Desenvolvimento de método bioanalítico “VERDE” em HPLC para monitorização terapêutica de clozapina e N-Desmetilclozapina (Metabólito ativo) em plasma de pacientes psiquiátricos

Abstract

A esquizofrenia é uma doença que atinge o sistema nervoso central (SNC) e é definida como um transtorno psicótico maior, caracterizado por sintomas psicóticos positivos e negativos. O tratamento farmacológico é realizado com a administração de antipsicóticos, dentre eles a clozapina (CLZ), um antipsicótico atípico que não causa efeitos adversos extrapiramidais. Porém, o seu uso tem sido relacionado com casos de agranulocitose e, por isso, passou a ter um olhar mais rigoroso, tanto na prescrição quanto no acompanhamento de pacientes. A clozapina é um fármaco absorvido no trato gastrointestinal e majoritariamente metabolizado pelo fígado, pelas isoenzimas do citocromo P450 (CYP). Destas, a CYP1A2 é a principal enzima no metabolismo da clozapina, levando, juntamente a outras enzimas, à formação do metabólito N-desmetilclozapina, sendo este farmacologicamente ativo. O uso de antipsicóticos requer muitas vezes a Monitorização Terapêutica de Fármacos (TDM) para controle e determinação dos fármacos e metabólitos ativos em amostras biológicas, como plasma, soro ou urina. A TDM objetiva a manutenção das concentrações plasmáticas do fármaco em faixas terapêuticas, auxiliando na eficácia do tratamento e no manejo de reações adversas a medicamentos (RAMs). O objetivo do presente projeto é realizar a adequação e padronização de metodologias já descritas para monitorização terapêutica da clozapina e N-desmetilclozapina (metabólito ativo) em plasma de pacientes, de modo a eliminar solventes prejudiciais ao meio ambiente do método bioanalítico. Foram utilizados cromatógrafos Shimadzu® HPLC-UV-VIS e Waters® HPLC ACQUITY QDa, equipados com coluna C18 (5 µm, 4,6 mm x 250 mm) e injetor automático. O comprimento de onda analisado foi de 254 nm (HPLC UV-VIS), e foi busca pelas m/z 313 (N-Desmetilclozapina), 321 (N-Desmetilclozapina D8) e 327 (clozapina) no HPLC-MS. A fase móvel foi avaliada com diferentes proporções e combinações dos solventes acetato de amônio 10 mM (ajustado para diferentes pH com ácido acético glacial), acetonitrila (ACN), metanol e etanol, em método isocrático, com vazão de 1000 μL/min, e volume de injeção de 20 ou 50 μL. A extração das amostras foi realizada por desproteinização por adição de acetonitrila e metanol gelados, e a concentração das amostras por evaporação dos solventes e ressuspensão em menor volume O método cromatográfico que apresentou, numa perspectiva geral, melhor resultado foi o modo isocrático, em HPLC-MS, com fase móvel 73:27 de tampão acetato (acetato de amônio 10 mM, pH 2,8) e etanol, respectivamente, com volume de injeção de 50 μL, tempo de análise de 20 minutos.

Schizophrenia is a disease that affects the central nervous system (CNS) and is defined as a major psychotic disorder, characterized by positive and negative psychotic symptoms. Pharmacological treatment is performed with the administration of antipsychotics, including clozapine (CLZ), an atypical antipsychotic that does not cause extrapyramidal adverse effects. However, the use of clozapine has been associated with cases of agranulocytosis and, therefore, its use has become more rigorous in the prescription and in the follow-up of these patients. Clozapine is a drug absorbed from the gastrointestinal tract and mostly metabolized by the liver, by cytochrome P450 (CYP) isoenzymes. Of these, CYP1A2 is the main enzyme in the metabolism of clozapine, leading, together with other enzymes, to the formation of the metabolite N-desmethylclozapine, which is pharmacologically active. The use of antipsychotics often requires Therapeutic Drug Monitoring (TDM) to control and determine active drugs and metabolites in biological samples, such as plasma, serum or urine. TDM aims to maintain drug plasma concentrations within therapeutic ranges, helping to effectively treat the disorder and manage adverse drug reactions (ADRs). The objective of this study is to adapt and standardize methodologies already described for therapeutic monitoring of clozapine and N-desmethylclozapine (active metabolite) in patient plasma, in order to eliminate solvents harmful to the environment from the bioanalytical method. In this work, were used: Shimadzu® HPLC-UV-VIS and Waters® HPLC ACQUITY QDa chromatographs, equipped with a C18 column (5 µm, 4.6 mm x 250 mm) and an automatic injector. The analyzed wavelength was 254 nm (HPLC UV-VIS), and m/z 313 (N-Desmethylclozapine), 321 (N-Desmethylclozapine D8) and 327 (clozapine) were searched on the HPLC-MS. The mobile phase was evaluated with different proportions and combinations of 10 mM ammonium acetate solvents (adjusted to different pH with glacial acetic acid), acetonitrile (ACN), methanol and ethanol, in an isocratic method, with a flow coefficient of 1000 μL/min, and injection volume of 20 or 50 μL.Samples were extracted by deproteinization by adding cold acetonitrile and methanol, and samples were concentrated by solvent evaporation and resuspension in a smaller volume. The chromatographic method that presented, in a general perspective, the best result was the isocratic mode, in HPLC-MS, with mobile phase 73:27 of acetate buffer (10 mM ammonium acetate, pH 2.8) and ethanol, respectively, with volume of 50 μL injection, analysis time of 20 minutes.