Proteínas de interação da EPPIN no espermatozoide humano: potenciais papéis na fertilidade e na contracepção masculina

A proteína espermática EPPIN (Epididymal Protease Inhibitor) é um alvo para contracepção masculina, devido ao seu papel na modulação da motilidade espermática. Composta por dois domínios inibidores de protease, um do tipo Kunitz (C-terminal) e outro do tipo WFDC (N-terminal), a EPPIN atua como um centro de interações proteicas no espermatozoide, destacando-se a sua ligação com a SEMG1 (semenogelina-1), proteína mais abundante do plasma seminal. O complexo EPPIN/SEMG1 promove a inibição da motilidade espermática após a ejaculação. A aquisição da motilidade ocorre após a clivagem proteolítica da SEMG1 pela PSA (antígeno prostático específico), enzima secretada pela próstata, o que também resulta na liquefação do sêmen. Estudos do nosso grupo mostraram que anticorpos anti-EPPIN específicos aos domínios Kunitz e WFDC comprometem a motilidade espermática e as taxas de fertilização in vitro em camundongos. Além disso, moléculas sintéticas miméticas à SEMG1, como o composto EP055, inibem a motilidade espermática em modelos não humanos via interação com a EPPIN. Apesar desses avanços, os mecanismos pelos quais a EPPIN exerce suas funções e sua localização subcelular no espermatozoide humano carecem de elucidação. Portanto, este trabalho teve como objetivo caracterizar o interactoma da EPPIN e sua localização celular no espermatozoide humano. Por meio de ensaios de coimunoprecipitação seguidos de espectrometria de massas (LC-MS/MS), observamos que os domínios da EPPIN se associam tanto a proteínas intrínsecas do espermatozoide, essenciais à função espermática, como AKAP4 e GAPDHS, quanto a proteínas do plasma seminal já conhecidas por interagirem com a EPPIN, como CLU, LTF e SEMG1. Corroborando esses resultados, a EPPIN foi detectada em frações subcelulares associadas à membrana e a proteínas solúveis, bem como em frações associadas ao núcleo, organelas e estruturas acessórias do flagelo. Ensaios de imunofluorescência revelaram a distribuição diferencial da EPPIN e sua colocalização com proteínas parceiras como a SEMG1, principalmente na região equatorial da cabeça e nas peças de conexão, intermediária e principal do flagelo. Também observamos a sua colocalização com a AKAP4 no flagelo espermático, interação que foi confirmada por ensaios de ligação por proximidade. A associação da EPPIN tanto a proteínas intrínsecas do espermatozoide quanto a proteínas seminais revela o seu papel multifuncional. Este trabalho amplia o conhecimento sobre a biologia do espermatozoide, contribuindo tanto para o desenvolvimento de novas estratégias para o diagnóstico da infertilidade masculina quanto para o desenho racional de ligantes da EPPIN aplicáveis à contracepção masculina não hormonal.

Resumo (inglês)

The sperm associated protein EPPIN (Epididymal Protease Inhibitor) is a target for male contraception due to its ability to modulate sperm motility. Composed of two protease inhibitor domains, a Kunitz-type domain (C-terminal) and a WFDC-type domain (N-terminal), EPPIN acts as a central hub for protein interactions in the spermatozoa, highlighting its binding to SEMG1 (semenogelin-1), the most abundant protein in seminal plasma. The EPPIN/SEMG1 complex inhibits sperm motility after ejaculation. The acquisition of motility occurs after SEMG1 proteolytic cleavage by PSA (prostatic specific antigen), an enzyme secreted by the prostate, which also results in semen liquefaction. Studies from our group have shown that anti-EPPIN antibodies targeting epitopes on the Kunitz and WFDC domains inhibit sperm motility and in vitro fertilization rates in mice. Furthermore, synthetic SEMG1- mimetic molecules, such as EP055, inhibit sperm motility in non-human models by interacting with EPPIN. Despite these advances, the mechanisms underlying EPPIN’s functions, as well as its subcellular localization in human spermatozoa, remain poorly understood. Thus, this study aimed to characterize the EPPIN interactome and its subcellular localization in human spermatozoa. Using co-immunoprecipitation assays followed by mass spectrometry (LC-MS/MS), we found that EPPIN domains associate with both intrinsic proteins of human spermatozoa essential for sperm function, such as AKAP4 and GAPDHS, and seminal plasma proteins already known to interact with EPPIN, such as CLU, LTF, and SEMG1. Consistent with these results, EPPIN was detected in membraneassociated and soluble protein fractions, as well as in fractions associated with the nucleus, organelles, and flagellar accessory structures. Immunofluorescence assays revealed the differential distribution of EPPIN and its colocalization with its binding partner SEMG1, mainly in the equatorial region of the head and in the connecting piece, midpiece, and principal piece of the flagellum. We also observed its colocalization with AKAP4 in the sperm flagellum, an interaction confirmed by proximity ligation assays. The association of EPPIN with both intrinsic sperm proteins and seminal proteins reveals its multifunctional role in human spermatozoa. This work expands current knowledge on sperm biology, contributing both to the development of new diagnostic strategies for male infertility and to the rational design of EPPIN ligands focused on non-hormonal male contraception.

Palavras-chave

Contracepção masculina Espermatozoide humano Fertilidade Interação proteína-proteína Anticoncepção Espermatozoides

Idioma

Português

Citação

SANTOS, Beatriz Rezende. Proteínas de interação da EPPIN no espermatozoide humano: potenciais papéis na fertilidade e na contracepção masculina. 2026. Dissertação (Mestrado Ciências Biomoleculares e Farmacológicas) - Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Botucatu, 2026.