Análise comparativa da afinidade de hidroperóxidos lipídicos de relevância biológica pela peroxirredoxina 2 de humanos e sua suscetibilidade à hiperoxidação através de abordagens bioquímicas e docking molecular

Abstract

Com aumento da expectativa de vida da população humana, também ocorre o aumento de doenças associadas a idade como as neurodegenerativas, cardiovasculares, neoplasias, dentre outras, e cresce também a necessidade de novas terapias. Oxidantes e radicais livres estão relacionados a diversas doenças e uma possibilidade de tratamento é a modulação dos níveis dessas moléculas na célula, aumentando ou diminuindo o estresse oxidativo, para fins de proteção ou diminuição da viabilidade celular respectivamente. Para lidar com o estresse oxidativo a célula dispõe de enzimas antioxidantes, dentre elas as peroxirredoxinas (Prx), enzimas capazes de decompor hidroperóxidos (Hpx). As Prx possuem diversas isoformas entre os organismos, em humanos, a isoforma Prx2 aparenta ter um papel de extrema importância em razão de sua alta abundância em determinados tipos celulares (e.g. é a terceira enzima mais expressa em eritrócitos) e alta reatividade sobre hidroperóxidos (k = 10^7-8 M-1 s-1). Por outro lado, também já foi observada sua superexpressão em tecidos tumorais, indicando um papel protetor realizado pela Prx2 contra o estresse oxidativo em células neoplásicas, o que permite a progressão de tumores. A HsPrx2 pertence à classe das 2-Cys Prx típicas, e estruturalmente são homodímeros obrigatórios que realizam a decomposição de seus substratos (hidroperóxidos) através de uma cisteína reativa denominada cisteína peroxidásica (CP). Após a decomposição é formado ácido sulfênico (CP-SOH) que condensa com uma cisteína adicional localizada no monômero complementar, formando um dissulfeto intermolecular. Sob altas concentrações de Hpx, dois ou três substratos são decompostos rapidamente pela enzima, formando cisteína ácido sulfínico (CP-SO2H) ou sulfônico (CP-SO3H), levando à perda de atividade peroxidásica da HsPrx2. Já foram descritos como substratos desta enzima moléculas inorgânicas como o peróxido de hidrogênio (H2O2) e peroxinitrito (NOOH); bem como peróxidos sintéticos, como hidroperóxidos de cumeno (CHP) e tert-butil (t-BOOH), contudo ainda não foram avaliados hidroperóxidos orgânicos biológicos, como os de lipídeos, considerados de extrema relevância por participarem de vias de sinalização de processos inflamatórios, coagulação, hipertensão dentre outros. Neste contexto, uma alta afinidade por peróxidos orgânicos biológicos pode facilitar a hiperoxidação de HsPrx2 mesmo em baixas concentrações, tornando estes hidroperóxidos possíveis inibidores biológicos da enzima. Neste trabalho, inicialmente, efetuamos um levantamento da literatura de quais seriam os substratos biológicos mais importantes para HsPrx2. Foram efetuadas simulações computacionais de acoplamento (docking) molecular que indicaram que Hpx derivados de lipídeos de cadeia longa poderiam ser substratos com alta afinidade para HsPrx2 uma vez que os resultados revelaram, dentre outros fatores, grande proximidade de sua função peróxido ao S do resíduo catalítico de Prx2 (~ 3 Å) bem como uma baixa energia livre de Gibbs (-4.8 e -6.1 cal/mol). Para avaliar bioquimicamente os Hpx derivados de lipídeos como substratos de Prx2, expressamos e purificamos a enzima recombinante de humanos em conjunto com o sistema redutor de leveduras (ScTrx e ScTrxR1). Por meio do ensaio de oxidação do NADPH determinamos de forma comparativa as constantes cinéticas utilizando H2O2, CHP, Hpx de ácido oleico (Ol-OOH) e linoleico (Li-OOH e Li-OOH(2)) muito abundantes em células eucarióticas. O KM foi determinado como 10^4 – 89 M-1 para H2O2 e CHP e variou de 16 – 23 M-1 para Hpx de lipídeos, indicando que para a saturação enzimática são necessárias menores concentrações de Hpx de lipídeos. O KCat para as moléculas lipídicas foi sensivelmente menor (0,03 – 0,05 s-1) em comparação com H2O2 e CHP (0,3 – 0,6 s-1), o que pode estar relacionado a um grupo de saída mais volumoso. Por meio de ensaios de fluorescência intrínseca determinamos as constantes de oxidação da HsPrx2, como 10^8-7 para CHP e Hpx de ácido oleico. Em conjunto, nossos resultados revelam pela primeira vez que os hidroperóxidos de lipídeos podem não só ser substratos de peroxirredoxinas humanas, como também possuem maior afinidade pela enzima que H2O2 e CHP, amplamente estudados.

