Avaliação do perfil proteico de tecido testicular de carneiros submetidos a insulação escrotal

Abstract

Mamíferos necessitam manter a temperatura testicular entre 3 °C e 5 °C abaixo da corporal para que a espermatogênese ocorra de maneira eficiente. O estresse térmico compromete esse equilíbrio, provocando alterações moleculares que podem levar à infertilidade em machos. Este estudo avaliou as modificações no proteoma testicular de ovinos por 14 dias após insulação escrotal aguda (24 ou 48 horas). Foram utilizados 25 carneiros (Santa Inês × Dorper) reprodutivamente aptos, distribuídos em cinco grupos experimentais. O grupo controle foi castrado sem exposição ao estresse térmico, enquanto os demais grupos foram castrados 24 horas (24h), 48 horas (48h), 7 dias (7d) e 14 dias (14d) após o início da insulação escrotal de 48 horas. A orquiectomia semiaberta foi realizada com anestesia e analgesia adequadas, seguida de isolamento, fragmentação, processamento e análise dos testículos por espectrometria de massa. A análise estatística foi conduzida no MetaboAnalyst 6.0, utilizando o teste t de Student para comparação entre os grupos tratados e o controle, considerando significativas diferenças com FDR < 0,05. A análise multivariada incluiu análise de componentes principais (PCA) para identificar padrões de agrupamento e proteínas discriminantes. Proteínas com Log2FC > 1,5 e FDR < 0,05 foram consideradas diferencialmente abundantes. Os resultados foram representados por heatmaps (10 proteínas de maior variância) e volcano plots, e a interseção proteica entre grupos foi avaliada com diagramas de Venn. O estresse térmico testicular induziu alterações progressivas no proteoma testicular dos ovinos. Nos períodos iniciais (24h e 48h), as mudanças foram discretas, com poucas proteínas diferencialmente expressas (1–4) e sem separação clara entre os perfis globais, indicando sobreposição parcial entre os grupos. A análise funcional revelou ativação precoce de mecanismos antioxidantes e metabólicos, envolvendo PRDX2, PRDX4 e PGK1, bem como processos iniciais de resposta ao estresse e inflamação. Aos 7 dias, surgiram tendências de agrupamento e modulações em proteínas associadas à homeostase redox, chaperonas e remodelação nuclear, destacando-se HSPA1L, PRDX4, RPRD1A e H3F3A, refletindo impactos sobre reprodução, diferenciação sexual e maturação dos gametas. Aos 14 dias, as alterações se consolidaram, com separação clara dos perfis proteômicos e enriquecimento funcional em atividades catalíticas, ligação a nucleotídeos, reorganização do citoesqueleto e remodelação nuclear. Proteínas-chave incluíram HSPB1, PRDX4, PGK1, TUBA1B, TUBA8 e RPRD1A. Os resultados indicam que o estresse térmico provoca efeitos cumulativos, persistentes e progressivos na homeostase testicular, afetando mecanismos antioxidantes, reparo proteico, organização estrutural e, potencialmente, a função reprodutiva em ovinos.

Mammals must maintain testicular temperature approximately 3–5 °C below core body temperature to ensure efficient spermatogenesis. Thermal stress disrupts this balance, triggering molecular alterations that may lead to male infertility. This study evaluated changes in the testicular proteome of sheep over 14 days following acute scrotal insulation (24 or 48 hours). A total of 25 reproductively sound rams (Santa Inês × Dorper) were allocated into five experimental groups. The control group was castrated without exposure to heat stress, whereas the remaining groups were orchiectomized at 24 hours (24h), 48 hours (48h), 7 days (7d), and 14 days (14d) after the initiation of a 48-hour scrotal insulation period. Semi-open orchiectomy was performed under appropriate anesthesia and analgesia, followed by tissue isolation, fragmentation, processing, and mass spectrometry-based proteomic analysis. Statistical analyses were conducted using MetaboAnalyst 6.0. Student’s t-test was applied to compare treated groups to the control, with differences considered significant at FDR < 0.05. Multivariate analysis included Principal Component Analysis (PCA) to identify clustering patterns and discriminant proteins. Proteins with Log2FC > 1.5 and FDR < 0.05 were classified as differentially abundant. Results were visualized using heatmaps (top 10 proteins with highest variance) and volcano plots, and proteomic overlap among groups was assessed using Venn diagrams. Testicular heat stress induced progressive alterations in the testicular proteome. In the early periods (24h and 48h), changes were subtle, with few differentially expressed proteins (1–4) and no clear separation between global proteomic profiles, indicating partial overlap among groups. Functional analysis revealed early activation of antioxidant and metabolic responses, involving PRDX2, PRDX4, and PGK1, as well as initial stress-response and inflammatory processes. At 7 days, clustering tendencies emerged alongside modulation of proteins associated with redox homeostasis, chaperone activity, and nuclear remodeling, including HSPA1L, PRDX4, RPRD1A, and H3F3A, reflecting effects on reproduction, sexual differentiation, and gamete maturation. By 14 days, these alterations were consolidated, with clear separation of proteomic profiles and enrichment of functions related to catalytic activity, nucleotide binding, cytoskeletal reorganization, and nuclear remodeling. Key proteins included HSPB1, PRDX4, PGK1, TUBA1B, TUBA8, and RPRD1A. Overall, the findings indicate that thermal stress elicits cumulative, persistent, and progressive disturbances in testicular homeostasis, affecting antioxidant defense systems, protein repair mechanisms, structural organization, and potentially reproductive function in sheep.