Studies on the function of the leishmania major telomerase tert component in telomeres maintenance, cell proliferation, and infectivity

Abstract

Over 98 countries and territories have reported cases of leishmaniasis, a disease affecting nearly a million individuals annually but with ineffective remedies. Our goal was to study the function of the telomerase reverse transcriptase (TERT) in Leishmania major (LmTERT) and leverage this knowledge in developing new drugs. The TERT component contains the catalytic core of telomerase, the enzyme responsible for elongating telomeres and maintaining genome stability. A loss of function study using CRISPR-Cas9 and inhibition of the telomerase in L. major was conducted. Probe-specific Southern blot, PCR, and primer walk Sanger sequencing confirmed the efficient deletion of the TERT gene in L. major. The knockout of the TERT gene resulted in parasite growth defects, DNA fragmentation, cell cycle arrest, and problematic replication measured by flow cytometry. Progressive telomere shortening, the hallmark of TERT absence, was observed by Southern TRF and Flow-FISH assessments. We also assessed the subcellular structures of the LmTERT knockout cells against a wild type using scanning and electron microscopy and found unusual modifications in the cytoplasm, and an abundance of autophagosomes, suggesting a pro-survival autophagic mechanism. Changes in the metacyclic domain proteins were seen equally in the knockout lines. An altruistic mechanism used by the parasites was abolished. The cumulative results suggesting a compromise on parasite infective potential was confirmed by in vivo BALB/c mice infection study and in vitro bone-marrow derived macrophage infection. Significant lesion development was observed in the mice infected with control parasites against those infected with the knockout lineage. A consistently higher infectivity index was observed for control versus knockout lineages at 48 h post-inoculation. Consistent with the growth challenges and telomere shortening, preliminary tests of the inhibition of the telomerase using BIBR1532, a non-nucleoside small molecule, resulted in shorter telomeres and poor parasite growth. These results together suggest the usefulness of LmTERT to the parasite, putting the protein in a space to be explored for drug development against leishmaniasis.

Mais de 98 países e territórios notificam casos de leishmaniose, uma doença que afeta quase um milhão de pessoas anualmente, e contra a qual não há tratamento e controle eficazes. Nosso objetivo foi estudar a função do componente transcriptase reversa da telomerase (TERT) em Leishmania major (LmTERT) e verificar se a LmTERT poderá ser considerada alvo para o desenvolvimento de novos medicamentos para tratar a leishmaniose. O componente TERT contém o núcleo catalítico da telomerase, a enzima responsável pelo alongamento dos telômeros e pela manutenção da estabilidade do genoma. Neste estudo utilizamos um sistema CRISPR-Cas9 já padronizado, para induzir o nocaute total e por substituição do gene TERT e inibição da telomerase em L. major. Southern blot usando sondas específicas, PCR e sequenciamento Sanger do tipo “primer-walking” confirmaram que as duas metodologias induziram a deleção eficiente dos dois alelos do gene TERT em L. major. O nocaute do gene TERT teve efeitos no crescimento do parasito, induzindo parada do ciclo celular e problemas na proliferação. O encurtamento progressivo dos telômeros, a marca registrada da ausência de TERT, foi observado tanto de forma qualitativa por Southern TRF como quantitativa por Flow-FISH. Além disso, as linhagens mutantes apresentavam aumento de danos ao DNA e problemas de replicação. As estruturas subcelulares das células nocaute LmTERT comparadas ao tipo selvagem por microscopia eletrônica e de varredura, evidenciaram modificações incomuns no citoplasma e uma abundância de autofagossomos, sugerindo um mecanismo autofágico pró-sobrevivência. Um mecanismo altruísta utilizado pelos parasitas foi abolido, e a análise proteômica demonstrou a existência de alterações na constituição do lipofosfoglicano (LPG) de superfície com expressões significativamente alteradas de leishmanolisina Gp63. Alterações nas proteínas do domínio META (expressas principalmente nas formas metacíclicas) e um número superior ao normal de parasitos de fase estacionária que aglutinam lectina de amendoim, foram igualmente observadas nas linhagens nocaute. Os resultados cumulativos que sugerem um comprometimento do potencial infeccioso do parasita foram confirmados pelo estudo in vivo de infecção em camundongos BALB/c e infecção in vitro usando macrófagos derivados da medula óssea de camundongos BALB/c. Foi observado desenvolvimento significativo de lesões nos camundongos infectados com parasitos controle contra aqueles infectados com as linhagens nocaute. Um índice de infectividade consistentemente mais alto foi observado para linhagens controle versus nocaute 48 horas pós-inoculação. Testes preliminares usando um inibidor não-nucleosídico da telomerase, o BIBR1532, resultou em telômeros mais curtos e diminuição do crescimento do parasito. Juntos, esses efeitos pleiotrópicos causados pela ausência ou inibição da LmTERT sugerem fortemente que ela apresenta grande potencial para ser explorada como alvo para o desenvolvimento de medicamentos contra a leishmaniose.