Botucatu - IBB - Instituto de Biociências

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Efeitos de diferentes ácidos graxos na expressão de transcritos envolvidos na síntese de PGF2α e PGE2 e no reconhecimento materno fetal em células trofoblásticas e embriões bovinos
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-06-07) Bezerra, Lucas Oliveira ; Membrive, Claudia Maria Bertan ; Maldonado, Mariangêla Bueno Cordeiro
A mortalidade embrionária precoce (MEP) ocasionada por falhas no reconhecimento materno da prenhez (RMP), entre os dias 15 e 17 após a fecundação, constitui uma das maiores causas de falhas reprodutivas em fêmeas bovinas. Estratégias para favorecer o RMP durante tal período crítico, baseiam-se na redução da síntese de prostaglandina F2α (PGF2α) pelo endométrio materno e/ou na maximização do estímulo anti-luteolítico induzido pelo concepto, incluindo o aumento da síntese de prostaglandina E2 (PGE2) e interferon-tau (IFNT). A PGE2 sintetizada pelo endométrio materno, embrião e células trofoblásticas desempenha efeitos luteotróficos e anti-luteolíticos; favorecendo o RMP. A adição de diferentes ácidos graxos em cultivos celulares modifica a biossíntese de eicosanóides, inclusive da PGE2 e PGF2α. A hipótese é que a suplementação com ácido linoleico conjugado (CLA), ácido linoleico (AL), ácido oleico (AO) e ácido eicosapentanóico (EPA) associado ao ácido docosahexaenóico (DHA) aumenta a síntese de PGE2, diminui a síntese de PGF2α e aumenta a razão PGE2/PGF2α em células trofoblásticas bovinas (CT-1); modifica a expressão de transcritos envolvidos na biossíntese de PGE2 e PGF2α em CT-1 e embriões bovinos produzidos in vitro; altera a expressão de transcritos que favorecem o RMP em CT-1 e embriões, além de favorecer o nível de metilação do DNA nos embriões. Assim, objetivou-se com o Experimento 1: a) avaliar os efeitos da suplementação com 100 µM CLA, 100 µM AL, 100 µM AO ou 50 µM EPA + 50 µM DHA na síntese de PGE2, PGF2α e na razão PGE2/PGF2α em CT-1; b) avaliar a expressão de transcritos envolvidos na biossíntese de prostaglandinas (PTGER4, PTGS2, PTGES2, PTGES, AKR1B1) e no RMP (IFNT) em CT-1. Assim, objetivou-se com o Experimento 2: a) avaliar os efeitos da suplementação com 100 µM CLA, 100 µM AL, 100 µM AO ou 50 µM EPA + 50 µM DHA na expressão de transcritos envolvidos na biossíntese de prostaglandinas (PTGS2, PTGES e AKR1B1), no RMP (IFNT) e no nível de metilação do DNA (DNMT3A) em embriões bovinos produzidos in vitro e b) avaliar a taxa de produção embrionária com 7 e 9 dias de cultivo. No Experimento 1, CT-1 em placas de 6 poços contendo meio acrescido com 10% de soro fetal bovino (SFB), onde foram cultivadas a 38,5°C com 5% CO2 por 5 dias. As CT-1 receberam meio de cultivo isento de SFB por 24 horas. Em seguida, os poços receberam meio sem SFB contendo 100 µM de CLA, 100 µM de AL, 100 µM de AO ou 50 µM de EPA + 50 µM de DHA durante 5 minutos e 24, 48 e 72 horas. Ao término do cultivo o meio foi coletado e as CT-1 foram lisadas com 1mL/poço de Trizol para posterior extração do RNA. As concentrações de PGE2 e PGF2α mensuradas por ELISA e os transcritos foram avaliados pela técnica de RT-PCR. Foram realizadas 5 repetições experimentais. A análise estatística foi realizada pelo PROC MIXED do SAS, considerando o poço a unidade experimental. No Experimento 2, folículos ovarianos de 2 a 10 mm provenientes de fêmeas Nelore abatidas, foram aspirados utilizando seringa de 10 mL e agulha 18G. Oócitos com citoplasma homogêneo e múltiplas camadas de células do cumulus foram submetidos à maturação in vitro (MIV) em gotas de 100 μL contendo meio MIV com 5% de soro fetal bovino (SFB) sob óleo mineral, em incubadora a 38,5oC em atmosfera umidificada a 5% de CO2 por 24 horas. Após a MIV, os oócitos foram submetidos a fertilização in vitro (FIV), com sêmen de uma única partida de mesmo touro Nelore, durante 18 horas nas mesmas condições da MIV (D0 = dia da FIV). Após a FIV, os prováveis zigotos (n = 1117) foram alocados em placas de 4 poços com 700 L de meio de cultivo/poço com 1,25% de SFB, acrescidos dos seguintes tratamentos: 100 μM de ácido linoleico conjugado (Grupo CLA; n = 223 oócitos); 100 μM de ácido linoleico (Grupo AL; n= 227); 100 μM de ácido oleico (Grupo AO; n = 225) ou 50 μM de ácido eicosapentaenóico - EPA + 50 μM ácido docosahexaenóico – DHA (Grupo EPA + DHA; n= 219); além de meio não acrescido de AG (Grupo Controle; n = 223). A produção embrionária foi avaliada no D7 e D9. Os embriões foram coletados no D9 e os transcritos foram avaliados pela técnica de RT-PCR. Foram realizadas 10 repetições experimentais. A análise estatística foi realizada utilizando o software PROC MIXED do SAS. No experimento 1, não houve diferença para a síntese de PGE2 e PGF2α no tempo de 5 min entre os diferentes grupos. Os grupos tratados com AL quando comparado ao controle apresentou maior (P < 0,001) síntese de PGE2 com 24 horas (301,19  61,83 vs. 45,59  4,00 ng/mL; respectivamente), 48 horas (272,42  56,82 vs. 48,15  6,59 ng/mL; respectivamente) e 72 horas (310,58  81,54 vs 97,40  22,40 ng/mL; respectivamente). A síntese de PGF2α foi maior (P < 0,001) nos grupo AL e AO quando comparados ao controle nos tempos de 24 horas (151,67  17,01 e 105,71  30,86 vs. 45,89  9,86 