Identificação do gênero e espécies de Cryptosporidium em cães e gatos

Abstract

O presente trabalho objetivou a identificação e caracterização molecular de isolados de Cryptosporidium em amostras fecais de cães e gatos, bem como o desenvolvimento de uma reação em cadeia pela polimerase (PCR) em tempo real para detecção específica de Cryptosporidium canis em amostras fecais de cães. Trezentas amostras fecais de gatos e 367 amostras fecais de cães foram colhidas nas cidades de Araçatuba e Jaboticabal (SP) e submetidas aos processos de purificação e extração de DNA. “Nested” PCR (nPCR) para o gene 18S do rRNA foi realizada para identificação de Cryptosporidium spp., seguido de seqüenciamento dos fragmentos amplificados. Uma reação de PCR em tempo real para um fragmento parcial do gene HSP70 foi padronizada para a detecção de Cryptosporidium canis em amostras fecais de cães. A positividade para Cryptosporidium spp. pela nPCR em amostras de gatos foi de 11,33% (34/300), e em amostras cães foi de 10,4% (38/367). A PCR em tempo real resultou em 15,3% (58/367) de amostras positivas para C. canis. Foi possível a identificação por meio de seqüenciamento de três amostras positivas para C. felis e seis amostras positivas para C. canis. Foi observada uma maior positividade em filhotes quando comparados a cães adultos. A sensibilidade analítica da PCR em tempo real foi de uma cópia de DNA de C. canis por reação e não foi observada amplificação inespecífica de DNA de outras espécies de Cryptosporidium. Conclui-se que cães e gatos das regiões estudadas podem se apresentar infectados por espécies zoonóticas de Cryptosporidium e a PCR em tempo real desenvolvida neste trabalho é um método sensível e específico para a detecção de C. canis em amostras fecais de cães.

This study aimed the identification and molecular characterization of Cryptosporidium isolates in stool samples from dogs and cats, as well as the development of a polymerase chain reaction (PCR) in real time to specific detection of Cryptosporidium canis in fecal samples from dogs. Three hundred fecal samples from cats and 367 fecal samples from dogs were collected in the cities of Araçatuba and Jaboticabal (SP) and subjected to the processes of purification and DNA extraction. Nested PCR (nPCR) for the 18S rRNA gene was performed for identification of Cryptosporidium spp., followed by sequencing of the amplified fragments. A real time PCR to a partial fragment of the HSP70 gene was standardized for detection of Cryptosporidium canis in dogs fecal samples. The positivity for Cryptosporidium spp. by nPCR in cats samples was 11.33% (34/300), and in dog samples was 10.4% (38/367). The real-time PCR resulted in 15.3% (58/367) of samples positive for C. canis. The sequencing of the amplified fragments allowed the identification of three samples positive for Cryptosporidium felis and six samples positive for C. canis. A higher positivity was observed in puppies and kittens when compared to adult animals. The analytical sensitivity of real-time PCR was 1 copy of DNA of C. canis and was not observed DNA amplification for other species of Cryptosporidium.We concluded that dogs and catsn of the investigated regions can present infected for zoonotic species of Cryptosporidium and the real-time PCR developed in this work is a sensitive and specific method for detection of C. canis in fecal samples from dogs.