Publicação: Reconstrução em Escherichia coli de alelos identificados por evolução adaptativa em sacarose usando o sistema EasyGuide CRISPR
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Data
Autores
Orientador
Gross, Jeferson 
Coorientador
Contiero, Jonas
Pós-graduação
Bioenergia - IPBEN
Curso de graduação
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Tese de doutorado
Direito de acesso
Acesso restrito
Resumo
Resumo (português)
A evolução adaptativa em laboratório é uma poderosa ferramenta para o desenvolvimento de cepas de microrganismos que tenham capacidade de crescimento superior em fontes de carbono não tradicionais, de baixo custo e renováveis. Entretanto, para utilizar as informações obtidas, é necessário selecionar, reconstruir e testar as mutações encontradas durante a evolução na cepa progenitora, um processo conhecido como engenharia reversa. Para a reconstrução desses alelos mutados é imprescindível o uso de técnicas de modificação genômica de fácil execução e baixo custo. Nesse trabalho foram desenvolvidas técnicas de edição genômica usando CRISPR/Cas9 para serem realizadas para a reconstrução e teste de mutações observadas em experimento de evolução realizada em sacarose com populações de Escherichia coli. Nesse experimento, três populações de E. coli DH5α contendo o plasmídeo pCscBKA para consumo de sacarose e quatro populações de E. coli E2348/69 foram cultivadas através de passagens sucessivas em meio mínimo contendo sacarose como única fonte de carbono, ao longo de 637 a 690 gerações. Ao final do processo, o DNA genômico das populações finais foi sequenciado e mutações encontradas foram selecionadas para reconstrução. Para a construção dessas linhagens mutadas foram desenvolvidos sistemas para clonagem de gRNAs e montagem de donors que foram chamados EasyGuide. Nesse contexto, foram projetados cinco plasmídeos base para as diferentes estratégias de clonagem de gRNAs. Para a produção de donors foi empregado um sistema para a montagem de fragmentos de DNA in vivo em Saccharomyces cereviseae. Outra inovação implementada foi a utilização de oligonucleotídeos para montagem de gRNAs e donors para deleções e modificações de nucleotídeos únicos (abordagem EasyOligo). Com as técnicas desenvolvidas foi possível construir linhagens para testar mutações individuais e introduzir diferentes construções gênicas voltadas para o consumo de sacarose. Entre as mutações identificadas nas populações, a integração do operon cscBKA e a deleção do cluster formador do flagelo foram responsáveis pelos maiores ganhos de fitness (30-35% e 5%, respectivamente), medidos por ensaios de competição. Outra mutação que chamou a atenção foi a deleção de 81 pb no gene pcnB, associada a redução de número de cópias do plasmídeo pCscBKA e consequente aumento de fitness propagativo. Para demonstrar a capacidade do sistema EasyGuide CRISPR foram integrados ao genoma da DH5α os operons cscBKA (consumo de sacarose) e phaCAB, para produção de polihidroxibutirato (PHB) a partir da sacarose. Com essas integrações, foi possível produzir ~31% massa celular seca de PHB a partir de 20 g/L sacarose.
Resumo (inglês)
Adaptive evolution is a powerful tool for developing strains of microorganisms that have superior growth capacity on non-traditional, low-cost, and renewable carbon sources. However, to make use of the obtained information, it is necessary to select, reconstruct, and test the mutations found during evolution in the progenitor strain, a process called reverse engineering. To reconstruct these mutated alleles, it is necessary to use easy-to-perform and low-cost genomic modification techniques. Genomic modification techniques using CRISPR/Cas9 were developed in this work for the reconstruction and testing of mutations obtained in an evolution experiment carried out in sucrose with Escherichia coli. In this experiment, three populations of E. coli DH5α, carrying the plasmid pCscBKA for sucrose consumption, and four populations of E. coli E2348/69 were cultivated through successive passages in minimal medium containing sucrose as the sole carbon source for 637-690 generations. At the end of the process, the genomic DNA of the final populations was sequenced, and mutations found were selected for reconstruction. To obtain these mutated strains, gRNA cloning systems and donor assembly systems called EasyGuide were developed. Five base plasmids were developed for different gRNA cloning strategies. To produce donors, a system was used for the assembly of DNA fragments in vivo in Saccharomyces cereviseae. Another advance was the use of oligonucleotides for the assembly of gRNAs and donors for deletions and modifications of single nucleotides (The EasyOligo approach). With these developed techniques, it was possible to construct strains for testing individual mutations and different genetic constructs for sucrose consumption. Among the mutations found in the populations, the integration of the cscBKA operon and the deletion of the flagellum assembly cluster were responsible for the highest fitness obtained (30-35% and 5%, respectively), measured by competition assays. Another mutation that attracted attention was the 81 bp deletion in the pcnB gene, which is associated to a reduction in the plasmid pCscBKA copy numbers and an increase in growth fitness. To demonstrate the capacity of the EasyGuide system, the cscBKA (sucrose consumption) and phaCAB operons were integrated into the genome of DH5α cells to produce polyhydroxybutyrate (PHB) from sucrose. These integrations made it possible to produce ~31% of dry cell weight of PHB.
Descrição
Palavras-chave
CRISPR/Cas9, Evolução adaptativa em laboratório, Escherichia coli, Sacarose, Engenharia metabólica, Adaptive laboratory evolution, Metabolic engineering, Sucrose, Operon cscBKA
Idioma
Português
