Produção de ácido ferúlico usando descarboxilase heteróloga de Klebsiella pneumoniae TD 4.7 e aplicação da enzima na produção de 4-vinilguaiacol
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Date
Advisor
Gomes, Eleni 
Alonso, Sergio Gómez
Ruller, Roberto
Coadvisor
Graduate program
Microbiologia - IBILCE
Undergraduate course
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Type
Doctoral dissertation
Access right
Acesso aberto
Abstract
Abstract (portuguese)
Derivados vinílicos comercialmente importantes podem ser obtidos em bioprocessos por descarboxilação de ácidos fenólicos, como o ácido ferúlico e o ácido p-cumárico, por enzima como a ácido ferúlico descarboxilase, resultando em compostos de valor agregado como 4-vinilguaiacol e 4-vinilfenol, respectivamente. Neste estudo, o gene que codifica a ácido ferúlico descarboxilase em Klebsiella pneumoniae TD 4.7 foi isolado e identificado como um fragmento de 504 pb, que codifica um polipeptídeo de 167 resíduos de aminoácidos. O gene foi expresso em Escherichia coli BL21(DE3), e a enzima recombinante, purificada como uma proteína de 22 kDa, com maior atividade em pH 5,5 e a 40°C. A ácido ferúlico descarboxilase recombinante foi completamente inibida por Hg+2, Zn+2, Cu+2 e Cd+2 e apresentou aumento de atividade na presença de Co+2 (aproximadamente +20%). Os valores de Km e Vmax foram estimados para o substrato ácido ferúlico em 2,95 mM e 102,10 µmol.min-1.mg-1. A enzima ácido ferúlico descarboxilase teve seu modelo predito gerado usando os programas de predição estrutural AlphaFold Multimer e Swissmodel, com um RMSD de apenas 0,7 Å, demonstrando a ausência de cisteína e pontes dissulfeto no homodímero, a presença de grandes quantidades de lisina, e os resíduos envolvidos no ciclo catalítico Tyr27, Glu134 e Asn23. A enzima foi testada para conversão dos ácidos ferúlico e p-cumarico obtidos por hidrólise de bagaço de cana de açúcar em método de extração sólido-líquido alcalina convencional. Nessa hidrólise, obteve-se 135,41 mg L-1 de ácido ferúlico e 948,82 mg L-1 de ácido p-cumárico, dos quais foram obtidos 53,58 mg L-1 de 4-vinilguaiacol e 437,89 mg L-1 4-vinilfenol, rendimentos de 43% e 55% respectivamente. Estes resultados indicaram a viabilidade do uso destes compostos obtidos de fonte renovável, para a produção de flavours naturais de valor comercial.
Abstract (spanish)
Los derivados vinílicos comercialmente importantes se pueden obtener a través de bioprocesos por descarboxilación de sus ácidos fenólicos precursores, como el ácido ferúlico y el ácido p-cumárico, que, mediante enzimas como la ácido ferúlico descarboxilasa, dan como resultado compuestos de valor añadido como el 4- vinilguayacol y el 4-vinilfenol, respectivamente. En este estudio, el gen que codifica la ácido ferúlico descarboxilasa en Klebsiella pneumoniae TD 4.7 se aisló e identificó como un fragmento de 504 pb, que codifica un polipéptido de 167 residuos de aminoácidos. El gen se expresó en Escherichia coli BL21(DE3), y la enzima recombinante se purificó como una proteína de 22 kDa, con mayor actividad a pH 5,5 y a 40 °C. La ácido ferúlico descarboxilasa recombinante fue completamente inhibida por Hg+2, Zn+2, Cu+2 y Cd+2 y mostró una mayor actividad en presencia de Co+2 (con un incremento de actividad cercano al 20%). Los valores de Km y Vmax encontrados para el sustrato ácido ferúlico fueron 2.95 mM y 102.10 μmol.min-1.mg-1, respectivamente. La estructura del enzima recombinante ácido ferúlico descarboxilasa se regeneró usando los programas de predicción estructural AlphaFold Multimer y Swissmodel, con un RMSD de solo 0.7 Å, demostrando la ausencia de enlaces de cisteína y disulfuro en el homodímero, la presencia de grandes cantidades de lisina, y residuos involucrados en el ciclo catalítico Tyr27, Glu134 y Asn23. La enzima se probó para la conversión de ácidos ferúlico y pcumárico obtenidos por hidrólisis de bagazo de caña de azúcar en un método de extracción sólido-líquido alcalino convencional. En esta hidrólisis se obtuvieron 135,41 mg L-1 de ácido ferúlico y 948,82 mg L-1 de ácido p-cumárico, a partir de los cuales, por acción del enzima recombinante, se obtuvieron 53,58 mg L-1 de 4- vinilguayacol y 437,89 mg L-1 de 4-vinilfenol, lo que representa rendimientos de conversión del 43% y del 55% respectivamente. Estos resultados indicaron la factibilidad de usar ácidos hidroxicinamicos obtenidos de fuentes renovables, para la producción de aromatizantes naturales comercialmente valiosos.
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Language
Portuguese
