dos microrganismos. Este trabalho consistiu na: comprovação microbiológica de eficácia dos LEDs UVC contra os biofilmes fúngicos e bacterianos das principais espécies encontradas em circuitos de hemodiálise através da confecção de um corpo de prova que foi aplicado sobre placas de microtitulação de 96 poços; na pesquisa e construção de um protótipo que funcione como um cateter invólucro de fitas de LED UVC e que pudesse ser introduzido dentro das tubulações dos circuito de tratamento de água de hemodiálise. Resultados mostraram a viabilidade e exequibilidade do protótipo, bem como o potencial de esterilização dos LEDs UVC frente a biofilmes fúngicos de leveduras e filamentosos e biofilmes bacterianos em estado de completa maturação com uma dose de 2,3J/cm² aplicado durante 2h.
Cruzipaína (Czp1) como bioindicador no diagnóstico de Trypanosoma cruzi (Chagas, 1909) (Kinetoplastida, Trypanosomatidae) em suco de açaí (Euterpe oleraceae) por ensaio Imunoenzimático
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-03-15) Garcia, Alef Henrique ; Rosa, João Aristeu da ; Costa, Paulo Inácio da ; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
A doença de Chagas é uma enfermidade infecciosa que afeta principalmente populações carentes em países menos desenvolvidos. É endêmica em 21 países das Américas, atingindo cerca de 6 a 7 milhões de pessoas e causando uma média de 14.000 mortes anualmente. O agente causador é o protozoário flagelado Trypanosoma cruzi, que é veiculado por triatomíneos, insetos hematófagos conhecidos como "barbeiros". Este estudo teve como objetivo avaliar as proteínas secretadas pela cepa Y (TcII) de T. cruzi em sua forma tripomastigota em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Para tanto, técnicas de biologia molecular e bioquímica foram utilizadas para identificar a cisteína protease cruzipaína por anticorpos e analisar a quantidade secretada em suco de açaí por meio de Western blot. A solução de formas tripomastigotas em PBS foi utilizada como padrão para verificar se a quantidade secretada de cruzipaína era suficiente para um teste imunoenzimático. Utilizou-se o plasmídeo pET21a contendo o gene da cisteína protease natural cruzipaína Wild Type (W.T), com uma cauda His6-tag, transformado para expressão em E. coli resistente à ampicilina como controle positivo. Para a metaciclogênese induzida in vitro, utilizou-se a cepa Y de T. cruzi e camundongos heterogênicos machos da linhagem Swiss. Os animais com parasitemia alta foram eutanasiados para coleta de sangue, que foi cultivado em meio LIT. A cruzipaína recombinante expressa em Bl21 foi confirmada por Western blot com banda de 37 kDa. Os dados apresentados indicam que o método utilizado para expressar a cruzipaína em Bl21 foi eficiente, produzindo uma quantidade satisfatória de secretomas. As etapas foram consideradas efetivas para alcançar esse resultado. Os métodos são considerados preliminares e requerem validação e testes adicionais para determinar sua eficácia na detecção de cruzipaína em suco de açaí. No entanto, os resultados obtidos são promissores e ajudam a entender as propriedades da cruzipaína recombinante em ensaios imunoenzimáticos e em amostras de suco de açaí. É importante enfatizar que medidas devem ser tomadas para preservar a integridade da proteína durante o processo de quantificação de proteínas. A degradação do anticorpo usado afeta a eficiência do método dot blot.
