Bioengenharia de monócitos modificados com CD19-CAR com domínios coestimulatórios de Dectina-1 ou FcR para atuarem contra células B neoplásicas

Abstract

Leucemias e linfomas são as neoplasias hematológicas de elevado impacto em saúde pública. O CD19 é amplamente explorado como alvo terapêutico em imunoterapias celulares baseadas em receptores quiméricos de antígeno (CAR). Embora as terapias com células CAR-T tenham demonstrado elevada eficácia clínica, limitações relacionadas à atual necessidade de terapia autóloga e efeitos adversos impulsionam a investigação de estratégias alternativas, incluindo o uso de monócitos/macrófagos geneticamente modificados para expressar CAR. Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivo estabelecer plataformas celulares pré-clínicas para a avaliação funcional de monócitos CD19-CAR contendo Dectina-1 ou FcR como moléculas coestimulatórias frente a células B neoplásicas CD19+. Inicialmente, foram geradas linhagens de células B neoplásicas expressando luciferase ou EGFP, utilizadas como plataformas para análise de citotoxicidade, fagocitose e interação célula–célula. Paralelamente, foram clonadas e validadas diferentes variantes de CD19-CAR contendo combinações distintas de regiões hinge, transmembrana e domínios intracelulares derivados de receptores mieloides, como Dectina-1 e FcR. A geração e purificação de populações estáveis de células CD19-THP-1-CAR, que apresentaram taxas distintas de expressão do CAR na superfície celular. Seguidamente, realizou-se a padronização de uma plataforma funcional baseada em luciferase utilizando células CD19-8-137ζ-THP-1-CAR, e as variantes CD19-Dectin-1-THP-1-CAR e CD19-8-FcγRI-THP-1-CAR promoveram redução da bioluminescência de células Nalm-6-Luc e Daudi-Luc em comparação às células THP-1 não modificadas, efeito mais pronunciado em 6h de co-cultivo, com mantimento em 24h frente a células Nalm-6-Luc. Os resultados evidenciam o potencial de domínios de sinalização mieloides para a funcionalidade de células THP-1-CAR e demonstram que a composição estrutural do CAR, inclusive das regiões hinge e transmembrana, influencia diretamente sua eficiência de expressão. Em conjunto, este trabalho estabelece uma base experimental sólida para a investigação funcional de monócitos/macrófagos CD19-CAR e contribui para o desenvolvimento de estratégias inovadoras de imunoterapia celular direcionadas às neoplasias de células B.

Leukemias and lymphomas are hematological malignancies that impose a substantial public health burden. CD19 has been extensively explored as a therapeutic target in chimeric antigen receptor (CAR)-based cellular immunotherapies. Although CAR-T cell therapies have demonstrated remarkable clinical efficacy, limitations associated with the current reliance on autologous cell manufacturing and treatment-related toxicities have driven the development of alternative strategies, including the use of genetically engineered monocytes/macrophages expressing CARs. Within this context, the present study aimed to establish preclinical cellular platforms for the functional evaluation of CD19-CAR monocytes incorporating Dectin-1 or Fc receptors (FcR) as costimulatory signaling domains against B-cell malignancies. Initially, B-cell malignant cell lines stably expressing luciferase or EGFP were generated as experimental platforms for cytotoxicity, phagocytosis, and cell–cell interaction assays. In parallel, distinct CD19-CAR variants comprising different combinations of hinge, transmembrane, and intracellular signaling domains derived from myeloid receptors, including Dectin-1 and Fc receptors (FcRs), were cloned and validated. Stable CD19CAR-expressing THP-1 cell populations were successfully generated and purified, exhibiting distinct levels of CAR surface expression. Subsequently, a luciferase-based functional platform was established using CD19-8-137ζ-CAR THP-1 cells. Within this platform, CD19-Dectin-1-CAR and CD19-8-FcγRI-CAR THP-1 cells reduced the bioluminescence of Nalm-6-Luc and Daudi-Luc cells compared with unmodified THP1 cells. This effect was more pronounced after 6 h of co-culture and was maintained after 24 h against Nalm-6-Luc cells. These findings highlight the potential of myeloidderived signaling domains to enhance the functional activity of CAR-engineered THP1 cells and demonstrate that the structural composition of the CAR, particularly the hinge and transmembrane regions, directly influences CAR surface expression. Collectively, this study establishes a robust experimental platform for the functional investigation of CD19-CAR monocytes/macrophages and contributes to the development of innovative cellular immunotherapy strategies targeting B-cell malignancies.