Caracterização taxonômica e funcional da microbiota urogenital de cães sadios: prospecção de bactérias ácido-láticas com potencial probiótico e atividade antagonista contra uropatógenos

Abstract

As cistites bacterianas são responsáveis por uma parcela importante da casuística de afecções do trato urinário na clínica de cães. Dessa forma, a antibioticoterapia é frequentemente empregada como base do tratamento clínico, porém de forma empírica em muitas das vezes, levando à aumento na pressão de seleção de cepas resistentes. Dessa maneira, a busca por terapias complementares tem instigado estudos científicos. Este estudo prospectivo in vitro teve como objetivo caracterizar bactérias ácido láticas (BAL) isoladas de cães machos e fêmeas saudáveis e uropatógenos de animais com cistite bacteriana e confrontá-los por meio de testes de competição bacteriana, além de realizar a caracterização probiótica das BAL. Os testes de competição spot on the lawn (SOTL), radial streak (RS), cross-streak modificado (CSM), agar well diffusion (AWD) e liquid coculture assay (LCA) foram utilizados para esta finalidade. Para a caracterização probiótica, as BAL foram testadas quanto à resistência ao suco gástrico, tolerância aos sais biliares, potencial de multiplicação, hidrofobicidade, produção de peróxido de hidrogênio, sensibilidade aos antimicrobianos e pesquisa de genes integrons C da classe 1. Sequenciamento de última geração (NGS) foi utilizado para análise de ambas BAL e uropatógenos. Os resultados revelaram cinco diferentes sorotipos de Escherichia coli (E. coli) uropatogênica (UPEC) e uma cepa de Klebsiella michiganensis (K. michiganensis) com pelo menos 18 genes de resistência antimicrobiana, além de plasmídeos. As BAL foram identificadas como Lacticaseibacillus casei (n=2) e Enterococcus faecalis (n=4). Uma cepa de L. casei e uma de E. faecalis apresentaram capacidade satisfatória de inibição sobre todas os sorotipos de E. coli no SOTL. Para a K. michiganensis, E. faecalis apresentou alta inibição do que L. casei no SOTL, enquanto no RS ocorreu o inverso, com destaque para L. casei. Ambas as espécies inibiram K. michiganensis no LCA, embora algumas cepas de E. faecalis não tenham demonstrado atividade no AWD e CSM. Todas as cepas demonstraram algum grau de tolerância ao suco gástrico, sais biliares e hidrofobicidade de moderada a alta. Além disso, houve crescimento expressivo a partir de 3h em quatro das seis LAB, todas produziram H₂O₂ e nenhuma apresentou integrons de classe 1. Em conclusão, este estudo demonstrou elevada diversidade genética, resistência antimicrobiana e conteúdo plasmidial em uropatógenos associados à cistite bacteriana canina, incluindo UPEC e K. michiganensis. As BAL espécie-específicas isoladas do trato urogenital de cães saudáveis, especialmente L. casei, apresentaram atividade antagonista e características compatíveis com potencial probiótico, devendo ser validadas em estudos ex vivo e in vivo.

Bacterial cystitis accounts for a substantial proportion of urinary tract disorders encountered in canine clinical practice. Consequently, antimicrobial therapy is frequently used as the mainstay of treatment; however, it is often prescribed empirically, thereby increasing the selective pressure for resistant strains. This scenario has encouraged scientific research into complementary therapeutic approaches. This prospective in vitro study aimed to characterize lactic acid bacteria (LAB) isolated from healthy male and female dogs and uropathogens recovered from animals with bacterial cystitis, assess their interactions through bacterial competition assays, and evaluate the probiotic properties of the LAB isolates. For this purpose, the spot-on-the-lawn (SOTL), radial streak (RS), modified cross-streak (MCS), agar well diffusion (AWD), and liquid coculture assay (LCA) methods were employed. Probiotic characterization included assessments of resistance to artificial gastric juice, bile salt tolerance, multiplication potential, hydrophobicity, hydrogen peroxide production, antimicrobial susceptibility, and screening for class 1 integron C genes. Nextgeneration sequencing (NGS) was performed for molecular analysis of both LAB and uropathogens. The results revealed five distinct uropathogenic Escherichia coli (E. coli) (UPEC) serotypes and one Klebsiella michiganensis (K. michiganensis) strain, all carrying at least 18 antimicrobial resistance genes, in addition to plasmids. LAB isolates were identified as Lacticaseibacillus casei (n = 2) and Enterococcus faecalis (n = 4). One L. casei strain and one E. faecalis strain showed strong inhibitory activity against all E. coli serotypes in the SOTL assay. Against K. michiganensis, E. faecalis showed greater inhibition than L. casei in SOTL, whereas the opposite occurred in the RS assay, with L. casei demonstrating superior activity. Both species inhibited K. michiganensis in the LCA, although certain E. faecalis strains showed no activity in AWD and MCS. All LAB strains exhibited some level of tolerance to gastric juice and bile salts, moderate to high hydrophobicity, marked growth after 3 hours for four isolates, production of H₂O₂, and absence of class 1 integrons. In conclusion, this study demonstrated high genetic diversity, antimicrobial resistance, and plasmid content in uropathogens associated with canine bacterial cystitis, including UPEC and K. michiganensis. Species-specific LAB isolated from the urogenital tract of healthy dogs, particularly L. casei, showed antagonistic activity and traits consistent with probiotic potential, warranting further validation in ex vivo and in vivo studies.