Aplicação do planejamento Plackett-Burman e de moduladores epigenéticos na bioprospecção do fungo endofítico Hypoxylon investiens, isolado da alga marinha Asparagopsis taxiformis

Abstract

Os fungos endofíticos marinhos são reconhecidos como fontes promissoras de novos metabólitos bioativos, devido à sua elevada quimiodiversidade e capacidade de sintetizar compostos com potencial farmacológico. No entanto, em condições laboratoriais, muitos desses micro-organismos apresentam silenciamento gênico, resultando na inatividade de vias biossintéticas na ausência dos estímulos presentes em seu habitat natural. Para superar essa limitação, este estudo investigou o potencial metabólico do fungo Hypoxylon investiens, isolado da alga vermelha Asparagopsis taxiformis, por meio da modulação epigenética e da variação de condições físicoquímicas de cultivo. Inicialmente, foram realizados cultivos em placas de 6 poços para avaliar a tolerância do fungo a diferentes concentrações de moduladores epigenéticos, como SAHA, 5-azacitidina, nicotinamida, procaína e butirato de sódio. As análises com a plataforma GNPS indicaram um aumento na diversidade de metabólitos, evidenciado pelo maior número de nós nas redes moleculares, especialmente com o uso de SAHA, 5-azacitidina e nicotinamida. Com base nesses resultados, foi conduzido um planejamento experimental do tipo Plackett–Burman para identificar as variáveis físico-químicas mais significativas na produção metabólica. Os extratos obtidos foram analisados por UHPLC-QTOF-MS² e submetidos à metodologia de Feature-Based Molecular Networking (FBMN) na plataforma GNPS, permitindo a anotação de diversas substâncias e quantificação de features que foram utilizados como resposta no planejamento experimental. As condições que mais influenciaram positivamente a diversidade química incluíram temperaturas mais baixas (23°C), ausência de agitação e o uso dos moduladores SAHA, nicotinamida, butirato de sódio e procaína. Com esses dados, foi feito o cultivo em escala ampliada gerando os extratos Exp1 e Exp9. Diversas substâncias, foram isoladas incluindo dicetopiperazinas como ciclo(Pro-Tyr), ciclo(Pro-Phe), ciclo(Pro-Val), ciclo(Pro-Ile) e ciclo(Pro-Leu), além de compostos fenólicos e isocumarínicos, como 4-(2-hidroxietil)fenol, 6-hidroximeleína, 5-metilmeleína e (3S,4S)-3,4,8-trihidroxi-3,4- diidronaftalen-1(2H)-ona. Uma terfenilquinona possivelmente inédita foi isolada da fração Exp9 Fr3 e identificada como 4-hidroxi-3',4'',6'-trimetoxi-[1,1':4',1''-terfenil]-2',5'-diona. Nos ensaios de bioatividade, os extratos PB01, PB02, PB03, Exp9 Fr1 e Exp9 Fr3 apresentaram atividade citotóxica contra células tumorais HCT-116, enquanto PB03 e PB12 revelaram atividade antifúngica frente a Candida albicans. Esses achados evidenciam o potencial de H. investiens como fonte de novos produtos naturais e demonstram a eficácia do uso combinado de estratégias epigenéticas, planejamento experimental e ferramentas metabolômicas como o GNPS para incremento de quimiodiversidade e bioprospecção de metabólitos bioativos.

Marine endophytic fungi are recognized as promising sources of novel bioactive metabolites due to their high chemodiversity and ability to synthesize compounds with pharmacological potential. However, under laboratory conditions, many of these microorganisms exhibit gene silencing, leading to the inactivity of biosynthetic genes in the absence of environmental stimuli present in their natural habitats. To overcome this limitation, this study investigated the metabolic potential of the fungus Hypoxylon investiens, isolated from the red alga Asparagopsis taxiformis, through epigenetic modulation and variation of physicochemical cultivation conditions. Initially, cultures were conducted in 6-well plates to assess the fungus's tolerance to different concentrations of epigenetic modulators, including SAHA, 5-azacytidine, nicotinamide, procaine, and sodium butyrate. Preliminary analyses using the GNPS platform indicated an increase in metabolite diversity, evidenced by a higher number of nodes in molecular networks, particularly with the use of SAHA, 5-azacytidine, and nicotinamide. Based on these results, a Plackett–Burman experimental design was conducted to identify the most significant physicochemical variables affecting metabolic production. The obtained extracts were analyzed by UHPLC-QTOF-MS² and subjected to Feature-Based Molecular Networking (FBMN) on the GNPS platform, enabling the annotation of various substances and quantification of features, which were used as responses in the experimental design. The conditions that positively influenced chemical diversity included lower temperatures (23°C), absence of agitation, and the use of SAHA, nicotinamide, sodium butyrate, and procaine. Using these data, scaled-up cultivation was performed, generating extracts Exp1 and Exp9. After fractionation steps, several substances were isolated, including diketopiperazines such as cyclo(Pro-Tyr), cyclo(Pro-Phe), cyclo(Pro-Val), cyclo(Pro-Ile), and cyclo(Pro- Leu), as well as phenolic and isocoumarin compounds like 4-(2-hydroxyethyl)phenol, 6-hydroxymellein, 5-methylmellein, and (3S,4S)-3,4,8-trihydroxy-3,4-dihydronaphthalen-1(2H)-one. A potentially novel terphenylquinone was isolated from fraction Exp9 Fr3 and identified as 4-hydroxy-3',4'',6'-trimethoxy[1,1':4',1''-terphenyl]-2',5'-dione. In bioactivity assays, extracts PB01, PB02, PB03, Exp9 Fr1, and Exp9 Fr3 exhibited cytotoxic activity against HCT-116 tumor cells, while PB03 and PB12 demonstrated antifungal activity against Candida albicans. These findings highlight the potential of H. investiens as a source of new natural products and demonstrate the effectiveness of combining epigenetic strategies, experimental design, and metabolomic tools such as GNPS to trigger chemodiversity and in the bioprospecting of bioactive metabolites.