ng/mL; respectivamente), 48 horas (112,94  40,95 e 159,41  43,67 vs 80,10  19,10 ng/mL; respectivamente) e 72 horas (317,67  55,52 e 200,81  20,39 vs 98,77  21,81 ng/mL; respectivamente). A síntese de PGF2α foi menor (P < 0,001) no grupo EPA + DHA quando comparado ao controle com 48 horas (7,28  0,54 vs 45,89  9,86 ng/mL; respectivamente) e 72 horas (11,07  0,71 vs 98,77  21,81 ng/mL; respectivamente). A razão PGE2/PGF2α foram maiores (P = 0,007) nos grupos CLA, AL, EPA + DHA comparados ao grupo controle para 24 (2,23 + 0,31; 2,04 + 0,40 e 2,32 + 0,31 vs 1,11 + 0,15; respectivamente), 48 (3,16 + 0,68; 2,42 + 0,29 e 2,77 + 0,50 vs 0,74 + 0,15; respectivamente) e se manteve por 72 horas apenas no grupo EPA + DHA comparado ao controle (4,19 + 1,44 vs 1,09 + 0,18; respectivamente). Não foi observada diferença entre os grupos para os transcritos PTGES (P = 0,7799), PTGES2 (P = 0,8107) e PTGS2 (P = 0,4183). Foi observada uma tendência na abundância de PTGR4 ser maior (P = 0,1565) no grupo AL quando comparado ao EPA + DHA (0,0020  0,0002 vs 0,0008  0,0002; respectivamente). Também foi observada uma tendência na abundância de AKR1B1 ser maior (P = 0,1618) no grupo AO quando comparado ao CLA (0,2625  0,0265 vs 0,1512  0,0314; respectivamente). Com 72 horas de cultivo observou-se uma maior (P = 0,0044) expressão relativa de PTGS2 no grupo AL comparado ao controle (7,4253 ± 0,5671 vs 4,4689 ± 0,4454). Observou-se maior expressão relativa para o IFNT no grupo AL quando comparado ao controle nos tempos de 24 horas (0,1374  0,0090 vs 0,0990  0,0125 respectivamente; P = 0,0216) e 72 horas (0,2336 ± 0,0126 vs 0,1293 ± 0,0103, respectivamente, P = 0,0031). No tempo de 48 horas, a expressão de IFNT foi maior nos grupos AL, AO, EPA + DHA quando comparados ao controle (0,1699 ± 0,0294; 0,2989 ± 0,1391 e 0,2332 ± 0,0438 vs 0,0899 ± 0.0179, respectivamente, P = 0,0103). No Experimento 2, a produção embrionária foi reduzida no grupo EPA + DHA no D7 e D9 (3,98  1,43 vs 14,94  3,13 vs 2,34  1,29 vs 12,86  3,10). Não foi observada diferença entre os grupos para a expressão relativa do PTGES (P = 0,5496) e AKR1B1 (P = 0,1794). A expressão relativa de PTGS2 foi maior (P = 0,0286) no grupo AO comparado ao grupo controle e AL (1,1090 ± 0,0833 vs 0,7109 ± 0,0748 e 0,7068 ± 0,0577; respectivamente) e o grupo CLA não diferiu dos demais grupos. A expressão de IFNT tendeu (P = 0,1148) a ser maior nos grupos CLA e AO comparado ao controle (0,1544 ± 0,0293 e 0,1750 ± 0,0465 vs 0,0344 ± 0,0073 respectivamente). A expressão de DNMT3A tendeu a ser maior (P = 0,0797) nos grupos CLA e AO comparado ao controle (0,0009 ± 0,0001 e 0,0012 ± 0,0005 vs 0,0001 ± 0,00008 respectivamente). No Experimento 1, conclui-se que a suplementação com AL no meio de cultivo das CT-1 aumenta síntese de PGE2 com 24, 48 e 72 horas de cultivo; aumenta síntese de PGF2 com 24 e 72 horas de cultivo e aumenta razão PGE2/PGF2 com 24 e 48 horas e aumenta a abundância relativa dos transcritos PTGS2 com 72 horas de cultivo e de IFNT com 24, 48 e 72 horas de cultivo, podendo ser um grande aliado no RMP. No Experimento 2, conclui-se que a suplementação no meio de cultivo de embriões com AO aumentou a abundância de transcrito para PTGS2 e o CLA e AO tenderam a aumentar os transcritos para IFNT e DNMT3A, enquanto a suplementação com EPA + DHA afetou negativamente as taxas de produção embrionária.
Morfologia de cerdas do exoesqueleto de Kingsleya attenboroughi Pinheiro & Santana, 2016 (Crustacea: Decapoda: Brachyura: Pseudothelphusidae)
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-04-30) Lima, Janaína Caldeira de ; Santana, William Ricardo Amâncio ; Zara, Fernando José
Este estudo representa a primeira descrição abrangente e ilustração da morfologia das cerdas em caranguejos braquiúros de água doce. Aqui, apresentamos uma análise detalhada dos vários tipos de cerdas encontradas no exoesqueleto de Kingsleya attenboroughi Pinheiro & Santana, 2016, uma espécie que habita as florestas relictuais da Chapada do Araripe em Barbalha, CE, Brasil. Através da microscopia eletrônica de varredura e exame histológico, identificamos uma morfologia de cerdas mais diversa e intrincada do que se pensava anteriormente. Classificamos oito tipos distintos de cerdas, cada um com subtipos específicos. O tipo denominado “brush” tipo 1, destaca-se significativamente diferente daqueles descritos anteriormente na literatura científica. Ele apresenta uma haste curta a média, robusta, com inserção infracuticular em pequenas “fossas” discretas, exibindo um padrão consistente em todas as cerdas “brush” tipo 1 observadas. Além disso, na cerda “brush” tipo 1, a haste é uniformemente lisa, exceto na extremidade apical, onde é adornada com setúlas densas e flexíveis. Os critérios para classificação das cerdas incluem características da haste, como relação comprimento/largura, localização e visibilidade do ânulus, formato do ápice, presença ou ausência de poros e sua posição, bem como a distribuição e tipo de setúlas e dentículos. Além disso, nossas descobertas morfológicas nos permitem inferir diversas funções potenciais para essas cerdas, estabelecendo assim uma base para pesquisas adicionais sobre o papel biológico e funcional dessas estruturas em caranguejos de água doce.
