Engenharia metabólica aplicada à elucidação de etapas adicionais da via biossintética de triterpenos quinonametídeos de Monteverdia ilicifolia por expressão heteróloga de enzimas da família citocromo P450 nos sistemas Nicotiana benthamiana e Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Triterpenos quinonametídeos (TQMs) constituem uma classe de compostos de especial interesse devido à sua potente atividade antitumoral. Esses metabólitos são marcadores químicos de plantas da família Celastraceae, da qual faz parte a espécie Monteverdia ilicifolia (Mart. Ex Reissek) Biral, pertencente à biodiversidade brasileira. O acúmulo muito reduzido de TQMs nas raízes dessa espécie aliado à sua complexidade química (que dificulta o desenvolvimento de rotas de síntese eficientes) e o conhecimento ainda parcial das etapas da sua via biossintética em M. ilicifolia motivou a integração de ferramentas da engenharia metabólica e da biologia sintética para a reconstituição de etapas da sua biossíntese nos sistemas heterólogos Nicotiana benthamiana e Saccharomyces cerevisiae. A análise transcriptômica, associada ao nível de expressão de genes nas raízes, orientou previamente a clonagem das sequências codificadoras de nove enzimas da família citocromo P450 em vetores de expressão em S. cerevisiae, sistema no qual elas foram caracterizadas funcionalmente. Paralelamente, as sequências de sete dessas nove enzimas foram clonadas e caracterizadas em N. benthamiana. Em ambos os sistemas heterólogos, quatro enzimas apresentaram atividade catalítica e produziram intermediários biossintéticos dos TQMs, identificados como ácido wilfórico C, ácido salaspérmico e ácido 24-carboxi-polpunônico. O ácido wilfórico C foi produzido em larga escala tanto em S. cerevisiae quanto em N. benthamiana, enquanto o ácido salaspérmico e o ácido 24-carboxi-polpunônico foram produzidos em larga escala apenas em N.benthamiana. A análise cromatográfica das raízes permitiu, pela primeira vez, a anotação desses mesmos compostos na planta nativa produtora. Esse resultado sugere que esses compostos não sejam apenas artefatos produzidos nos sistemas heterólogos, mas possam estar efetivamente envolvidos na via biossintética dos TQMs. Assim, os resultados obtidos fornecem uma base para a futura identificação de etapas oxidativas subsequentes envolvidas nessa biossíntese, contribuindo para viabilizar a futura produção biotecnológica em larga escala dos TQMs para sua aplicação farmacológica.