Prospecção in silico, clonagem e expressão de uma Endoglucanase de Bacillus bombysepticus

Abstract

A prospecção de novas enzimas celulolíticas representa uma estratégia promissora para ampliar o repertório de biocatalisadores empregados na conversão da biomassa lignocelulósica em biocombustíveis e outros bioprodutos. Nesse contexto, este trabalho teve como objetivo prospectar in silico, clonar, expressar e purificar uma endo-1,4-β-glucanase codificada pelo genoma de Bacillus bombysepticus, visando à obtenção da proteína recombinante para futuras caracterizações bioquímicas. Inicialmente, foi realizada a caracterização in silico da sequência gênica por meio de análises de similaridade, alinhamento múltiplo e identificação de domínios conservados. A atividade celulolítica da bactéria foi avaliada em meio contendo carboximetilcelulose, seguida pela extração do DNA genômico, amplificação do gene por reação em cadeia da polimerase, clonagem no vetor de expressão pET-SUMO, transformação em Escherichia coli ER2566, confirmação por sequenciamento, expressão heteróloga e purificação por cromatografia de afinidade. As análises in silico classificaram a proteína como uma endoglucanase pertencente à família das glicosil hidrolases GH5, enquanto o ensaio em meio sólido confirmou a capacidade celulolítica da bactéria. A clonagem do gene foi confirmada por PCR de colônia e sequenciamento. A expressão da proteína recombinante foi detectada por SDS-PAGE e Western blotting, evidenciando uma banda compatível com a massa molecular esperada, embora também tenham sido observados fragmentos de menor massa molecular, sugerindo possível degradação proteolítica ou processamento incompleto da proteína. A purificação por cromatografia de afinidade permitiu recuperar a proteína recombinante, com maior rendimento na eluição com 200 mM de imidazol. Conclui-se que o estudo permitiu identificar e clonar uma nova endoglucanase de B. bombysepticus e obter resultados iniciais de sua expressão heteróloga e purificação, estabelecendo uma base para otimizações futuras.

The search for new cellulolytic enzymes represents a promising strategy to expand the repertoire of biocatalysts used in converting lignocellulosic biomass into biofuels and other bioproducts. In this context, this study aimed to prospect in silico, clone, express, and purify an endo-1,4-β-glucanase encoded by the Bacillus bombysepticus genome, with the goal of obtaining the recombinant protein for future biochemical characterization. Initially, the gene sequence was characterized in silico through similarity analyses, multiple sequence alignment, and the identification of conserved domains. The bacterium's cellulolytic activity was evaluated in a medium containing carboxymethylcellulose, followed by genomic DNA extraction, gene amplification via polymerase chain reaction (PCR), cloning into the pET-SUMO expression vector, transformation into Escherichia coli ER2566, sequence confirmation, heterologous expression, and purification via affinity chromatography. In silico analyses classified the protein as an endoglucanase belonging to the GH5 glycosyl hydrolase family, while the solid-medium assay confirmed the bacterium's cellulolytic capability. Gene cloning was confirmed by colony PCR and sequencing. Recombinant protein expression was detected via SDS-PAGE and Western blot, revealing a band consistent with the expected molecular mass; however, lower molecular mass fragments were also observed, suggesting possible proteolytic degradation or incomplete protein processing. Affinity chromatography purification enabled the recovery of the recombinant protein, with the highest yield obtained during elution with 200 mM imidazole. In conclusion, this study successfully identified and cloned a new endoglucanase from B. bombysepticus and yielded initial results regarding its heterologous expression and purification, establishing a foundation for future optimization.