Avaliação do efeito da 2-chalcona mediada pela terapia fotodinâmica nos biofilmes mono e dual-espécies de Candida spp. e dermatófitos e mecanismos de interação desses microrganismos no biofilme misto

Abstract

As dermatomicoses são causadas por uma variedade de fungos, sendo os dermatófitos e as leveduras os de maior prevalência, na forma isolada ou associada. Os fungos dermatófitos e as espécies de Candida são capazes de formar biofilmes, que são associados ao aumento da virulência, da resistência aos fármacos e, consequentemente, da persistência da infecção. Assim, há necessidade de estudos de biofilmes com estes fungos e ampliação do arsenal terapêutico. O estudo pretendeu aprofundar o conhecimento sobre os biofilmes mono e dual espécies de Candida e dermatófitos e avaliação da acao antifúngica da 2-hidroxichalcona (2-chalcona), sua toxicidade e mecanismo de ação. Para tal, foi estudada a formação de biofilmes de Microsporum canis, e a capacidade antibiofilme da 2-chalcona no escuro e mediada por terapia fotodinâmica (PDT), a sua toxicidade in vitro em modelo de monocamada celular (2D) e em modelo tridimensional (3D) em linhagens de queratinócitos de pele humana (HaCat) e fibroblasto dérmico humano (HDFa) e, in vivo em larvas de Caenorhabditis elegans e Galleria mellonella. Além disso, foram estudados os fatores que promovem a inibição na interação dos dermatófitos e C. albicans/C. parapsilosis nos biofilmes. Os biofilmes de M. canis foram caracterizados por meio de quantificação da atividade metabólica, biomassa, estruturas polissacarídicas e matriz extracelular em RPMI 1640, caldo BHI, DMEM e HAM-F12. Os testes de sensibilidade foram conduzidos em isolado clínico de M. canis e cepas de referência de Trichophyton rubrum, T. mentagrophytes, C. albicans e C. parapsilosis frente à 2-chalcona e aos antifúngicos convencionais. A 2-chalcona (no escuro e mediada pela PDT) e antifúngicos convencionais foram avaliados quanto à capacidade de inibir as células planctônicas (106 cel/ml) e os biofilmes, mono e dual-espécies, no estágio inicial e maduro. Os danos causados pela 2-chalcona nos biofilmes foram documentados por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia confocal (MC). Foram quantificados os esteróis da membrana, a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), os danos causados na parede celular e mecanismo de morte em células tratadas com 2-chalcona no escuro e fotoexcitada. Foi também avaliada o efeito do sobrenadante livre de células dos biofilmes de T. rubrum, C. albicans ou de C. parapsilosis quanto a capacidade de inibir os biofilmes e a filamentação de C. albicans por meio de redução de XTT, MEV e MC. M. canis foi capaz de formar biofilmes robustos em 96 horas de incubação nos meios BHI, DMEM e HAM-F12 e em menor escala no meio RPMI-1640. A 2-chalcona inibiu os biofilmes no estágio inicial e maduros de dermatófitos em concentrações superiores ou igual a 31,25 mg/L. Quando a 2-chalcona foi mediada pela PDT, houve redução das concentrações de inibição nas células planctônicas e nos biofilmes em quatro vezes quando comparada com a 2-chalcona no escuro. Os resultados de imagem por MEV e MC mostraram um total colapso das células com expressiva redução da espessura dos biofilmes. Já nos biofilmes de Candida e biofilmes dual-espécies, a 2-chalcona mostrou-se menos potente, embora a fotoexcitação tenha reduzido a sua concentração inibitória mínima. Os biofilmes de dermatófitos foram resistentes ao fluconazol e à terbinafina, assim como nos biofilmes mono e dual espécies frente ao itraconazol, fluconazol e caspofungina. Toxicidade da 2-chalcona no escuro e fotoexcitada foi observada em concentrações acima de 125 mg/L nos modelos 2D e 3D de células e C. elegans. Em G. mellonella, a 2-chalcona não mostrou toxicidade até em concentrações de 200 mg/kg. O tratamento com a 2-chalcona causou deformidade na parede celular fúngica, redução de esteróis da membrana citoplasmática e promoveu a geração de ROS, resultando, por conseguinte, em morte celular por apoptose e necrose. Os sobrenadantes livres de célula não reduziram as atividades metabólicas dos biofilmes, no entanto, houve redução de sua espessura. Verificou-se ainda que a inibição da filamentação de C. albicans nos biofilmes mistos de T. rubrum e C. albicans foi influenciada pela interação direta entre os microrganismos. Sendo assim, este estudo abre portas para desvendar a os mecanismos de interação entre microrganismos no biofilme misto e aponta a 2-chalcona mediada por PDT como uma alternativa terapêutica potente para o tratamento das dermatofitoses.