Prospecção de inibidores para toxinas envolvidas na mionecrose em acidentes botrópicos por análises estruturais
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-05-16) Moraes, Ivan Rossi ; Fontes, Marcos Roberto de Mattos ; Salvador, Guilherme Henrique Marchi
Acidentes causados pelas serpentes peçonhentas do gênero Bothrops geram um grande problema médico e social no Brasil, devido ao proeminente dano local que pode levar à amputação do membro atingido. Algumas proteínas presentes no veneno botrópico estão diretamente relacionadas ao proeminente dano local, entre elas estão as fosfolipases A2, fosfolipases A2-like, metaloproteinases, serino proteases, L-aminoácido oxidases, lectinas tipo C e lectinas tipo C-like que atuam diretamente nos tecidos musculares. Considerando que os efeitos locais do veneno não são completamente neutralizados pelo soro antiofídico, há necessidade da busca por compostos que possam complementar a soroterapia. Desta forma, neste trabalho, são propostos estudos de termoforese em microescala e de bioinformática (Docking molecular e simulação de dinâmica molecular) com miotoxinas botrópicas e moléculas candidatas a inibi-las. Os experimentos de termoforese em micoescala foram realizados com fosfolipases A2-like e inibidores conhecidos, já os experimentos de bioinformática foram realizados com diversas classes de proteínas das serpentes Bothrops e os inibidores. Com os resultados obtidos neste trabalho, poderá se compreender melhor as interações e possíveis modificações estruturais que podem ser causadas pelos inibidores, além de também entender as bases estruturais que levam à inibição destas proteínas. Além disso, pretende-se verificar a possibilidade de moléculas inibidoras agirem de maneira simultânea em diferentes classes de toxinas.
Reanálise do sequenciamento de célula única do câncer cervical HPV positivo como estratégia para identificação de novas abordagens terapêuticas
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-02-29) Brugnerotto, Laíza ; Delella, Flávia Karina
O câncer cervical (CC) é predominante em mulheres de países com baixo índice de desenvolvimento, estabelecendo este como o quarto câncer mais comum atualmente. Os fatores de risco incluem uso prolongado de contraceptivos, alto número de gestações e de parceiros sexuais, porém o mais predominante é a infecção pelo papilomavírus humano (HPV), vírus sexualmente transmissível. Os HPVs mais propensos a desenvolverem a doença são os 16 e 18, sendo denominados como HPVs de alto risco. O tratamento inicial para CC é a cirurgia, mas em estágios mais avançados da doença, o padrão de terapia é a quimiorradioterapia concomitante à base de cisplatina. Como existe a grande possibilidade de resistência/intolerância à cisplatina, outros fármacos vêm sendo estudados como novas alternativas de tratamento e também como combinação para aperfeiçoamento da resposta. Entretanto, mesmo com estes avanços, as taxas de cura de CC ainda permanecem baixas, principalmente em casos de CC recorrente e associados à metástase. Neste cenário, a biologia computacional vem sendo utilizada como forma de analisar comportamentos, identificar e validar possíveis biomarcadores terapêuticos por meio de ferramentas, plataformas e bancos de dados de pacientes disponíveis online, a fim de trazer melhorias no âmbito oncológico através da medicina de precisão e predição de novas drogas. Portanto, nosso estudo adaptou uma metodologia que proporciona uma pesquisa a nível celular da histologia e expressão gênica do tecido tumoral de CC HPV positivo, através da análise de sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq), para identificar possíveis genes marcadores tumorais e novas potenciais drogas para o tratamento personalizado do CC.
Detecção molecular de Cryptococcus spp. em amostras de fezes de pombos coletadas em Botucatu
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-07-29) Scherrer, Pablo Henrique ; Bosco, Sandra de Moraes Gimenes
A alta concentração de pombos (Columba livia) é um problema comum em metrópoles. No entanto, mesmo em cidades interioranas e relativamente pequenas, a presença dessas aves em praças, edificações e outros locais cuja estrutura oferece condições para abrigo, reprodução e alimentação, preocupa. A escassez de programas voltados para o controle, bem como a ausência de trabalhos de educação ambiental favorece a proliferação de pombos na área urbana, já que o ser humano potencializa a disponibilidade de alimento a esses animais. A criptococose ou popularmente doença do pombo, contraída principalmente por meio da inalação de poeira contendo células fúngicas associada às fezes secas, constitui uma ameaça à saúde pública. Seu agente etiológico, leveduras encapsuladas do gênero Cryptococcus spp., possui relevância na quantidade de mortes de pessoas imunodeprimidas no mundo todo. Nosso objetivo foi investigar a ocorrência de Cryptococcus neoformans em amostras de fezes de pombos, no município de Botucatu, Estado de São Paulo, coletadas em hospitais, praças ou escolas e seus arredores, onde a presença, concentração e aninhamento de pombos é facilmente verificada e o acúmulo de fezes notório. Para tanto, foram coletadas 5 amostras de fezes em 6 hotspots distintos na zona urbana e rural do município. Após extração de DNA realizou-se PCR com primers universais para fungos ITS-4 e ITS-5 e a seguir nested PCR com os primers CN4 e CN5, específicos para C. neoformans. Dos 06 hotspots avaliados, 5 foram positivos, sendo o único resultado negativo pertencente à zona rural do município de Botucatu. Dessa forma, podemos afirmar que 100% dos pontos urbanos analisados foram positivos para a presença de C. neoformans, o que é um dado preocupante, pois são áreas de grande circulação de pessoas que possam ser vulneráveis a infecções. Este achado deve trazer à tona a necessidade urgente da implementação de políticas coordenadas de monitoramento, de controle da proliferação de pombos e de educação ambiental e em saúde para difusão do conhecimento sobre a criptococose e como evitá-la.
