Detecção e caracterização molecular de hemoparasitos em antas (Tapirus terrestris) de vida livre no Brasil

Abstract

A anta brasileira (Tapirus terrestris) é o maior mamífero terrestre do Brasil. Atualmente, essa espécie é considerada vulnerável à extinção em todo o país. O presente trabalho teve como objetivos detectar e caracterizar agentes das famílias bacterianas Mycoplasmataceae, Bartonellaceae, Anaplasmataceae, Coxiellaceae e Borreliaceae; e também das famílias de protozoários Babesiidae, Theileriidae e Hepatozoidae em amostras de sangue de antas de vida-livre do Cerrado e Pantanal, por meio de técnicas moleculares. Entre 2013 a 2018, amostras de sangue de T. terrestris de vida-livre foram coletadas de 94 indivíduos vivos e 8 atropelados, totalizando 125 amostras (alguns animais vivos foram amostrados mais de uma vez em momentos diferentes), no Estado do Mato Grosso do Sul. A coleta de sangue foi realizada pelos profissionais da Iniciativa Nacional para a Conservação da Anta Brasileira (INCAB-IPÊ). Desse total, 78 (78/125; 62.4%) amostras foram coletadas de 61 antas (61/94; 64,89%) no Pantanal e 39 amostras (39/125; 31,2%) foram coletadas de 33 antas (33/94; 35,11%) provenientes do Cerrado. Além disso, todas as antas atropeladas (8/125; 6,4%) foram amostradas no Cerrado, totalizando 41 indivíduos deste bioma. As amostras foram submetidas à protocolos de PCR (convencional) e qPCR (PCR quantitativa). Ainda, 86 amostras foram submetidas à amplificação de um fragmento de aproximadamente 400 pb da região V3-V4 do gene bacteriano 16S rRNA, por meio de sequenciamento de nova geração, para caracterização do microbioma. Como resultado, 33,61% demonstraram resultados positivos para a pesquisa de Mycoplasma spp. (PCR para os genes 16S rRNA, 23S rRNA, RNAse P e dnaK), 52,2% para piroplasmídeos (PCR para os gene 18S rRNA, hsp70 e cox-1), 6,55% para Bartonella sp. (qPCR para o gene nuoG e PCR para o gene ribC), 18% para Anaplasma spp. (PCR para o gene 16S rRNA e espaçador intragênico ITS 23S-5S), 25,4% para Neorickettsia spp. (PCR para o gene 16S rRNA), e 2% para Borrelia spp. (qPCR para o gene 16S rRNA e PCR para o gene flaB). Nenhuma amostra foi positiva para os protocolos testados para Ehrlichia spp. (PCR para o gene dsb), Coxiella burnetii (qPCR para o elemento gênico IS1111) e Hepatozoon spp (PCR para o gene 18S rRNA). As análises filogenéticas das sequências obtidas demonstraram a presença de duas novas espécies Candidatus nesses animais: ‘Candidatus Mycoplasma haematoterrestris’ e ‘Candidatus Mycoplasma hematotapirus’; uma nova espécie de Theileria, nominada Theileria terrestres nov. sp.; ocorrência de um genótipo similar à Bartonella henselae; ocorrência de um novo genótipo de Anaplasma sp., ocorrência de Neorickettsia sp.; e Borrelia theileri, patógeno anteriormente descrito somente em animais domésticos no Brasil. Na análise do microbioma do sangue das antas, os filos Pseudomonadota, Bacillota, Mycoplasmatota, Bacterioidota e Actinomycetota mostraram-se dominantes. A análise da diversidade alpha de amostras de animais vivos demonstrou que todos os grupos avaliados compartilham as mesmas comunidades bacterianas principais. O presente trabalho descreveu a ocorrência de diferentes hemoparasitos (Mycoplasma spp., Theileria terrestris, Bartonella sp., Anaplasma sp., Neorickettsia sp. e Borrelia theileri) em T. terrestris de vida livre no Brasil, além da primeira caracterização do microbioma do sangue dessa espécie.

The lowland tapir (Tapirus terrestris) is the largest land mammal in Brazil and is considered vulnerable to extinction throughout the country. The present research aimed to detect and characterize agents from the bacterial families Mycoplasmataceae, Bartonellaceae, Anaplasmataceae, Coxiellaceae, and Borreliaceae; and also the protozoan families Babesiidae, Theileriidae, and Hepatozoidae in blood samples of wild tapirs from the Cerrado and Pantanal biomes, using molecular techniques. Between 2013 and 2018, blood samples were collected from 94 living and 8 road-killed wild tapirs, totaling 125 samples (some living animals were sampled more than once at different times), in Mato Grosso do Sul State. Blood collection was carried out by professionals from the National Initiative for the Conservation of the Brazilian Tapir (INCAB-IPÊ). Out of this, 78 (78/125; 62.4%) samples were collected from 61 tapirs (61/94; 64.89%) in the Pantanal and 39 samples (39/125; 31.2%) were collected from 33 tapirs (33/94; 35.11%) from the Cerrado. Furthermore, all road-killed tapirs (8/125; 6.4%) were sampled in the Cerrado, totaling 41 individuals from this biome. Samples were subjected to PCR (conventional) and qPCR (quantitative PCR) protocols targeting the studied agents. Furthermore, 86 samples were subjected to amplification of a fragment of approximately 400 bp from the V3-V4 region of the bacterial 16S rRNA gene, through next generation sequencing, for blood microbiome characterization. From the tested samples, 33.61% obtained positive results for Mycoplasma spp. (PCR for the 16S rRNA, 23S rRNA, RNAse P and dnaK genes), 52.2% for piroplasmids (PCR for the 18S rRNA, hsp70 and cox-1 genes), 6.55% for Bartonella sp. (qPCR for the nuoG gene and PCR for the ribC gene), 18% for Anaplasma spp. (PCR for the 16S rRNA gene and ITS 23S-5S intragenic space), 25.4% for Neorickettsia spp. (PCR for the 16S rRNA gene), and 2% for Borrelia spp. (qPCR for the 16S rRNA gene and PCR for the flaB gene). None of the samples was positive for the protocols tested for Ehrlichia spp. (PCR for the dsb gene), Coxiella burnetii (qPCR for the IS1111 gene elemento) and Hepatozoon spp (PCR for the 18S rRNA gene). Phylogenetic analyses of obtained sequences demonstrated the presence of two Candidatus species: 'Candidatus Mycoplasma haematoterrestris' and 'Candidatus Mycoplasma hematotapirus'; detection of a novel species of Theileria, named Theileria terrestris nov. sp.; detection of a Bartonella sp. genotype similar to Bartonella henselae; a novel genotype of Anaplasma sp.; detection of Neorickettsia sp.; occurrence of Borrelia theileri, a pathogen previously described only in domestic animals in Brazil, was also detected. Regarding the analysis of the tapir blood microbiome, the phyla Pseudomonadota, Bacillota, Mycoplasmatota, Bacterioidota and Actinomycetota demonstrated to be dominant. When analyzing the diversity of living animals' samples, tapir populations from all analyzed groups demonstrate that they share the dominant bacterial community members. The present research described the occurrence of different hemoparasites (Mycoplasma spp., Theileria terrestris, Bartonella sp., Anaplasma sp., Nerickettsia sp. and Borrelia theileri) in free-living T. terrestris in Brazil, in addition to the first characterization of the blood microbiome from this species.