Análise da força de expressão de promotores pip-box de Xanthomonas citri subsp. citri

Abstract

A bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (X.citri) é o agente causal do cancro cítrico, responsável pela devastação de pomares inteiros em países produtores de laranja, incluindo o Brasil. Na literatura é descrito que diversas bactérias fitopatogênicas possuem, em locais específicos do genoma, uma sequência consenso localizada na região promotora denominada “PIP-box” (Plant-Inducible Promoter box). As caixas PIP são responsáveis pela ativação de uma ampla gama de genes, incluindo a expressão de fatores de patogenicidade e virulência durante interações planta-patógeno. Neste estudo, realizou-se a avaliação funcional e a análise da intensidade de expressão de possíveis promotores “PIP-box” que se encontram na região 5’ não traduzida dos genes XAC0360, XAC2370 e XAC2922 de Xanthomonas citri subsp. citri isolado 306 (X. citri 306). As sequências PIP-box putativas foram fusionadas à região 5’ da sequência do gene gfp no vetor de expressão pRMF e os vetores recombinantes foram inseridos em X. citri 306 por eletroporação. A quantidade de proteína GFP produzida pelas linhagens recombinantes de X. citri 306 como resultado da ativação de cada promotor PIP-box foi avaliada por microscopia de fluorescência em duas condições diferentes: crescimento por 20 horas em meio de cultura XVM2, que simula o apoplasto e conhecido como meio indutor de expressão de genes hrp, usando como controle crescimento em meio não indutor NYG; crescimento por 5 dias após inoculação em folhas de laranja doce ‘Pêra’. Os resultados das análises demonstraram que as sequências “PIP-box” foram capazes de dirigir a transcrição do gene gfp presente à jusante, e a análise estatística mostrou que há diferença significativa entre os promotores em relação à força de expressão. Além disso, há diferenças quando se compara a força de expressão de cada promotor em meio de cultura indutor e in planta.

The bacterium Xanthomonas citri subsp. citri (X. citri) is the causative agent of citrus canker, a disease responsible for devastating entire orchards in orangeproducing countries, including Brazil. In scientific literature, it's noted that several phytopathogenic bacteria harbor a consensus sequence, known as the "PIP-box" (Plant-Inducible Promoter box), located in specific regions of their genome. PIP-box sequences play a crucial role in activating a wide array of genes, including those responsible for pathogenicity and virulence factors during interactions between plants and pathogens. This study was centered on functionally evaluating and analyzing the expression intensity of putative "PIP-box" promoters located within the 5' untranslated region of genes XAC0360, XAC2370, and XAC2922 in Xanthomonas citri subsp. citri isolate 306 (X. citri 306). To achieve this, the putative PIP-box sequences were incorporated upstream of the gfp gene sequence within the expression vector pRMF. Subsequently, these recombinant vectors were introduced into X. citri 306 through electroporation. The level of GFP protein produced by the resulting recombinant strains of X. citri 306, triggered by the activation of each PIP-box promoter, was assessed using fluorescence microscopy under two distinct conditions: growth for 20 hours in XVM2 culture medium, known to simulate the apoplast and induce the expression of hrp genes, using growth in the non-inducing NYG medium as a control; and growth for 5 days after inoculation on leaves of 'Pêra' sweet orange. The results revealed that the "PIP-box" sequences were able to drive the transcription of the downstream gfp gene, and statistical analysis further underscored significant disparities in expression strength among the promoters. Notably, variations were observed in the expression strength of each promoter between inducing culture medium and in planta conditions.