Efeito da Tanshinona-IIa-sulfonato, um inibidor ectostérico da catepsina k, na osteoclastogênese induzida por LPS

Abstract

A Tanshinona-IIa-sulfonato (T06) é um derivado da Tanshinona IIA, substância natural da Salvia miltiorrhiza (Danshen), uma erva utilizada na Medicina Tradicional Chinesa. Essa classe de compostos emergiu recentemente como fármacos promissores na redução do fenótipo osteoporótico. Tais compostos são capazes de inibir especificamente a atividade colagenolítica da Catepsina K, enzima lisossomal secretada pelos osteoclastos que participa da degradação da fase orgânica da matriz óssea, sem interferir na osteoclastogênese induzida por RANKL. Entretanto, ainda não foi investigado o efeito da T06 sobre a diferenciação e atividade de osteoclastos induzidos por lipopolissacarídeo (LPS). O objetivo do presente trabalho foi investigar o efeito da T06 sobre a osteoclastogênese induzida por LPS in vitro. Para isso, macrófagos foram obtidos de medula óssea (BMMs) de camundongos e a viabilidade avaliada após exposição à variadas concentrações de tanshinona [0,25-5μM], utilizando o ensaio de redução do MTT. As células foram estimuladas à diferenciação com MCSF, RANKL e/ou LPS na presença ou ausência de T06 por 4 dias, em placa de 96 poços. Sobre discos de osso, BMMs foram primadas com RANKL e estimuladas com LPS na presença ou ausência de T06 [1μM]. As células foram fotogradas em microscopia de campo claro, para contagem de células TRAP+, e de fluorescência, para visualização dos anéis de actina. O sobrenadante da cultura foi coletado para quantificação de citocinas inflamatórias. Os resultados desse trabalho mostraram que T06 modulou positivamente a osteoclastogênese induzida por LPS em placas de cultura, sendo esse resultado estatisticamente relevante (p<0,05) nas concentrações [2,5 e 0,5μM]. Osteclastos induzidos por LPS e tratados com T06 apresentaram anéis de actina normais. Em discos de osso, o tratamento com T06 [1μM] aumentou significativamente a quantidade de células multinucleadas TRAP+. A indução da osteoclastogênese com LPS aumentou os níveis de citocinas inflamatórias (TNF, IL-6 e MCP-1), enquanto o tratamento com T06 não interferiu nesse mecanismo.

Tanshinone IIa sulfonic sodium (T06) is a derivative of Tanshinone IIA, a natural substance from Salvia miltiorrhiza (Danshen), an herb used in traditional Chinese Medicine. This class of compounds has recently emerged as promising drugs in reducing the osteoporotic phenotype. Such compounds are able to specifically inhibit the collagenolytic activity of Cathepsin K, a lysozyme secreted by osteoclasts that participates in the degradation of the organic phase of the bone matrix, without interfering with RANKL-induced osteoclastogenesis. However, the effect of T06 on lipopolysaccharide (LPS)-induced osteoclast differentiation and activity has not yet been investigated. The aim of the present study was to investigate the effect of T06 on LPS-induced osteoclastogenesis in vitro. To this end, bone marrow macrophages (BMMs) were obtained from mice and viability assessed after exposure to varying concentrations of tanshinone [0.25-5μM] using the MTT reduction assay. Cells were stimulated to differentiation with MCSF, RANKL and/or LPS in the presence or absence of T06 for 4 days in a 96-well plate. On bone discs, BMMs were primed with RANKL and stimulated with LPS in the presence or absence of T06 [1μM]. Cells were photographed in brightfield microscopy, for counting TRAP+ cells, and fluorescence microscopy, for visualization of actin rings. The culture supernatant was collected for quantification of inflammatory cytokines. The results of this work showed that T06 positively modulated LPS-induced osteoclastogenesis in culture plates, and this result was statistically relevant (p<0.05) at concentrations [2.5 and 0.5μM]. Osteclasts induced by LPS and treated with T06 showed normal actin rings. In bone discs, treatment with T06 [1μM] significantly increased the amount of TRAP+ multinucleated cells. Induction of osteoclastogenesis with LPS increased the levels of inflammatory cytokines (TNF, IL-6 and MCP-1), while treatment with T06 did not interfere with this mechanism.