Efeito da vitamina D em embriões na fase de pré-implantação advindos de ratas diabéticas: estudos in vivo e in vitro

Abstract

Mulheres com Diabetes mellitus tipo 2 (diabete pré-gestacional) têm um risco 2,69 vezes maior de infertilidade em comparação com mulheres sem diabetes. Além disso, o risco de infertilidade não resolvida por gravidez subsequente foi 3,40 vezes maior. O tratamento desta envolvendo dieta equilibrada, prática regular de exercícios físicos e/ou uso adequado de insulina tem impacto positivo na função reprodutiva. O objetivo foi verificar o efeito da vitamina D3 no útero de ratas diabéticas e em seus embriões para compreender melhor se esta suplementação durante o período pré-gestacional e no início da prenhez melhora as condições uterinas e o desenvolvimento embrionário, especialmente com relação ao quadro de estresse oxidativo gerado pelo diabete. Todos os protocolos deste estudo foram aprovados pela CEUA local. Ratos da linhagem Sprague-Dawley foram fornecidos por um centro especializado em produção animal e mantidos na no biotério sob condições controladas. Na vida adulta, as ratas não diabéticas (C) e diabéticas (DMod) (indução química na vida neonatal) foram tratadas durante 15 dias consecutivos com veículo (óleo de girassol) ou solução de vitamina D3 (VIT), diluída em óleo. Em seguida, foram acasaladas, continuaram sendo tratadas e, após a confirmação da prenhez (dia de prenhez- DP1), o tratamento ocorreu até o DP4. No dia seguinte, as ratas foram anestesiadas e eutanasiadas para exposição dos cornos uterinos para análises estrutural e imunoistoquímica das amostras uterinas e dos embriões para contagem, análise morfológica e de fluorescência (ROS e enzima antioxidante). p< 0,05 foi considerado como o limite de significância estatística. Em conclusão, as ratas diabéticas suplementadas com vitamina D3 tiveram redução da espessura do útero (endométrio, miométrio e perimétrio), da atividade secretora de glicogênio e do número de mastócitos ativados, além de promover acúmulo de colágeno, possivelmente pela inibição de metaloproteinases, aumentou proliferação celular e apoptose das células uterinas, dificultando o processo de remodelação uterina para receber o embrião. Os embriões de ratas diabéticas suplementadas tiveram menor número de células marcadas para GSH (antioxidante) e maior número de células positivas para MDA (oxidante). Além disso, apresentaram perda do potencial de membrana mitocondrial, conferindo comprometimento mitocondrial e consequente estresse oxidativo. Portanto, a vitamina D3, na dose e período de administração empregados, não trouxe melhoras significativas para o útero materno e para o embrião, especialmente com relação ao estresse oxidativo gerado pelo diabete, inviabilizando uma adequada implantação embrionária.

Women with type 2 diabetes mellitus (pregestational diabetes) have a 2.69-fold higher risk of infertility compared to women without diabetes. Furthermore, the risk of unresolved infertility due to subsequent pregnancies was 3.40-fold higher. Treatment of this condition involving a balanced diet, regular exercise, and/or adequate use of insulin has a positive impact on reproductive function. The objective was to verify the effect of vitamin D3 on the uterus of diabetic rats and their embryos to understand better whether this supplementation during the pregestational period and early pregnancy improves uterine conditions and embryonic development, especially concerning the oxidative stress generated by diabetes. All protocols of this study were approved by the local CEUA. Sprague-Dawley rats were provided by a center specialized in animal production and kept in the vivarium under controlled conditions. In adulthood, non-diabetic (C) and diabetic (DMod) rats (chemically induced in neonatal life) were treated for 15 consecutive days with vehicle (sunflower oil) or vitamin D3 solution (VIT) diluted in oil. They were then mated, continued to be treated and, after pregnancy confirmation (pregnancy day - DP1), treatment continued until DP4. The following day, the rats were anesthetized and euthanized for exposure of the uterine horns for structural and immunohistochemical analysis of uterine samples and embryos for counting, morphological and fluorescence analysis (ROS and antioxidant enzyme). p < 0.05 was considered as the limit of statistical significance. In conclusion, diabetic rats supplemented with vitamin D3 had reduced uterine thickness (endometrium, myometrium, and perimetrium), glycogen secretory activity, and the number of activated mast cells, in addition to promoting collagen accumulation, possibly by inhibiting metalloproteinases, increased cell proliferation and apoptosis of uterine cells, hindering the uterine remodeling process for receiving the embryo. Embryos from supplemented diabetic rats showed fewer cells stained for GSH (an antioxidant) and more cells positive for MDA (an indicator of oxidative stress). In addition, they showed loss of mitochondrial membrane potential, conferring mitochondrial impairment and consequent oxidative stress. Thus, vitamin D3, at the administered dose and treatment period, failed to induce significant improvements in either the maternal uterus or the embryo, especially regarding the oxidative stress generated by diabetes, preventing adequate embryo implantation.