Caracterização de telócitos e aspectos da junção neuromuscular de músculos estriados esqueléticos de modelo experimental da distrofia muscular de Duchenne

Abstract

A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) consiste em uma patologia neuromuscular de origem genética relacionada ao cromossomo sexual X, para o estudo são utilizados diversos modelos experimentais, sendo o camundongo mdx o mais frequente. A DMD afeta inicialmente os músculos envolvidos na locomoção, e posteriormente comprometimentos cardiorrespiratórios e associados à deglutição alimentar. Recentes descobertas proporcionam a elevação da expectativa de vida e, por conta disso, aumento de alterações tardias. Portanto, o objetivo do estudo foi caracterizar aspectos da junção neuromuscular (JNM) do m. gastrocnêmio e língua, bem como identificar os telócitos associados à JNM. Foram utilizados 46 camundongos (WT = 23 e mdx = 23) machos de 6 meses de idade. Estes foram eutanasiados, e coletou-se a língua e o m. gastrocnêmio. Estas amostras foram direcionadas para as técnicas de microscopia de luz para a análise estrutural através das colorações de hematoxilina e eosina e picrosirius red, imunofluorescência a partir dos anticorpos primários α-Bungarotoxina (região pós-sináptica), bassoon (região pré-sináptica), S-100-β (células perissinápticas de Schwann), CD34 (telócitos) e PAX7 (células satélites) para a identificação molecular, microscopia eletrônica de transmissão para caracterização ultraestrutural, e western blot para a quantificação proteica de distrofina, S-100-β, CD34, PAX7, TGFβ e PDGFR-α. Foram encontradas alterações significativas nas massas dos animais e m. gastrocnêmio. A análise por microscopia de luz revelou o processo degenerativo no m. gastrocnêmio com a presença de fibrose tecidual e aumento da intensidade de deposição de colágeno, além da localização periférica dos núcleos das fibras dos animais saudáveis. Na língua, sob a microscopia de luz, foram evidenciadas regiões de fibrose no tecido muscular, alterações na espessura epitelial e lâmina própria, enquanto a área glandular apresentou estabilidade entre grupos. A técnica de imunofluorescência revelou alterações nas JNMs, para o m. gastrocnêmio, houve alterações no perímetro corado e total, bem como na dispersão das regiões pré- e pós-sinápticas. A língua foi dividida em rostral e caudal, caracterizada pela heterogeneidade das regiões, apresentou aumento expressivo do perímetro corado e total na região pré-sináptica da região caudal, e diminuição da área total e corada da região pós-sináptica de ambas as regiões da língua. Associadas a JNM, foram identificadas células perissinápticas de Schwann, que recobrem parcialmente a região pós-sináptica no m. gastrocnêmio para ambos os grupos e totalmente na língua na língua apenas para o WT. Os telócitos foram identificados recobrindo a região pós-sináptica em ambos tecidos analisados para o grupo WT, enquanto para o mdx apresentaram um recobrimento parcial. Houve aumento da quantidade de núcleos sob a região pós-sináptica no grupo mdx para o m. gastrocnêmio, enquanto a língua foi caracterizada pela estabilidade na quantidade entre os grupos. A caracterização ultraestrutural revelou o desalinhamento dos sarcômeros, deposição de tecido conjuntivo intramuscular e núcleos centralizados nas fibras no m. gastrocnêmio, enquanto a língua apresentou alterações musculares com telócitos nas adjacências das fibras musculares e nervosas, e caracterização da mucosa lingual tendo as camadas epiteliais evidenciadas e a lâmina própria com telócitos organizados próximos à camada basal do epitélio. A caracterização molecular revelou ausência de distrofina nas amostras de mdx, e alterações entre as regiões da língua, com maior destaque para a diminuição da concentração das proteínas CD34 e PAX7 no grupo mdx para a região rostral da língua. Concluímos que a JNM apresenta os telócitos em sua composição como um elemento celular, e as regiões pré- e pós-sináptica apresentam alterações em decorrência da distrofia muscular, tanto no m. gastrocnêmio, quanto para a língua. Também foram evidenciadas modificações nas características musculares dos tecidos analisados, o que era esperado para o m. gastrocnêmio.

Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is a neuromuscular pathology of genetic origin related to the X sex chromosome. Various experimental models are used for study, with the mdx mouse being the most frequent. DMD initially affects muscles involved in locomotion, and later cardiorespiratory problems and problems associated with swallowing food arise. Recent discoveries indicate an increase in life expectancy and, consequently, an increase in late-onset alterations. Therefore, the objective of this study was to characterize aspects of the neuromuscular junction (NMJ) of the gastrocnemius muscle and tongue, as well as to identify the telocytes associated with the NMJ. Forty-six male mice (WT = 23 and mdx = 23) aged 6 months were used. These were euthanized, and the tongue and gastrocnemius muscle were collected. These samples were subjected to light microscopy techniques for structural analysis using hematoxylin and eosin and picrosirius red staining; immunofluorescence using the primary antibodies α-Bungarotoxin (post-synaptic region), Bassoon (presynaptic region), S-100-β (perisynaptic Schwann cells), CD34 (telocytes), and PAX7 (satellite cells) for molecular identification; transmission electron microscopy for ultrastructural characterization; and western blot for protein quantification of dystrophin, S-100-β, CD34, PAX7, TGF-β, and PDGFR-α. Significant alterations were found in the animal masses and gastrocnemius muscle. Under light microscopy analysis, a degenerative process was revealed in the gastrocnemius muscle. The gastrocnemius muscle showed tissue fibrosis and increased collagen deposition, as well as a peripheral location of the fiber nuclei in healthy animals. In the tongue, light microscopy revealed areas of fibrosis in the muscle tissue, alterations in epithelial thickness and lamina propria, while the glandular area showed stability between groups. Immunofluorescence revealed alterations in the neuromuscular junctions (NMJs); for the gastrocnemius muscle, there were changes in the stained and total perimeter, as well as in the dispersion of the pre- and post-synaptic regions. The tongue was divided into rostral and caudal sections, characterized by the heterogeneity of the regions, showing a significant increase in the stained and total perimeter in the pre-synaptic region of the caudal section, and a decrease in the total and stained area of the post-synaptic region of both tongue regions. Associated with NMJs, perisynaptic Schwann cells were identified, partially covering the post-synaptic region in the gastrocnemius muscle. The gastrocnemius muscle was found in both groups, and entirely in the tongue only in the WT group. Telocytes were identified covering the postsynaptic region in both tissues analyzed for the WT group, while for the mdx group they showed partial coverage. There was an increase in the number of nuclei under the postsynaptic region in the mdx group for the gastrocnemius muscle, while the tongue was characterized by stability in quantity between the groups. Under the ultrastructural characterization, we revealed misalignment of sarcomeres, deposition of intramuscular connective tissue, and nuclei centralized in the fibers in the gastrocnemius muscle, while the tongue showed muscular alterations with telocytes in the vicinity of muscle and nerve fibers, and characterization of the lingual mucosa with the epithelial layers evidenced and the lamina propria with telocytes organized close to the basal layer of the epithelium. Molecular characterization revealed an absence of dystrophin in the mdx samples, and alterations between tongue regions, most notably a decrease in the concentration of CD34 and PAX7 proteins in the mdx group in the rostral region of the tongue. We conclude that the NMJ presents telocytes as a cellular element in its composition, and the pre- and post-synaptic regions show alterations due to muscular dystrophy, both in the gastrocnemius muscle and in the tongue. Modifications in the muscular characteristics of the analyzed tissues were also evidenced, which was expected for the gastrocnemius muscle.