Efeitos da leucemia b sobre o tecido prostático de animais knockout para adiponectina
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-02-23) Oliveira, Beatriz Souza ; Felisbino, Sergio Luis
A Leucemia Linfóide Aguda de células precursoras B (LLA-B) é o câncer mais comum na infância e promove um ambiente pró-inflamatório nos tecidos dos pacientes. A adiponectina é um hormônio produzido principalmente pelo tecido adiposo que, além de apresentar papel anti-inflamatório, além de importantes funções metabólicas. Muito é sabido sobre os impactos da Leucemia e seus tratamentos sobre os testículos, mas pouco se sabe dos impactos sobre a próstata. Neste projeto avaliamos o impacto da progressão da LLA-B sobre o tecido prostático de animais selvagens (C57BL/6) e de animais nocaute para gene da adiponectina (KO). A nossa hipótese é que alterações causadas pela Leucemia no organismo afetam o tecido prostático e que animais sem adiponectina podem ser mais impactados pelos efeitos da Leucemia. Para isso, animais KO e selvagens com seis semanas pós-desmame foram inoculados com 2.000 células leucêmicas de LLA-IL7R murina via veia caudal e ficaram expostos à células leucêmicas por 3 e 4 semanas. Resultados obtidos em nosso laboratório mostraram que camundongos C57 e camundongos KO morreram devido à progressão da doença em dias variados e apresentaram perda brusca de peso e caquexia em períodos aproximados de tempo. As análises do tecido prostático revelaram que os animais dos grupos leucêmicos, apresentaram altas taxas de proliferação celular, principalmente no grupo nocaute pela falta da adiponectina. Em última análise podemos sugerir que a ausência da adiponectina favorece a progressão da leucemia e interfere nas vias de controle homeostático da próstata, porém estudos mais aprofundados se fazem necessários para uma melhor compreensão da função da adiponectina em relação a Leucemia Linfóide Aguda do tipo B e seus impactos no tecido prostático.
Desenvolvimento e implementação de um sistema tomográfico para a reconstrução quantitativa de micro partículas magnéticas baseado em sensores de Biosusceptometria AC
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-11-22) Buranello, Lais Pereira ; Miranda, José Ricardo de Arruda ; Próspero, André Gonçalves
As micro e nano partículas magnéticas (MNPMs) são matérias com grande potencial para sistemas de entrega direcionada de fármaco, devido suas propriedades magnéticas e seu tamanho reduzido. Entretanto, para melhores informações e eficiência do processo de direcionamento é necessário técnicas capazes de detectar, localizar e imagiar as MNPMs dentro do organismo. Atualmente há algumas técnicas disponíveis, porém com algumas inviabilidades como alto custo, ausência de portabilidade e restrições para a experimentação animal. Desta maneira, a Biosusceptometria de Corrente Alternada (BAC) é uma técnica biomagnética capaz de detectar e realizar o imagiamento quantitativo das MNPMs in vitro, ex vivo, in vivo e em tempo real. Os resultados obtidos até o momento são reconstruções bidimensionais, restrita a aquisição em um único plano. Com o intuito de gerar imagens tomográficas e quantitativas utilizando a BAC, propomos um arranjo octogonal de bobinas detectoras e excitadoras disposto em uma geometria circular, possibilitando a aquisição em diferentes projeções. Esta configuração formada por múltiplas bobinas de detecção e excitação permitiu o teste de diferentes métodos e configurações de ativação das bobinas. Esses métodos permitiram uma análise mais profunda da estabilidade do problema inverso. Os resultados mostraram que a adição de bobinas de detecção resultou em uma melhor reconstrução, devido a quantidade de informações adicionadas no problema. Os resultados apresentados podem ter enormes impactos no desenvolvimento de futuras metodologias BAC que podem auxiliar no desenvolvimento de sistemas de entrega de medicamentos direcionados e possíveis aplicações in vivo de materiais micro e nano magnéticos.
Modelagem dos efeitos dos elétrons secundários gerados por íons na indução de radicais livres e quebras de DNA: uma abordagem por simulação de Monte Carlo e aproximação dielétrica
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-02-28) Magiore, Beatriz Moreira ; Hormaza, Joel Mesa
Neste estudo, investigamos os efeitos de prótons e partículas alfa de baixa energia (1 keV a 1 MeV) em água líquida e DNA seco, focando na produção de elétrons secundários, radicais livres e danos no DNA. Utilizando a aproximação dielétrica no modelo MELF-GOS, calculamos a produção de elétrons secundários e radicais livres. Simulações Monte Carlo foram empregadas para estimar as probabilidades de danos no DNA, como quebras de bases (BDs), quebras simples de fita (SSBs) e quebras duplas de fita (DSBs), pela interação com elétrons secundários. Nossos resultados indicam que a eficiência na produção de radicais livres apresenta um pico em baixas energias, diminuindo em energias mais elevadas. Acima de 100 keV, os mecanismos de interação de prótons e partículas alfa convergem, com a ionização direta se tornando o principal mecanismo de produção de radicais livres. Em relação ao DNA, os danos causados por elétrons secundários aumentam com a energia dos elétrons. SSBs e BDs aumentam com a energia dos elétrons, enquanto DSBs e formas complexas de danos diminuem, sugerindo uma menor probabilidade de interações múltiplas. Mapas tridimensionais da probabilidade de danos no DNA revelam comportamentos semelhantes para BDs, SSBs e DSBs para cada tipo de partícula. No entanto, observamos diferenças na probabilidade de danos entre prótons e partículas \(\alpha\), atribuídas ao espectro de elétrons secundários, que varia para os dois tipos de projéteis, especialmente em energias abaixo de 100 keV. Em suma, este estudo fornece informações valiosas sobre os efeitos de prótons e partículas alfa de baixa energia em água e DNA. Os resultados podem ser úteis para avaliar os riscos de radiação em diversas aplicações.
