Correlação dos índices de motilidade e velocidade e subpopulações com o proteoma das células espermáticas de touros

Abstract

A motilidade é um atributo fundamental de ejaculados férteis. No entanto, dentro de um mesmo ejaculado, os espermatozoides exibem padrões de motilidade distinto, e o significado biológico das subpopulações ainda é pouco compreendido. Este estudo foi composto por 2 experimentos. O primeiro experimento comparou a classificação automática do sistema de análise espermática assistira por computador (CASA) com uma abordagem de agrupamento multivariado para identificar subpopulações (SPs) espermáticas. A PCA foi utilizada para reduzir as variáveis em dois componentes principais, seguida do agrupamento pelo método k-means. As classificações obtidas pelo CASA foram então comparadas com os resultados do agrupamento utilizando o índice de Jaccard. Ambos os métodos identificaram 3 subpopulações espermáticas; no entanto, a abordagem de agrupamento k-means proporcionou uma separação mais clara dos grupos e menor sobreposição entre eles. Esses resultados segurem que métodos estatísticos multivariados permitem uma caracterização mais detalhada da heterogeneidade espermática do que a classificação automática do sistema CASA. O segundo teve como objetivo caracterizar SPs cinemáticas de espermatozoides em touros, avaliar os efeitos da criopreservação sobre sua distribuição e investigar associações entre os padrões de motilidade espermática o e proteoma dos espermatozoides. Adicionalmente, foi avaliado o valor preditivo de índices cinemáticos derivados do CASA para a qualidade do sêmen pós-descongelamento. Amostras de sêmen foram colhidas de 10 touros e analisadas antes e após o descongelamento, utilizando o CASA e técnicas de proteômica. As SPs cinemáticas foram identificadas com PCA, seguida de agrupamento pelo método k-means. O proteoma espermático foi analisado utilizando nLC-ESI Orbitrap MS/MS, e os resultados foram correlacionados com as SPs identificadas. Foram determinadas 3 SPs distintas, possibilitando o desenvolvimento de índices de velocidade e movimento. A criopreservação alterou a distribuição das SPs, com redução daquelas caracterizadas por movimento rápido não progressivo e padrão semelhante à hiperativação, e aumente da subpopulação com motilidade progressiva moderada. Os espermatozoides progressivamente móveis estiveram associados a proteínas relacionadas à resposta ao estresse celular e à homeostase proteica, enquanto padrões semelhantes à hiperativação se associaram a proteínas envolvidas na estrutura flagelar, na sinalização por cálcio e no metabolismo mitocondrial. Os resultados demonstram que as subpopulações espermáticas refletem estados funcionais distintos e respondem de forma diferentes à criopreservação, destacando a importância da integração entre análises cinemáticas e proteômicas para a avaliação da qualidade seminal.

Motility is a fundamental attribute of fertile ejaculates. However, within a single ejaculate, sperm exhibit distinct motility patterns, and the biological significance of these subpopulations is still poorly understood. This study comprised two experiments. The first experiment compared the automatic classification provided by a computer-assisted sperm analysis (CASA) system with a multivariate clustering approach to identify sperm subpopulations (SPs). Principal component analysis (PCA) was used to reduce the variables into two principal components, followed by clustering using the k-means method. The classifications obtained by CASA were then compared with the clustering results using the Jaccard index. Both methods identified three sperm SPs; however, the k-means clustering approach provided clearer group separation and less overlap among them. These results suggest that multivariate statistical methods allow a more detailed characterization of sperm heterogeneity than the automatic classification provided by the CASA system. The second experiment aimed to characterize kinematic sperm SPs in bulls, evaluate the effects of cryopreservation on their distribution, and investigate associations between sperm motility patterns and the sperm proteome. Additionally, the predictive value of CASA-derived kinematic indices for post-thaw semen quality was assessed. Semen samples were collected from ten bulls and analyzed before freezing and after thawing using CASA system and proteomic techniques. Kinematic SPs were identified through PCA followed by k-means clustering. The sperm proteome was analyzed using nLC-ESI Orbitrap MS/MS, and the results were correlated with the identified SPs. Three distinct SPs were determined, enabling the development of velocity and movement indices. Cryopreservation altered the distribution of SPs, with a reduction in those characterized by fast non-progressive motion and hyperactivation-like patterns, and an increase in the subpopulation exhibiting moderate progressive motility. Progressively motile sperm were associated with proteins related to cellular stress response and protein homeostasis, whereas hyperactivation-like patterns were associated with proteins involved in flagellar structure, calcium signaling, and mitochondrial metabolism. The results demonstrate that sperm subpopulations reflect distinct functional states and respond differently to cryopreservation, highlighting the importance of integrating kinematic and proteomic analyses for the assessment of semen quality.