Desenvolvimento de um sistema de liberação de proteínas por Bacillus subtilis

Abstract

A produção de biofármacos tem crescido rapidamente em todo o mundo, porém o processo de produção e purificação destas biomoléculas ainda demanda grande investimento financeiro. Uma solução para a redução destes custos consiste no desenvolvimento de uma linhagem produtora que gere altos rendimentos de produção e facilite a extração deste produto através da liberação da molécula-alvo para o meio extracelular. Com isso, neste trabalho, foi proposto o desenvolvimento de um Sistema de Lise Programada para produção e liberação de proteínas por Bacillus subtilis. Este sistema permitirá que a bactéria se rompa após produzir elevadas quantidades da proteína de interesse, eliminando assim a etapa de rompimento celular para a extração do produto. Foram desenvolvidas diferentes versões deste sistema utilizando a Proteína Verde Fluorescente como repórter. As diferenças entre estas versões consistem na regulação dos genes que compõem o sistema. Foram testados diferentes promotores e diferentes forças para o Sítio de Ligação do Ribossomo. Além disso, foi testada a regulação do sistema com base na Repressão Catabólica por Carbono e com base no Sistema de Quórum Sensing. Em todas as variações o sistema foi ativado, porém a versão do Sistema de Lise Programada que gerou o fenótipo de lise foi a versão responsiva à Repressão Catabólica por Carbono, em que os promotores que controlavam a expressão dos genes que constituem o sistema foram os promotores fortes para B. subtilis TP2 e Pveg. Com isso, neste trabalho foi possível desenvolver um Sistema de Lise Programada em B. subtilis o qual gerou a lise celular após a proteína repórter ser acumulada pela bactéria.

The production of biopharmaceuticals has been rapidly increasing worldwide; however, the processes of production and purification of these biomolecules still require large financial investments. A solution to reduce such costs involves the development of a producer strain capable of achieving high yields and facilitating product recovery by releasing the target molecule into the extracellular medium. In this context, the present work proposed the development of a Programmed Lysis System for the production and release of proteins by Bacillus subtilis. This system enables the bacterium to undergo selflysis after producing large amounts of the protein of interest, thereby eliminating the need for a cell disruption step during product extraction. Different versions of the system were developed using the Green Fluorescent Protein as a reporter. The main differences among these versions relied on the regulation of the genes composing the system. Various promoters and ribosome binding site strengths were tested. Additionally, the regulation of the system was assessed based on Carbon Catabolite Repression and Quorum Sensing processes. In all versions, the system was activated; however, the Programmed Lysis System variant that effectively generated the lysis phenotype was the one responsive to the Carbon Catabolite Repression, in which the strong promoters TP2 and Pveg were used. Therefore, in this study, it was possible to develop a Programmed Lysis System in B. subtilis, which successfully induced cell lysis after the accumulation of the reporter protein by the bacterium.