Various fungi may cause dermatomycoses, and dermatophytes and yeast are the most prevalent, either isolated or associated. Dermatophyte and Candida species can form biofilms associated with increased virulence, drug resistance, and, consequently, the persistence of infection. Therefore, it is necessary to intensify studies in biofilms and expand the therapeutic arsenal. The study aimed to deepen the mono and dual-species biofilms of Candida sp and dermatophytes, as well as a new antifungal agent, its toxicity, and mechanism of action. Therefore, the formation of Microsporum canis biofilms and other dermatophytes was studied. The antibiofilm capacity of 2- hydroxychalcone (2-chalcone) was evaluated in the dark and mediated by photodynamic therapy (PDT), as well as its in vitro toxicity in a cell monolayer model (2D), and a three-dimensional model (3D) using human skin keratinocyte (HaCat) and human dermal fibroblast (HDFa) lines, and in vivo in Caenorhabditis elegans and Galleria mellonella larvae. In addition, factors that promote inhibition of the interaction of dermatophytes and C. albicans and C. parapsilosis in biofilms were studied. M. canis biofilms were characterized by quantifying metabolic activity, biomass, polysaccharide structures, and extracellular matrix in RPMI 1640, BHI broth, DMEM, and HAM-F12. Susceptibility assays were carried out on clinical isolates of M. canis and reference strains of Trichophyton rubrum, T. mentagrophytes, C. albicans, and C. parapsilosis against 2-chalcone and conventional antifungals. 2- chalcone (in the dark and mediated PDT) and commercial antifungals were evaluated for their ability to inhibit planktonic cells (106 cel/ml), mono and dual-species biofilms in the initial and mature stages. Membrane sterols, reactive oxygen species (ROS) production, cell wall damage, and death mechanism were verified in cells treated with 2-chalcone in the dark and photoexcited. The effect of cell-free supernatant from T. rubrum, C. albicans or C. parapsilosis biofilms was also evaluated on the ability to inhibit biofilms and C. albicans filamentation by reducing XTT, SEM, and CM. M. canis was able to form robust biofilms in 96 hours of incubation on BHI, DMEM, and HAM-F12 media than on RPMI-1640 media. 2-chalcone inhibited initial and mature dermatophyte biofilms at concentrations greater than or equal to 31.25 mg/L. 2-chalcone PDT-mediated reduced the inhibition concentrations in planktonic cells and biofilms by 4-fold compared to 2-chalcone in the dark. The SEM and MC images showed a total collapse of the cell walls with a significant thickness reduction of the biofilms. In Candida biofilms and dual-species biofilms, 2-chalcone was less potent, although photoexcitation reduced its minimum inhibitory concentration. Dermatophyte biofilms were resistant to fluconazole and terbinafine. The same was observed in mono and dual-species biofilms against itraconazole, fluconazole and caspofungin. The 2D and 3D models of cell lines and C. elegans showed the toxicity of the 2-chalcone in dark and photoexcited at concentrations above 125 mg/L. In G. mellonella, 2-chalcone did not show toxicity even at 200 mg/kg concentrations. Treatment with 2- chalcone caused deformity in the fungal cell wall, reduced membrane sterols, and promoted ROS generation, resulting in cell death by apoptosis and necrosis. Cell-free supernatants did not reduce the metabolic activities of the biofilms; however, there was a reduction in the thickness of the biofilms. The direct interaction between the microorganisms influenced the filamentation inhibition of C. albicans in the mixed biofilms of T. rubrum and C. albicans. Therefore, this study opens doors to unravel the mechanisms of interaction between microorganisms in the mixed biofilm and points to PDT-mediated 2-chalcone as a potent therapeutic alternative for the treatment of dermatophytosis.