Síntese e ensaios in vitro de análogos do peptídeo antimicrobiano “B1CTcu5” conjugados com grupamento imidazol frente a patógenos de interesse clínico

Abstract

A Candida albicans é um fungo comensal presente na microbiota dos humanos, porém em condições de desequilibrios homeostáticos, esse organismo pode se tornar patogênico, causando uma doença conhecida como candidíase, que apresenta diversas manifestações clínicas, sendo a sua forma sistêmica a mais letal, causada principalmente por fungos resistêntes as medicações empregadas na terapia. A tuberculose é um doença causada pelo Mycobacterium tuberculosis (MTB). Apesar de possuir uma alta taxa de mortalidade, essa doença apresenta um tratamento, entretanto essa terapêutica é muito prolongada e apresenta diversos efeitos adversos, levando ao abandono do tratamento e consequentemente ao aparecimento de isolados resistêntes. Tais problemáticas evidenciam a necessidade da procura de novos compostos a serem empregadas no tratamento dessas doenças. Os peptídeos antimicrobianos (PAMs) têm se destacado como moléculas promissoras, por serem proteínas de baixo peso molecular que integram o sistema de defesa inata de diversos organismos. Entre esses, as brevininas, peptídeos isolados da pele de sapos do gênero Ranidae que demonstraram atividade frente ao MTB. Análogos dessas moléculas foram sintetizados, resultando no peptídeo CRBR04. O grupamento imidazol, um anel heterocíclico de cinco membros com reconhecida atividade antimicrobiana tem sido empregado na modificação de fármacos visando aprimorar suas atividades e propriedades farmacocinéticas. Este trabalho teve como objetivo a conjugação do peptídeo CRBR04 com um grupamento imidazol, utilizando-se do aminoácido histidina. A primeira geração de peptídeos conjugados não apresentou atividade antimicrobiana satisfatória, sendo então sintetizado um segundo grupo de moléculas a partir de ensaios de machine learning. Esse segundo grupo apresentou dificuldades em sua purificação devido a suas propriedades físico-químicas. Dentre os peptídeos sintetizados, apenas o composto VC7 apresentou atividade frente ao MTB, com concentração inibitória mínima (CIM) de 90 μg/ml. Além disso, demonstrou atividade antifúngica frente a cepas sensíveis, clínicas e resistentes aos medicamentos da terapia de Candida albicans, com CIMs de 37,80 μg/mL, 102,05 μg/Ml e 138,69 μg/mL, respectivamente. Enquanto o peptídeo CRBR04 exibiu atividade similiar frente às mesmas cepas, com CIM de 150 μg/mL, sugerindo a existência de mecanismos de ação distintos entre os dois compostos. Apenas o peptídeo CRBR04 demonstrou a capacidade de inibir a formação de biofilmes de Candida albicans resistentes, entretanto não demonstrou atividade frente aos biofilmes previamente formados. Nos ensaios de citotoxicidade frente a células Caco-2, os peptídeos CRBR04 e VC7 apresentaram valores de IC50 de 52,22 μg/mL e 180,10 μg/mL, respectivamente, indicando uma baixa toxicidade seletiva de ambas as moléculas em relação a essa linhagem celular. Ensaios realizados frente a eritrócitos humanos demonstraram que os peptídeos não possuem atividade hemolítica nas concentrações testadas. Os compostos estudados demonstraram um perfil de atividade frente a espécies de Candida albicans, porém ainda apresentam algumas problemas como a alta citotoxicidade e dificuldade de síntese.

Candida albicans is a commensal fungus present in the human microbiota; however, under conditions of homeostatic imbalance, this organism can become pathogenic, causing a disease known as candidiasis, which presents several clinical manifestations. Its systemic form is the most lethal and is mainly caused by fungi resistant to the medications employed in therapy. Tuberculosis is a disease caused by Mycobacterium tuberculosis (MTB). Despite its high mortality rate, this disease has an available treatment; however, this therapy is very prolonged and is associated with several adverse effects, leading to treatment abandonment and, consequently, to the emergence of resistant isolates. These issues highlight the need to search for new compounds to be used in the treatment of these diseases. Antimicrobial peptides (AMPs) have emerged as promising molecules, as they are low– molecular-weight proteins that are part of the innate defense system of several organisms. Among these, brevinins, peptides isolated from the skin of frogs of the genus Ranidae, have demonstrated activity against MTB. Analogues of these molecules were synthesized, resulting in the peptide CRBR04. The imidazole moiety, a five-membered heterocyclic ring with recognized antimicrobial activity, has been employed in drug modification to improve biological activity and pharmacokinetic properties. This study aimed to conjugate the peptide CRBR04 with an imidazole moiety using the amino acid histidine. The first generation of conjugated peptides did not show satisfactory antimicrobial activity; therefore, a second group of molecules was synthesized based on machine learning assays. This second group showed difficulties in purification due to its physicochemical properties. Among the synthesized peptides, only compound VC7 showed activity against MTB, with a minimum inhibitory concentration (MIC) of 90 µg/mL. In addition, it exhibited antifungal activity against drug-sensitive, clinical, and drugresistant strains of Candida albicans, with MICs of 37.80 µg/mL, 102.05 µg/mL, and 138.69 µg/mL, respectively. In contrast, the peptide CRBR04 exhibited similar activity against the same strains, with an MIC of 150 µg/mL, suggesting the existence of distinct mechanisms of action between the two compounds. Only the peptide CRBR04 demonstrated the ability to inhibit biofilm formation by drugresistant Candida albicans; however, it did not show activity against preformed biofilms. In cytotoxicity assays using Caco-2 cells, the peptides CRBR04 and VC7 showed IC₅₀ values of 52.22 µg/mL and 180.10 µg/mL, respectively, indicating low selective toxicity of both molecules toward this cell line. Assays performed with human erythrocytes demonstrated that the peptides did not exhibit hemolytic activity at the tested concentrations.The studied compounds demonstrated an activity profile against Candida albicans species; however, they still present some limitations, such as high cytotoxicity and difficulties in synthesis.