Cistatina recombinante da Citrus sinensis (CsinCPI-2) induz proliferação, migração e diferenciação osteogênica de células da polpa dental humana

Abstract

As cistatinas são inibidores naturais de cisteíno proteases e desempenham um papel crítico no controle da degradação de proteínas. As cistatinas de plantas, dentre elas a cistatina produzidas de forma recombinante a partir da Citrus sinensis (CsinCPI-2), têm mostrado potencial para serem usadas em diferentes abordagens terapêuticas. Os objetivos deste estudo foram avaliar a citocompatibilidade e o efeito da fitocistatina CsinCPI-2 sobre a proliferação, migração e diferenciação osteogênica de células da polpa dental humana (hDPCs). Previamente à realização dos ensaios, as hDPCs foram caracterizadas quanto a expressão de marcadores de células tronco mesenquimais por meio de citometria de fluxo. hDPCs expostas à CsinCPI-2 e não expostas (controle) foram avaliadas quanto à viabilidade celular por meio dos ensaios de metiltiazol tetrazólio (MTT) e alamar blue, apoptose por meio de citometria de fluxo, atividade da fosfatase alcalina (ALP) por meio do cálculo da liberação de timolfitaleína, produção de nódulos mineralizados por meio de coloração com vermelho de alizarina, migração celular pelo ensaio de transwell, proliferação por meio de ensaio de incorporação de bromodeoxiuridina (BrdU) e expressão gênica de proteína morfogenética óssea 2 (BMP-2), fator de transcrição osteogênica (RUNX2), fosfatase alcalina (ALP), osteocalcina (OC), sialoproteína óssea (BSP) e proteína da matriz da dentina (DMP-1) por meio da reação da polimerase em cadeia em tempo real quantitativa (qPCR).Os dados foram analisados por análise de variância (ANOVA) one way e pós-teste de Turkey, ANOVA two way e pós-teste de Bonferroni ou teste t (α = 0,05). As hDPCs utilizadas nos ensaios mostraram marcação positiva para células tronco mesenquimais (CD105, CD90, CD73, CD146) e negativa para células hematopoiéticas e endoteliais (CD45, CD34). A CsinCPI-2 foi citocompatível e não induziu apoptose. Houve maior formação de nódulos mineralizados, atividade de ALP, proliferação e migração celular e maior expressão dos genes BMP-2, RUNX2, ALP, OC. BSP e DMP-1 no grupo da CsinCPI-2 em relação ao controle (P < 0,05). Em conclusão, a CsinCPI-2 foi citocompatível, induziu migração e prolifereção celular, bem como a diferenciação de hDPCs em fenótipo osteogênico. Portanto, a CsinCPI-2 pode ser uma molécula promissora para ser utilizada em técnicas de regeneração/reparação pulpar e periapical.

Cystatins are natural inhibitors of cysteine proteases and play a critical role in controlling protein degradation. Plant cystatins, among them a cystatins recombinantly produced from Citrus sinensis (CsinCPI-2), have shown potential to be used in different therapeutic approaches. The objectives of this study were to evaluate the cytocompatibility and effect of phytocystatin CsinCPI-2 on the proliferation, migration and osteogenic differentiation of human dental pulp cells (hDPCs). Previously to the performing the assays, hDPCs were characterized for the expression of mesenchymal stem cell markers by flow cytometry. hDPCs exposed to CsinCPI-2 and unexposed (control) were evaluated from cell viability by the methylthiazole tetrazolium (MTT) and alamar blue assays, apoptosis by flow cytometry, alkaline phosphatase (ALP) activity by calculation of thymolphtalein release, production of mineralized nodules by alizarin red staining, migration cells by Transwell assay, proliferation by bromodeoxyridine (BrdU) incorporation assay and gene expression of bone morphogenetic protein 2 (BMP-2), transcription factor (RUNX2), alkaline phosphatase (ALP), osteocalcin (OC), bone sialoprotein (BSP) and dentine matrix protein -1 (DMP-1) by quantitative real time PCR (qPCR). The data were analyzed by one-way analysis of variance (ANOVA) and Turkey post-test, two-way ANOVA and Bonferroni post-test or t-test (α = 0.05). hDPCs used in assays showed positive marking for mesenchymal stem cells (CD105, CD90, CD73, CD146) and negative to hematopoietic and endothelial cells (CD45, CD34). CsinCPI-2 was cytocompatible and induced no apoptosis. There was greater formation of mineralized nodules, ALP activity, proliferation and migration cells and greater expression of BMP-2, RUNX2, ALP, OC, BSP and DMP-1 genes in CsinCPI-2 group compared to control (P < 0, 05). In conclusion, CsinCPI-2 was cytocompatible, induced cell migration and proliferation, as well as differentiation of hDPCs into osteogenic phenotype. Therefore, CsinCPI-2 may be a promising molecule for used in pulp and periapical regeneration/repair techniques.