Relação genotípica e molecular de MICA e MICB em indivíduos saudáveis
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-02-27) Silva, Joyce Machado ; Castro, Camila Ferreira Bannwart ; Castelli, Erick da Cruz
Os genes MICA e MICB pertencem ao complexo principal de histocompatibilidade (MHC) humano, considerada a região mais polimórfica do genoma. Codificam proteínas glicosiladas fixadas à membrana, que são semelhantes às moléculas de MHC-I, porém não se associam à β2-microglobulina nem apresentam antígenos. MICA e MICB são ligantes do receptor ativador NKG2D, expresso em células natural killer (NK) e linfócitos TCD8. Após essa interação, a resposta imune citolítica mediada por NKG2D será ativada contra células infectadas por vírus e células tumorais. No entanto, MICA/B podem ocorrer em duas isoformas: ancoradas à superfície celular ou como moléculas solúveis (sMICA/B) liberadas no citosol. A versão solúvel pode ocorrer devido a polimorfismos que impedem a tradução da porção transmembrana ou por ação de metaloproteinases. Enquanto a isoforma de membrana ativa a citotoxicidade celular de NK e TCD8+, o contrário ocorre para a isoforma solúvel. Diversos contextos clínicos apresentam MICA/ MICB como protagonistas na sua fisiopatologia, como rejeição de transplantes, doenças autoimunes, infecções por patógenos intracelulares, neoplasias malignas e até disfunções gestacionais. Considerando a dualidade da interação dessas moléculas com o sistema imune, o objetivo deste projeto foi avaliar o impacto de polimorfismos frequentes em MICA e MICB e sua funcionalidade molecular. Avaliamos a diversidade desses dois genes via sequenciamento de segunda geração e um pipeline de bioinformática específico para análise de genes do MHC humano. Selecionamos 19 amostras com genótipos de interesse (que codificam diferentes isoformas de MICA/B) para o cultivo de monócitos sem estímulo ou estimulado com LPS e peróxido de hidrogênio (H2O2) por 18 horas e armazenamento do sobrenadante para avaliação de sMICA/sMICB por ELISA de alta sensibilidade. A ancestralidade das amostras foi majoritariamente europeia. O alelo MICA*008:01, cujo polimorfismo induz a produção de MICA solúvel, foi, de fato, correlacionado com maior produção de sMICA em indivíduos homozigotos. No entanto, não houve diferença estatística na quantificação de MICA entre os sobrenadantes de cultura com e sem estímulos.Maiores níveis de sMICB têm sido associados ao alelo MICB*004:01, porém nenhuma significância estatística foi encontrada em plasma e sobrenadante celular entre grupos de indivíduos portadores desse alelo ou não. A relação entre a produção dessas proteínas solúveis plasmáticas e de sobrenadante celular com os alelos foi realizada pela primeira vez com amostras brasileiras. Uma vez que MICA e MICB são alvos de pesquisa em diversas condições clínicas, esses resultados podem contribuir diretamente para um melhor entendimento da funcionalidade dessas moléculas solúveis de maneira alelo-específica. Portanto, esses dados contribuirão para a ampliação do banco de dados desses genes, que poderão ser usados para aprimoramento de diagnósticos, rastreamento de doenças e imunoterapias.
Membranas nanocompósitas de PGS/CaP/AgNPs para regeneração tecidual
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-02-28) Gomes Neto, João de Freitas ; Riccardi, Carla dos Santos
O número crescente de defeitos ósseos causados por traumas, patologias, defeitos congênitos e envelhecimento da população infere no uso de substitutos ósseo para a regeneração de tecidos. Neste contexto, esta pesquisa tem como hipótese aliar as características elastômeras do polímero poli (glicerol sebacato) (PGS), à bioatividade conferida por fosfatos de cálcio (CaP) de interesse biológico auxiliando a cicatrização e remodelação de tecidos danificados ou perdidos, a incorporação de nanopartículas de prata (AgNPs), obtidas por síntese biogênica, objetivando aliar propriedades terapêuticas antinflamatórias e antimicrobiana. O PGS é sintetizado a partir de ácido sebácico e glicerol (1:1) por aquecimento em micro-ondas, e seguida pela etapa de cura à 150 °C por 24 horas. A deposição da fase inorgânica a base de fosfatos de cálcio na matriz orgânica foi conduzida por método biomimético a partir de solução de simulação de fluidos corporais (SBF, do inglês Simulated Body Fluid) sob três diferentes condições de composições iônicas. As AgNPs foram sintetizadas por rota verde, a partir do extrato de própolis vermelha e, então, incorporadas nas membranas por dois processos diferentes (1) imersão e (2) evaporação de solvente. As amostras PGS controle, PGS/CaP, PGS/AgNPs e PGS/CaP/AgNPs foram caracterizadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV), espectroscopia na região do infravermelho médio com reflectância total atenuada (ATR-FTIR), grau de intumescimento, degradação hidrolítica e ensaios biológicos por método indireto. As amostras PGS controle e PGS/CaP foram submetidas a ensaios mecânicos de compressão e calorimetria exploratória diferencial (DSC). As amostras PGS controle e PGS/SBF0 foram submetidas a análises de termogravimetria (TGa). As AgNPs foram caracterizadas por UV-vis e espalhamento dinâmico de luz (DLS). As amostras PGS/AgNPs e PGS/CaP/AgNPs foram submetidas a ensaios de liberação in vitro a fim de quantificar a liberação de AgNPs. A padronização da síntese do PGS assistida micro-ondas possibilitou redução de tempo nas etapas de pré-polimerização e cura quando comparada ao método convencional de policondensação sob pressão reduzida (24 ou 48h) seguido por cura do material até 96h. Os resultados macrovisuais das membranas densa e esponjas apresentaram característica consistente para a aplicação em tecido ósseo, sendo a membrana esponja altamente porosa, mimetizando a fase esponja do tecido, e a membrana densa possui uma flexibilidade atraente para a aplicação. Os resultados de MEV indicam a reticulação do material obtida com sucesso, juntamente com a deposição de CaP sobre a superfícies da membrana, essas fases que podem estar mistas graças a solução SBF. As caracterizações referentes a composição química do PGS realizadas por ATR-FTIR apresentam bandas características do processo de polimerização do material, sendo possível observar seus deslocamentos, e apresentam bandas características de CaP, comprovando novamente a deposição sobre as membranas. Os testes de intumescimento e degradação hidrolítica apresentam que o material possui uma característica hidrofóbica, passando para hidrofílica com a presença de poros, e que seu índice de degradação está satisfatório para o nível de reticulação do material apresentado pela literatura. Os resultados de ensaios de compressão indicam que o PGS possui um nível de resistência, porém não tanto quando comparado a outros polímeros utilizados em regeneração óssea. Os testes de DSC e TGa apresentam o comportamento térmico do material, mostrando que ele sofre transição vítrea e se degrada acima de 400 °C. Os ensaios biológicos indicam que o material possui biocompatibilidade, porém precisa de tratamentos para correção de pH. Os testes de liberação de AgNPs indicam que possui perspectivas de cinética de liberação. Sendo assim, o PGS é um bom candidato para regeneração óssea, com as devidas incorporações de CaP e AgNPs.