With the increase in life expectancy of the human population, there is also an increase in age-related diseases such as neurodegenerative, cardiovascular, neoplasms, among others, and the need for new therapies also grows. Oxidants and free radicals are related to several diseases and a possibility of treatment is the modulation of the levels of these molecules in the cell, increasing or decreasing oxidative stress, for purposes of protection or reduction of cell viability respectively. To deal with oxidative stress, the cell has antioxidant enzymes, including peroxiredoxins (Prx), enzymes capable of decomposing hydroperoxides (Hpx). Prx have several isoforms among organisms, in humans, the Prx2 isoform appears to play an extremely important role due to its high abundance in certain cell types (e.g. it is the third most expressed enzyme in erythrocytes) and high reactivity on hydroperoxides (k = 10^7-8 M-1 s-1). On the other hand, its overexpression has also been observed in tumor tissues, indicating a protective role played by Prx2 against oxidative stress in neoplastic cells, which allows tumor progression. HsPrx2 belongs to the class of typical 2-Cys Prx, and structurally they are obligatory homodimers that carry out the decomposition of their substrates (hydroperoxides) through a reactive cysteine called cysteine peroxidase (CP). After decomposition, sulfenic acid (CP-SOH) is formed, which condenses with an additional cysteine located in the complementary monomer, forming an intermolecular disulfide. Under high concentrations of Hpx, two or three substrates are rapidly decomposed by the enzyme, forming cysteine sulfinic acid (CP-SO2H) or sulphonic acid (CP-SO3H), leading to the loss of peroxidase activity of HsPrx2. Inorganic molecules such as hydrogen peroxide (H2O2) and peroxynitrite (NOOH) have already been described as substrates for this enzyme; as well as synthetic peroxides, such as cumene hydroperoxides (CHP) and tert-butyl (t-BOOH), however biological organic hydroperoxides, such as those of lipids, considered extremely relevant for participating in signaling pathways of inflammatory processes, coagulation, hypertension, among others, have not yet been evaluated. In this context, a high affinity for biological organic peroxides can facilitate HsPrx2 hyperoxidation even at low concentrations, making these hydroperoxides possible biological inhibitors of the enzyme. In this work, initially, we carried out a literature survey of which would be the most important biological substrates for HsPrx2. Computational simulations of molecular coupling (docking) were carried out, which indicated that Hpx derived from long-chain lipids could be substrates with high affinity for HsPrx2, since the results revealed, among other factors, great proximity of its peroxide function to the S of the catalytic residue of Prx2 (~ 3 Å) as well as a low Gibbs free energy (-4.8 and -6.1 cal/mol). To biochemically evaluate lipid-derived Hpx as Prx2 substrates, we expressed and purified the recombinant human enzyme together with the yeast reductive system (ScTrx and ScTrxR1). By means of the NADPH oxidation assay, we comparatively determined the kinetic constants using H2O2, CHP, Hpx of oleic acid (Ol-OOH) and linoleic acid (Li-OOH and Li-OOH(2)) which are very abundant in eukaryotic cells. The KM was determined as 10^4 – 89 M-1 for H2O2 and CHP and ranged from 16 – 23 M-1 for lipid Hpx, indicating that lower concentrations of lipid Hpx are required for enzymatic saturation. The KCat for lipid molecules was appreciably lower (0.03 – 0.05 s-1) compared to H2O2 and CHP (0.3 – 0.6 s-1), which may be related to a leaving group bulkier. By means of intrinsic fluorescence assays we determined the oxidation constants of HsPrx2, such as 10^8-7 for CHP and Hpx for oleic acid. Taken together, our results reveal for the first time that lipid hydroperoxides may not only be substrates of human peroxiredoxins, but also have greater affinity for the enzyme than H2O2 and CHP, which have been widely studied.