Biofilmes monoespécie e mistos de Trichophyton e Staphylococcus: influência de nutrientes e presença de células persisters
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-04-28) Belizario, Jenyffie Araujo ; Giannini, Maria José Soares Mendes ; Pires, Regina Helena ; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Dermatófitos são fungos causadores de dermatofitose, doença fúngica que afeta os tecidos queratinizados e, a associação de fungos dermatófitos com bactérias tende a provocar um quadro infeccioso exacerbado e de difícil tratamento. Ambos os microrganismos podem formar biofilmes e a disponibilidade de nutrientes pode influenciar a capacidade de adesão e a arquitetura destes. Além disso, a resistência microbiológica e clínica dos dermatófitos pode estar associada não apenas à formação de biofilmes, mas também à presença de células persistentes (células persisters), as quais poderiam contribuir para o surgimento de infecções recalcitrantes, crônicas. Neste cenário, o objetivo deste trabalho foi caracterizar a formação de biofilme misto entre Trichophyton rubrum e Staphylococcus aureus ou Staphylococcus epidermidis em diferentes meios de cultura. Adicionalmente, foi avaliada a presença de células persistentes nos biofilmes monoespécie. Os biofilmes foram formados em diferentes tempos de incubação, meios de cultura e quantificados pelas metodologias do cristal violeta (biomassa), atividade metabólica (redução do sal de tetrazólio) e por metodologia de plaqueamento em ágar (unidades formadoras de colônia). Estes foram fotodocumentados por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia confocal de varredura a laser (CLSM). A determinação da presença de células persistentes foi realizada por ensaio de UFC após exposição à antimicrobianos. As comunidades sésseis apresentaram maior produção de biomassa e de células metabolicamente ativas em meio Brain Heart Infusion (BHI) comparativamente ao Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) e caldo Muller-Hinton (MHI). Ambas as espécies bacterianas, quando combinadas com T. rubrum, foram capazes de formar biofilmes maduros em 72h nos três meios de cultura avaliados; no entanto, diferenças foram observadas entre as populações. A maior quantidade de biomassa e atividade metabólica foi presenciada quando o inóculo bacteriano foi adicionado ao biofilme fúngico nos tempos finais de formação. O ensaio de UFC mostrou que o desenvolvimento de T. rubrum, nos biofilmes mistos, foi dependente do tempo de adição da bactéria ao biofilme fúngico em formação e, a falta de pré-adesão do dermatófito prejudicou diretamente na evolução do biofilme. As eletromicrografias dos biofilmes monoespécie de T. rubrum mostraram uma extensa rede de hifas robustas e entrelaçadas, enquanto uma vasta quantidade de cocos aglomerados foi observada nos biofilmes de Staphylococcus spp. Quando combinados, o predomínio de T. rubrum ou Staphylococcus spp. foi dependente da condição de interação, sendo que as comunidades bacterianas prevaleceram nos tempos iniciais, não sendo possível observar de forma confiável a presença de estruturas do dermatófito; já nos tempos finais, a comunidade fúngica mostrou-se dominante no biofilme. Dados de CLSM mostraram que o biofilme de T. rubrum apresentou uma espessura de 363 μm, com hifas septadas, entrelaçadas e bem desenvolvidas enquanto os biofilmes de S. aureus (177 μm) e S. epidermidis (178 μm), demonstraram ampla quantidade de cocos por toda extensão do campo. Nos biofilmes mistos, as espessuras dos biofilmes nas condições de interação finais assemelharam-se ao biofilme monoespécie de T. rubrum, especialmente quando associado à S. epidermidis (369 µm). Nos tempos iniciais, no entanto, constatou-se escassas hifas com formas e tamanhos irregulares. O estudo da presença de células persistentes nos biofilmes sugeriu que a falha terapêutica com antibióticos em infecções crônicas pode estar relacionada a presença da subpopulação e que desempenha um papel significativo na tolerância do biofilme, sendo necessário selecionar antimicrobianos eficazes e em concentrações não tóxicas para garantir o sucesso no tratamento destas infecções. O conhecimento da interação entre T. rubrum e espécies de estafilococos bem como a avaliação da presença de células persistentes em biofilmes de T. rubrum são inéditos e podem contribuir para o avanço do conhecimento da resposta imunológica do hospedeiro, da resistência aos antimicrobianos e progressão da doença, além de subsidiar novos alvos terapêuticos.

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