Monogenéticos parasitos de espécies simpátricas de peixes pertencentes aos gêneros Astyanax Baird & Girard, 1854 e Psalidodon Eigenmann, 1911 procedentes do Rio Pardo, Médio Rio Paranapanema, São Paulo
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-02-23) Dos Santos Júnior, Maurício Jorge ; Silva, Reinaldo José da ; Ebert, Mariana Bertholdi
Os peixes no Brasil, especialmente em água doce, apresentam uma notável diversidade de associações parasito-hospedeiro, com os maiores números entre os vertebrados. Apesar disso, a biodiversidade de parasitos de peixes no país ainda é pouco explorada. No contexto dos monogenéticos, há uma tendência para o elevado grau de especificidade parasitária, sugerindo que uma espécie de parasito geralmente ocorre em apenas uma espécie de hospedeiro ou em hospedeiros filogeneticamente próximos. No entanto, o conhecimento sobre esses organismos é limitado e especialistas acreditam que o número de espécies conhecidas atualmente representa apenas uma fração das espécies existentes. Este trabalho teve por objetivo desenvolver estudos de diversidade, taxonomia e sistemática de monogenéticos de Astyanax lacustris, Psalidodon bockmanni, Psalidodon fasciatus e Psalidodon paranae coletados ao longo do gradiente longitudinal (da nascente à foz) do Rio Pardo, Médio Rio Paranapanema, São Paulo, Brasil, através de análises morfológicas, morfométricas e moleculares. Com isso foi possível coletar 639 parasitos em 151 hospedeiros. Identificamos 11 taxa de parasitos (i.e. Cacatuocotyle sp. 1, Cacatuocotyle sp. 2, Cacatuocotyle sp. 3, Characithecium bifurcuprolatum, Characithecium costaricensis, Characithecium paranapanemense, Diaphorocleidus neotropicalis, Diaphorocleidus sp. 1, Gyrodactylidae gen. sp., Jainus hexops e Trinibaculum pinctiarum) parasitando brânquias, narinas e pele de seus hospedeiros. Também foi possível coletar dados morfológicos e moleculares (LSU rDNA) de D. neotropicalis, C. parapanemense e C. costaricensis e de possíveis novas espécies (i.e. Cacatuocotyle sp. 2 e Diaphorocleidus sp. 1). Adicionalmente contamos com dados acerca de suas estruturas ecológicas ao longo da bacia e suas relações com seus respectivos hospedeiros, além de registrar novos hospedeiros e sítios de infestação para espécies já descritas de parasitos.
Efeitos do eugenol e cinamaldeído em isolados clínicos de Candida auris
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-02-27) Sousa, Débora Silva Marques de ; Menezes, Luciana da Silva Ruiz ; Fernandes Júnior, Ary
Candida auris foi identificada pela primeira vez no Japão há mais de uma década. Desde então, foi relatada em todos os continentes e tem se tornado uma ameaça global devido à sua rápida capacidade de desenvolver resistência à todas as classes de antifúngicos (azólicos, polienos e equinocandinas), comprometendo o tratamento das infecções. Também apresenta menor susceptibilidade aos desinfetantes hospitalares, facilitando sua permanência nesses locais. Em 2020 foi relatado o primeiro surto no Brasil, e desde então foram notificados mais de 70 casos em todo o país. Neste cenário, os produtos naturais têm sido amplamente estudados a fim de encontrar moléculas com potencial antimicrobiano. Poucos produtos com ação antifúngica foram aprovados nas últimas décadas por conta da citotoxicidade em células humanas. O eugenol e cinamaldeído apresentam ação antimicrobiana contra várias espécies de Candida. Assim, os objetivos deste estudo foi avaliar a ação destes compostos em isolados clínicos de C. auris através de testes de sensibilidade de microdiluição em caldo, bem como verificar os possíveis mecanismos de ação desses compostos através de análise proteômica. Ambos os produtos apresentaram uma ação fungicida em concentrações variando entre 31,25 e 250μg/mL. Os produtos apresentaram ação sinérgica combinados entre si e em combinação com o itraconazol. Eugenol e cinamaldeído reduziram a produção de biomassa de biofilme em mais de 50%, entretanto, a biomassa de biofilme foi aumentada para a maioria dos isolados quando tratados com ambos os produtos. O eugenol não apresentou citotoxicidade nas concentrações em que inibe o crescimento da levedura. Por outro lado, o cinamaldeído se mostrou mais citotóxico nas concentrações em que houve inibição do crescimento, causando uma redução da viabilidade celular de até 95% na concentração de 500 μg/mL. A análise proteômica demonstrou que o mecanismo de ação de eugenol e cinamaldeído possivelmente está relacionada à biossíntese de ergosterol. Os resultados desse estudo sugerem que o eugenol pode ser um candidato para o desenvolvimento de formulações para o tratamento de infecções causadas por C. auris. Devido à elevada citotoxicidade e reatividade do cinamaldeído, esse composto poderia ser estudado como possíveis formulações de desinfetantes e seus derivados avaliados em relação à segurança.
Efeitos tóxico da amônia sobre a sobrevivência, morfologia das brânquias e resposta imune do pitu Macrobrachium acanthurus (Caridea: Palaemonidae)
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-02-22) Miranda, Esthephany Konesuk Santos ; Bertini, Giovana
Macrobrachium acanthurus é um camarão-de-água-doce comum na região do Vale do Ribeira, onde é explorado pela pesca artesanal. Tendo em vista sua importância regional e o potencial de cultivo para atender o mercado de iscas vivas, este trabalho teve por objetivo determinar os efeitos tóxicos da amônia em sua sobrevivência através da concentração letal mediana (CL50-96h), descrever as alterações na morfologia das brânquias através de análises histológicas e verificar a resposta imune por meio da contagem de total de hemócitos (CTH) nas fases juvenil e adultos. Para isso os bioensaios foram realizados em pH 8 e temperatura de 26ºC para os dois grupos etários seguindo um delineamento completamente casualizado com três réplicas para cada tratamento (concentrações de amônia total) de 0 (controle), 20, 40, 60 e 80 mg L-1 para juvenis e adultos (machos e fêmeas ovígeras). As CL50-96h de amônia foram calculadas através da análise de regressão entre log das concentrações de amônia total e a mortalidade dos exemplares, o nível seguro foi determinado como 10% do valor da CL50. Para avaliar a ocorrência de alterações morfológicas nas brânquias foi realizada a análise histológica de acordo com o índice do órgão (Iorg) que representa o grau de lesão do órgão. A CTH foi realizada pela retirada de uma amostra da hemolinfa de cinco camarões de cada réplica dos tratamentos. As fêmeas ovígeras obtiveram o maior valor de CL50-96h e nível de segurança de amônia total com valores de 59,2 mg L-1 e 5,9 mg L-1, respectivamente, seguida por juvenis com 54,5 mg L-1 e 5,4 mg L-1 e por macho com 50,4 mg L-1 e 5,0 mg L-1. A amônia demonstrou ser significativamente nociva para as brânquias de juvenis e adultos de M. acanthurus, corroborando com os dados observados de mortalidade dos animais. Para o controle e os tratamentos de 20 e 40 mg L-1 (abaixo da CL50) foram observadas alterações de menor fator de importância e possíveis de serem revertidos com o fim da exposição à amônia, como infiltração e aglomerado de hemócitos e inchaço das lamelas. Já nos tratamentos de 60 e 80 mg L-1 (acima da CL50) ocorreu uma maior frequência de danos irreversíveis como pontos de necrose e a ruptura das lamelas branquiais. Para a análise da CTH com adultos foi verificado que para as concentrações abaixo da CL50 a quantidade de hemócitos permaneceu inalterada em relação ao controle, mas nas concentrações acima da CL50 ocorreu um aumento na quantidade de hemócitos presente na hemolinfa dos animais, este resultado pode estar associado a resposta imune inata dos indivíduos ao agente estressor. Os dados de efeito e tolerância de amônia apresentados neste trabalho são de grande relevância para preencher o pacote tecnológico de produção de M. acanthurus tendo como foco impulsionar a produção brasileira de espécies nativas de água doce.
Comparação de achados anatômicos com percentual de perfusão pulmonar em exames de SPECT/CT com software 3D Slicer
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-02-29) Seraphim, Daniel Molena ; Pina, Diana Rodrigues de
Doenças respiratórias crônicas são a terceira maior causa de morte no mundo, atrás apenas de doenças cardiovasculares e neoplasias. Devido a sua alta incidência e impacto socioeconômico, a prevenção, controle e cura dessas condições estão entre as intervenções em saúde com maior custo-benefício disponíveis. Técnicas de imagem como a tomografia computadorizada (CT) e a tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT) são os métodos não invasivos de escolha para diagnóstico, estadiamento e quantificação de muitas doenças pulmonares. Embora a análise subjetiva desses exames tenha um papel importante na sua avaliação, ferramentas computacionais têm mostrado potencial para redução de variações intra e interobservador e fornecer métodos objetivos de suporte ao diagnóstico. Estudos anteriores, além de indicar o benefício diagnóstico do uso conjunto de imagens de SPECT/CT para exames pulmonares, também sinalizam potencial de correlação entre achados anatômicos e funcionais nessas condições. Assim, essa pesquisa comparou, com contribuições originais para literatura, achados anatômicos, provenientes de imagens de CT (enfisema, tecido colapsado e infiltrado), com o percentual de perfusão pulmonar proveniente de imagens de SPECT/CT. Foram analisados, retrospectivamente, exames do banco do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu (HCFMB). A análise e quantificação das imagens foram feitas com o software livre 3D Slicer de maneira semiautomática. O percentual de perfusão pulmonar não mostrou correlação com o percentual de enfisema (p = 0,53). Uma correlação positiva fraca foi encontrada entre a perfusão e infiltração pulmonar (p = 0,007 e rho =0,43) e parênquima colapsado (p = 0,04 e rho = 0,33). Esses resultados mostram que acometimentos estruturais dos pulmões tiveram pouco ou nenhum impacto na sua perfusão, nos pacientes da amostra analisada. Essa pesquisa traz contribuições importantes para a comunidade científica uma vez que destaca que a funcionalidade pulmonar de perfusão pode permanecer preservada, mesmo na presença de acometimentos anatômicos.
Respostas morfofuncionais de Protium heptaphyllum (Aubl.) Marchand (Burseraceae) ao fogo com ênfase no sistema secretor
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-02-09) Pereira, Thalissa Cagnin ; Martins, Aline Redondo
No Cerrado, o fogo é um fator determinante para a estrutura da vegetação, sendo a sobrevivência das espécies estabelecida por suas características anatômicas, fisiológicas e comportamentais. Protium heptaphyllum (Aubl.) Marchand é uma espécie de Burseraceae nativa do Brasil e que ocorre em diversos tipos de vegetação, incluindo o Cerrado. Canais secretores associados ao floema ocorrem por todo o eixo vegetativo e produzem resina aromática com valor ecológico, econômico e medicinal. O objetivo deste trabalho foi identificar as respostas morfofuncionais e as estratégias envolvidas na sobrevivência de P. heptaphyllum após a passagem de fogo, além de investigar a influência desse elemento no sistema secretor da espécie. Indivíduos com cerca de nove meses de idade foram submetidos a um experimento de fogo controlado e posteriormente acompanhados em casa de vegetação por seis meses, onde também estavam indivíduos controle. Análises morfológicas quantitativas foram realizadas todo mês e ao final do período de acompanhamento. Amostras de folhas, caule aéreo e colo foram processadas para estudos anatômicos. A composição química da secreção produzida pelas folhas foi analisada através de extrato com acetato de etila, por meio de cromatografia gasosa acoplada com espectômetro de massas. Todos os indivíduos submetidos ao fogo apresentaram rebrotamento, além de uma maior taxa de crescimento em comparação com plantas do grupo controle. Gemas foram observadas no colo dos indivíduos controle e daqueles submetidos ao fogo. Nas folhas dos indivíduos que passaram pelo fogo foi registrada maior relação entre a área ocupada pelos canais secretores e a área da nervura principal. Na porção jovem do caule, a densidade de canais secretores foi maior nos indivíduos submetidos ao fogo, enquanto que no caule em crescimento secundário, a densidade de canais secretores foi maior no grupo controle. Nas análises químicas, os principais constituintes identificados nas folhas de P. heptaphyllum foram vitamina E, sitosterol, α-amirina, esqualeno e β-amirina. A vitamina E foi o único composto que diminuiu após experimento do fogo. Os resultados aqui apresentados colaboram para o entendimento das respostas de plantas nativas que ocorrem naturalmente em áreas sujeitas ao fogo, especialmente no que se refere ao desenvolvimento e funcionamento do sistema secretor.
Análise do perfil global de expressão dos piRNAS na próstata ventral de ratos submetidos à restrição proteica materna: uma abordagem DOHaD
(Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2024-02-29) Baptista, Hecttor Sebastian ; Justulin Junior, Luiz Antonio ; Oliveira, Jordana Inácio Nascimento ; Instituto de Biociências de Botucatu- IBB
A Origem Desenvolvimentista da Saúde e Doença (DOHaD) visa estabelecer correlações entre a exposição a condições adversas em períodos críticos do desenvolvimento fetal e na primeira infância e o surgimento de doenças crônicas não-transmissíveis, incluindo alguns tipos de cânceres, como o câncer de próstata (CaP). Com isso, diversas alterações em marcadores epigenéticos têm sido apontados como potenciais agentes envolvidos na origem desenvolvimentista do CaP. Os RNAs que interagem com proteínas PIWI (piRNAs) atuam no controle de elementos transponíveis (ETs) mantendo a integridade do genoma. Sabe-se que a desregulação de ETs pode ser desencadeada por diferentes situações de estresse, corroborando para a investigação do possível papel dos piRNAs na glândula prostática sob a ótica do conceito DOHaD, no qual ainda não foi amplamente explorado. O objetivo desse trabalho foi detectar e caracterizar a expressão piRNAs na próstata ventral (PV) da prole de ratos Sprague Dawley com 21 dias pós-natal (DPN21) e ao DPN540, que foram submetidos à restrição proteica materna durante a gestação e lactação, visando compreender o impacto no final do desenvolvimento prostático e no envelhecimento. Para isso foram coletadas as PVs dos animais, sendo direcionadas para análises histológicas e extração de RNA para o sequenciamento de small non-coding RNAs (sncRNAs). Após a filtragem das bibliotecas, os clusteres de piRNAs foram preditos no genoma mRatBN7.2 juntamente com a anotação de elementos transponíveis. Para a investigação da expressão de piRNAs em próstata, os dados foram correlacionados com RNAseq obtidos publicamente de testículo, tecido onde essas moléculas são encontradas. Como resultado, nas análises morfológicas no início da vida, os animais do grupo RPGL apresentaram um atraso do desenvolvimento da glândula prostática, com aumento do compartimento estromal e epitelial, e diminuição do compartimento luminal. No envelhecimento, foi possível observar no grupo RPGL, uma diminuição no compartimento luminal e aumento estromal. Além disso, houve atrofia epitelial característica do envelhecimento em ambos os grupos experimentais, no entanto, foi observado aumento da incidência de carcinoma in situ, nos animais do grupo RPGL. Utilizando os dados de small RNA sequence obtidos da próstata nos grupos controle e restrito (no DPN 21 e 540) foram identificados nos animais jovens 66 clusters de piRNAs expressos no grupo CTR e 61 no grupo RPGL. Já nos animais envelhecidos foram identificados 58 clusters nos animais no grupo controle e 53 clusters no grupo RPGL. Dentre esses clusteres, 23 são comuns em todos os grupos. Foram encontrados 8 clusteres de piRNAs expressos tanto em próstata como em testículo. Por fim foi avaliada a expressão dos genes das proteínas PIWI nas amostras de próstata de ambos os grupos e idades (Riwi, Rili e Rili2). Nos animais jovens não há diferença de expressão para nenhum dos genes avaliados. Entretanto, nos animais envelhecidos, houve um aumento da expressão de Riwi e uma diminuição de Rili, ambos no grupo restrito. Portanto, conclui-se que houve variações no perfil de expressão de clusteres na glândula prostática frente a condição de desnutrição proteica materna, indicando a participação dos piRNAs no desenvolvimento da próstata em ambiente de restrição.

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